Este trabalho foi financiado por doações do National Eye Institute R01EY017925 e R21EY020985 e financiamento das Fundações Dana &amp; Whitehall para PK Agradecemos também Mateus Petrella para a assistência com procedimentos cirúrgicos; Graça Dion para rastrear os dendritos mostrados na Figura 5A e Pratik Chhatbar para comentários sobre o manuscrito.

1. Preparação cirúrgico <ol><li> Induzir a anestesia e continuamente monitorar a freqüência cardíaca, acabam de CO 2 das marés, EEG, e temperatura. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso da Universidade Médica da Carolina do Sul e foram baseados naqueles que anteriormente publicado 9,15. </li><li> Expor a superfície dorsal do crânio através do corte na pele com uma lâmina de bisturi. Dissecar os tecidos conjuntivos que recobrem o osso usando uma cureta Brudon. Limpe o osso através de aplicadores de algodão e gaze de algodão ponta. Aplicar a cera óssea (quando necessário) ao crânio, para parar o sangramento ocasional através de pequenas veias emissário. </li><li> Anexar uma placa de titânio ou de aço inoxidável para a cabeça do crânio (sobre a região de interesse, onde a craniotomia será executada) usando cimento dental misturada com tinta preta (ver Materiais). Uma abertura rectangular no centro da placa frontal proporciona acesso para a craniotomia e imagiologia óptica. Anexar uma câmara metálica no topo da placa frontal. Esta câmara serve como um reservatório de fluido para geração de imagens com a lente objectiva de imersão em água. </li><li> Fixe a placa de cabeça para um estágio xy usando postes de metal. </li><li> Diluir uma grande área do osso dentro da abertura rectangular da headplate usando uma broca de dentista. A área a ser diluído deve estender-se para além dos limites da craniotomia planeada. A cabeça dura não roedora mamíferos devem ser diluídos, se imagens de alta resolução estão a ser adquiridos a partir do neocortex, porque no local da craniotomia, a espessura do osso vai ditar a espessura da lamela de agarose entre a superfície e neocortical (ver abaixo) . </li><li> Perfurar um 2 x 2 esboço mm quadrados no osso para a craniotomia. Enxaguar a câmara periodicamente com fresco fluido cerebrospinal artificial (ACSF), para remover fragmentos ósseos e minimizar a dissipação de calor ao córtex subjacente. Aplique cera de osso, conforme necessário, para parar o sangramento ocasional. </li><li> Lift do retalho ósseo com pinça # 3. </li><li> Remover todos, mas a camada inferior de duração usando uma pinça fina (# 5CO) e tesoura primavera Vannas. A dura-máter em mamíferos não roedora é espesso e opaco, mas pode ser removido em camadas distintas. A hemorragia é rara, mas pode ser interrompido com Gelfoam e qualquer resíduo de sangue deve ser cuidadosamente removido da camada restante de dura usando uma pinça e enxaguamento com ACSF. A camada final de dura é transparente e vasos Pial deve ser claramente visível através dele. Deixando esta camada final de dura intacta durante o exame sinal intrínseco irá aumentar a taxa de sucesso de carregamento a granel de indicadores de cálcio fluorescentes para a fase posterior de imagens de dois fótons do experimento (ver discussão). </li><li> Aplique uma gota de agarose morna 2% (dissolvido em ACSF) e coloque imediatamente uma lamela sobre a craniotomia. Verifique a craniotomia para assegurar que as pulsações respiratórias e cardiovasculares são mínimos, utilizando um microscópio de dissecção cirúrgica ou as oculares do dois-fóton em microscópio de campo claro modo. </li></ol> 2. Intrínseca sinal óptico de imagem <ol><li> Adicionar gel de espuma embebidas com ACSF em torno do exterior da lamela para evitar a secagem de agarose durante o exame do sinal intrínseco. </li><li> Anexar o intrínseco sinal de imagem da câmara CCD para a porta de montagem C padrão em cima do microscópio de dois fotões (Figura 1). Coloque a fonte de luz de iluminação sobre a mesa de ar perto do palco xy (Figura 1A). Posição e manter as guias de luz sobre a craniotomia e headplate / câmara (Figura 1B). Retrair o dicróico primário e do espelho inferior da porta C-montagem de modo que a luz reflectida vermelho necessário para sinais intrínsecos irá passar directamente a partir da craniotomia para a câmara CCD (Figura 1C-D). Usando o objectivo ar 4x (0,13 NA, 17 mm DI), um campo de 2 x 2 mm de exibição está disponível para a imagem do sinal intrínseco. </li><li> Inserir um filtro de calor na light caminho para evitar que a