Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na neurociência, especialmente aquelas relacionadas à formação de soquetes de neurônios. A principal vantagem dessa técnica é que os pesquisadores podem analisar as alterações morfológicas dos neurônios individuais em camundongos neonatais vivos. Comece com um filhote anesthetizado pós-natal 5 e prossiga apenas na ausência de uma reação ao teste de pinça de cauda.
Primeiro, esterilize o couro cabeludo limpando-o com 70% de etanol. Em seguida, use uma tesoura esterilizada com 70% de etanol para remover aproximadamente 20 milímetros quadrados da pele que cobre o crânio. Em seguida, use fórceps estéreis e um cotonete limpo encharcado em tampão de córtex, para remover a fáscia do crânio.
Use uma ponta de carregamento para aplicar adesivo de tecido na superfície da pele incisiva para parar o sangramento, evitando que a área seja imageada. Coloque o filhote em outra almofada de aquecimento, fixada em 37 graus Celsius, e permita que ele se recupere da anestesia. Aguarde aproximadamente 30 minutos até que o adesivo de tecido tenha secado e solidificado.
Uma vez que o adesivo de tecido tenha secado, comece a preparação da janela craniana no rato re-anestesiado. Aplique uma gota de tampão de córtex no crânio, em seguida, use uma lâmina de barbear estéril para abrir cuidadosamente uma área de um milímetro de diâmetro do crânio, deixando a dura-dura intacta. Aplique tampão de córtex para manter a superfície cerebral