partir de córtex de aquecimento. Use um filtro que passa luz verde (546 nm centro λ) e gravar uma imagem de referência digital dos vasos sanguíneos superficiais corticais. </li><li> Mover o foco para z 500 mm abaixo da superfície cortical. Usar um filtro vermelho (630 nm centro λ) para iluminar o córtex para medir sinais intrínsecos. Posicionar as guias de luz de tal forma que a superfície cortical é uniformemente iluminado. Proteger a craniotomia da luz produzida pelo mostrador estímulo visual. Apresentar uma seqüência de estímulos visuais e gravar imagens de dados de refletância. Para gerar um mapa de orientação dentro de 10 min, coletar dados correspondentes a quatro repetições de uma sequência de oito estímulos (4 orientações e duas indicações para cada orientação). </li><li> Analisar os dados de sinal intrínsecas para gerar um mapa de orientação falsa cor. Selecione regiões-alvo em potencial para dois fótons de rotulagem de neurônios, por exemplo, as singularidades de orientação pinwheel - pontos no mapa ondetodas as orientações preferidas convergem (Figura 2A). Sobrepor a orientação do mapa e a imagem da vasculatura superfície cortical (Figura 2B-C). Use o esquema de domínios funcionais e localização de embarcações de grande superfície para selecionar um alvo, evitando locais com grandes vasos sanguíneos e arteríolas 15. </li></ol> 3. Carregando em massa de Indicadores de cálcio fluorescentes <ol><li> Prepara-se uma solução de 20% de Pluronic / DMSO, adicionando 1 g de Pluronic em 5 ul de DMSO. Aquecer a mistura a 60 ° C durante 10 minutos para dissolver completamente o Pluronic. Deixar a mistura arrefecer até à temperatura ambiente. Adicionar 4 ul da mistura de Pluronic / DMSO para um frasco de 50 ug do indicador de cálcio fluorescente verde Oregon 488 BAPTA-1 AM (OGB-1 AM). Em seguida, adicionar 1 ml de um corante vermelho (Alexa Fluor 594, 2 mM de solução stock) e 35 uL de solução de pipeta (ver Materiais) para uma concentração final de 1 mM OGB-1 AM. Sonicate a solução para ½ h emum banho de água gelada e em seguida, centrifuga com um filtro de 0,45 um para remover as impurezas. </li><li> Puxar uma pipeta de conicidade de comprimento com um diâmetro exterior da ponta de 2,0-2,5 | im. Carregar 5 uL da mistura de corantes para a pipeta. </li><li> Remover a camada final de dura-máter para facilitar a inserção de uma pipeta e obter a melhor qualidade de imagens de dois fotões. </li><li> Determinar a localização exacta da superfície cortical que a pipeta tem de ser colocado de modo a atingir o seu alvo na camada cortical 2/3. O nosso alvo predeterminado cortical é uma singularidade pinwheel na orientação do mapa (Figura 2). A pipeta tem de ser conduzido para o córtex no ângulo de 30 º para passar entre a parede da câmara e do objectivo. Assim, para identificar a região de destino 200 um abaixo da superfície cortical, a posição de entrada da pipeta na superfície cortical será de aproximadamente 350 um lateralmente à posição do alvo (figura 3-B). </li><li> Mover a fase xy (em que o animal e o pmicromanipulador ipette são colocados) para centrar a posição de entrada da superfície cortical no âmbito do objectivo (Figura 3C). Utilize uma objectiva de 20x ou 40x, com uma distância de trabalho (DT) de pelo menos 3 mm (ver Materiais) para garantir que a pipeta irá entrar facilmente no córtex sem tocar o objectivo ou o osso ao longo da parede da craniotomia. Uma vez que a posição de entrada está centrado no âmbito do objectivo, aumentar a posição Z do objectivo de 2 mm (Figura 3D). Com a luz verde epi-fluorescência ligada a visualizar o corante vermelho Alexa na pipeta, use o eixo diagonal do micromanipulador para mover a pipeta até a sua ponta é centrado (concentrado e), sob a objectiva directamente acima da superfície cortical entrada ( Figura 3E). </li><li> Baixar a pipeta na vertical (ao longo do eixo z), até que a pipeta atinge a superfície cortical (Figura 3F), enquanto continuamente visualizar a ponta da pipeta com a oculars do microscópio. Usando brilhante-campo de iluminação, os vasos sanguíneos superficiais corticais e demais membranas das meninges (pia e aracnóide) são facilmente visíveis como a pipeta se aproxima da superfície cortical. Se a pipeta não atinge a posição de entrada desejado, aumentar a pipeta e recalibrar alvo com base nos pontos de referência vasculares na superfície cortical. </li><li> Retire o objetivo, pavio líquido cefalorraquidiano excesso da craniotomia e secar o osso adjacente usando lanças sem fiapos de absorção. Aplicar uma gota de quente de agarose a 3% (dissolvido em ACSF) para estabilizar o córtex que é visível através da craniotomia (Figura 3G). Em animais não roedores, agarose a 3% é necessário para amortecer pulsações para uma implantação bem sucedida de corantes fluorescentes pelos neurónios. Para imagiologia sinal óptico intrínseco somente 2% de agarose é necessária porque a combinação de agarose a 2% e a lamela fornece a estabilidade necessária. Aqui, não lamela é usado para o passo de corante de carregamento de modo agarose 3%necessário. Após a agarose solidificou, insira uma objetiva de 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) e re-encher a câmara com ACSF. </li><li> Mudar de campo brilhante para dois fótons de visualização e localizar a ponta da pipeta. Usando o eixo diagonal do micromanipulador, mover a pipeta até a sua ponta atinge a profundidade desejada, no córtex (Figura 3H). Puffs pressão ocasionais de ejeção da mistura de corante (a psi poucos, cada pulso de 0,1 seg) irá ajudar a evitar a ponta da pipeta de entupimento. Porque OGB-01:00 só se torna visível após entrar nas células, o corante vermelho Alexa é crítica para a visualização da ponta da pipeta dentro do córtex. </li><li> Antes de tentar carregar neurônios na camada cortical 2/3 com a dose completa do corante, re-centrar o objectivo da superfície cortical para confirmar a profundidade da ponta da pipeta e garantir que a ponta está no local de destino com base na disposição de vasos sanguíneos superficiais. Se a pipeta está na camada de 2/3, puffs pequenas da mistura de corantes deve iluminar oespaço extracelular e revelar um conjunto denso de corpos celulares circulares como sombras escuras. </li><li> Para carregar os corpos celulares neuronais em uma esfera de córtex 300-600 um de diâmetro, injectar a mistura de corantes para o espaço extracelular com 30-90 pulsos, cada pulso de 1,0 seg, 2-10 psi. Os impulsos de pressão não deve ser tão forte que o tecido se move. Após a injeção é completo, espere alguns minutos, retire a pipeta e objetiva. Aguarde 1 hora para permitir que a OGB-01:00 para ser totalmente absorvido pelas neurônios. </li><li> Remover a agarose utilizada para a carga de corante e lavar a câmara de gravação. Coloque uma pequena gota de agarose de 2-3% na superfície e rapidamente colocar uma lamela sobre a craniotomia. Porque os corantes fluorescentes são sensíveis à luz, evitar uma exposição excessiva do córtex a brilhante-campo ou epi-fluorescente luz. Insira um alto NA (1,0) 20x objetivo no suporte objetivo e re-centro a região cortical rotulado sob o objetivo utilizar o estágio xy. Proteger a craniotomia de extraneous fontes de luz, por exemplo, exibição de estímulo visual, usando várias camadas de material de apagão. </li></ol> 4. De uma única célula de electroporação de corantes fluorescentes <ol><li> Para estudar a morfologia dendrítica, preparar uma solução de 100 uM de Alexa Fluor 594 (diluição 1:20 em ACSF de 2 mM estoque Alexa Fluor 594). Para imagiologia funcional de um sal de OGB dendrites podem ser utilizados 16,17. </li><li> Puxar uma pipeta de cone longo com um bico de 1 fim e carregar 5 ul de corante para a pipeta. Todos os outros passos de direccionamento um domínio funcional é idêntico ao método de carregamento a granel (Figuras 1-3). Para posicionar a ponta da pipeta adjacente a uma membrana neuronal de células do corpo, monitorizar o aumento da impedância do eléctrodo e aplicar pressão baforadas de corante para iluminar o espaço extracelular e ver corpos celulares como sombras durante dois fótons de imagem. </li><li> Quando a ponta da pipeta é adjacente a uma membrana de célula neuronal corpo, use o 800A Axoporator aplicarPulsos 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms de pulso). O preenchimento imediato do neurônio com corante é facilmente visualizado com dois fótons de microscopia. Remova a pipeta e recolher imagens de alta resolução de dendrites e axónios in vivo. </li></ol>

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	<li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex.">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li><li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iso-orientation+domains+in+cat+visual+cortex+are+arranged+in+pinwheel-like+patterns.">Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns.</a> Nature. 353, 429-431 (1991).</li><li>Ohki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+ordered+arrangement+of+single+neurons+in+orientation+pinwheels.">Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels.</a> Nature. 442, 925-928 (2006).</li><li>Shmuel, A., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+for+direction+of+motion+and+its+relationship+to+orientation+maps+in+cat+area+18.">Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18.</a> J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li><li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex.">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li><li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity.">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li><li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17/18+border+in+cat+visual+cortex.">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li><li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex.">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li><li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+Cortical+Column+Would+that+Be.">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).</li><li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex.">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li><li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging:+comparison+with+the+primary+visual+cortex.">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li><li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo.">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li><li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling.">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).</li><li>Nevian, T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+indicator+loading+of+neurons+using+single-cell+electroporation.">Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation.</a> Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).</li><li>Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex.">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li><li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons.">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li><li>Rochefort, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+direction+selectivity+in+mouse+cortical+neurons.">Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.</a> Neuron. 71, 425-432 (2011).</li><li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity.">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-972 (2007).</li><li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A., Toga, A. W., Mazziotta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+Based+on+Intrinsic+Signals.">Optical Imaging Based on Intrinsic Signals.</a> Brain mapping: The Methods. , 55-97 (1996).</li><li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo.">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li><li>Hofer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex.">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Apresentamos um método para alvejar a rotulagem de corpos celulares neuronais (ou dendritos e axônios) na pré-determinados funcionais micro-domínios do neocórtex. A fusão de imagem do sinal óptico intrínseco com dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar quais as sinapses e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional, quer correlaciona selectividade neuronal com a localização do neurónio em um mapa funcional e o circuito neuronal componentes que a mudança com uma ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. Suporte de vida / experiência prep </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Vet Webster </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Vaporizador isoflurano </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Comentários cobertor de aquecimento regulado </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de ECG </td><td> Digicare Biomédica </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador de EEG </td><td> Sistemas AM </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor EEG </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> Ao final da expiração de CO 2 do monitor </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Otimizar a ventilação </td></tr><tr><td> Rebarbas brocas de perfuração de metal duro para osso </td><td> Henry Schein </td><td> fina (0,5 ponta mm) e grossa (1,25 dica mm) </td><td></td></tr><tr><td> Cimento para headplate / câmara </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> Pó preto tinta têmpera </td><td> Sargent Arte Inc. </td><td> 22-7185 </td><td> Adicionar para cimentar a melhorar a luz blindagem e reduzir os reflexos </td></tr><tr><td> Agarose - Tipo III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Para minimizar pulsações durante sinal intrínseco e dois fótons de imagem </td></tr><tr><td> Lamela: 5 ou 8 mm de diâmetro, 0,17 mm de espessura </td><td> Precisão mundo emtrumentos </td><td> 502040, 502041 </td><td> Para minimizar pulsações durante o exame, a lamela pode ser cortado, conforme necessário </td></tr><tr><td> Curetas Brudon </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Limpeza da superfície do crânio </td></tr><tr><td> Cera de osso </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Rapidamente parar de sangrar </td></tr><tr><td> Algodão aplicador derrubado </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 72308-05 </td><td> Superfície do osso limpo e seco </td></tr><tr><td> Dumont # 5CO Fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11295-20 </td><td> Agarre camadas individuais de duração ou pia </td></tr><tr><td> Vannas Primavera Tesoura </td><td> Belas Science Tools </td><td> 15000-03 </td><td> Cut dura </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Para parar a hemorragia na dura </td></tr><tr><td> Lanças de absorção</td><td> Belas Science Tools </td><td> 18105-01 </td><td> Absorção ultra-rápida e sem fiapos da CSF </td></tr><tr><td> Material de apagão </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Escudo craniotomia </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Tingir preparação / injecção </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Verde Oregon 488 BAPTA-1 AM </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Indicador de cálcio </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Centrífugas filtro (tamanho de poro 0,45 um) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Para remover as impurezas, antes da injecção </td></tr><tr><td> Pipeta de vidro extrator </td><td> Sutter Instruments </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro borosilicato filamentado capilar (1,5 mm de diâmetro externo) </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 1B150F-4 </td><td> Pipeta de ejeção Dye </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Para o carregamento de tinta no pipeta </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP-285 </td><td> Para posicionar pipeta </td></tr><tr><td> Controlador de pressão de pulso </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Para a injecção de pressão do corante </td></tr><tr><td> Uma única célula electroporador </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Para a electroporação do corante </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. Intrínseca imaging </td></tr><tr><td> Objetivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olimpo </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> Intrínseca hardware / software </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> Software VDAQ é usado para geração de imagens episódica </td></tr><tr><td> Câmera CCD </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Fonte de alimentação da fonte luminosa </td><td> KEPCO </td><td> ATE 15-15M </td><td></td></tr><tr><td> Fonte de luz </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> HAL 100 </td><td> A intensidade da luz na superfície cortical é de 3-5 mW </td></tr><tr><td> Filtro verde (para a imagem vascular) </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> λ = 546 nm (banda de 30 nm) </td><td> Para imagem de referência da vasculatura superfície </td></tr><tr><td> Red filtro (por sinal intrínseco) </td><td> Óptico Imaging Inc. </td><td> λ = 630 nm (banda de 30 nm) </td><td> Para a coleta de sinais intrínsecos </td></tr><tr><td> Calor filtro </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. Dois fótons de plataforma / imagem </td></tr><tr><td> Microscópio de dois fotões e software </td><td> Prairie Technologies </td><td></td><td> Veja Shen et al. 2.012 para o caminho de luz, filtros e potência do laser </td></tr><tr><td> Ti: Safira a laser </td><td> Spectra Physics- </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0,5 NA; 3,5 milímetros WD) </td><td> Olimpo </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0,5 NA objectivo é apenas usado para alinhar pipeta sobre a craniotomia (não para duas imagens de fotões) </td></tr><tr><td> 20x (1,0 NA; 2,0 milímetros WD) </td><td> Olimpo </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0,8 NA; 3,3 milímetros WD) </td><td> Olimpo </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Mesa de ar </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Isola preparação de vibrações externas </td></tr><tr><td> fase xy </td><td> Máquina de Mike Co. (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Sujeito experimental e micromanipulador Sutter colocado no palco xy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Receitas </td></tr><tr><td> Líquido cefalorraquidiano artificial </td><td> NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl2 (1,0 mM), CaCl2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 </td></tr><tr><td> Adição da solução de 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted labeling of neurons in a specific functional micro-domain of the neocortex by combining intrinsic signal and two-photon imaging

No córtex visual primário de mamíferos não roedora, os neurônios são agrupados de acordo com sua preferência por características de estímulo, tais como orientação 1-4, direção de dominância, 5-7 ocular 8,9 e 9 disparidade binocular. Seletividade orientação é a característica mais amplamente estudada e um mapa contínuo com um layout quase-periódica para orientação preferencial está presente em toda a córtex visual primário 10,11. Integrando as contribuições sinápticas, celular e rede que levam a respostas de estímulo seletivos nestes mapas funcionais requer a hibridização de técnicas de imagem que abrangem sub-mícron de milímetro escalas espaciais. Com imagem do sinal óptico intrínseco convencional, o layout geral dos mapas funcionais por toda a superfície do córtex visual pode ser determinado 12. O desenvolvimento de microscopia in vivo de dois fotões usando corantes de cálcio sensíveis permite que se determine a SYNAPTentrada IC chegar espinhas dendríticas individuais 13 ou registro de atividade simultaneamente a partir de centenas de corpos individuais de células neuronais 6,14. Consequentemente, a combinação de imagem do sinal intrínseco, com a resolução espacial sub-micron de dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar exactamente quais os segmentos dendríticas e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional no neocórtex. Aqui demonstramos um método de alto rendimento para a rápida obtenção de um mapa de orientação cortical e visando um domínio específico de micro-neste mapa funcional para rotular neurônios com corantes fluorescentes em um mamífero não roedora. Com o mesmo microscópio usado para dois fótons de imagem, primeiro gerar um mapa de orientação usando imagens de sinal óptico intrínseco. Então, vamos mostrar como alvo um domínio de micro-de interesse usando uma micropipeta carregado com corante para qualquer rótulo de uma população de corpos celulares neuronais ou etiqueta de um único neurônio de tal forma que os dendritos e axônios, espinhas são visíveis novivo. Nossos refinamentos mais métodos anteriores facilitar um exame da neuronais relações estrutura-função com sub-celular resolução no âmbito da neocorticais arquitecturas funcionais.

Para ilustrar a precisão dos nossos métodos de marcação de corantes, que alvo menor do domínio de qualquer micro-mapa funcional conhecida no neocórtex não roedor. Esparsamente pontuado em todo o mapa de orientação do córtex visual primário são singularidades. Estes ocorrem nos pontos em que todas as orientações preferidas convergem de tal modo que, em mapas de cor falsas da orientação preferida, as regiões de todo o olhar como singularidade &quot;pinwheels&quot; (Figura 2A-B). Um cata-v...

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Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K visualizações.  Medical University of South Carolina. É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Em Imaging vivo do Cordão do rato Spinal Usando Two-photon Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Neurociência

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Detecção de hipóxia microrregional no Cortex Cerebral mouse por imagem de dois fótons de fluorescência endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Dois fótons de imagem da Cellular Dynamics na Medula Espinhal Rato

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablação de uma população Neuronal, usando um Laser de dois fotões e sua avaliação usando imagens de cálcio e gravação comportamental em larvas de Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.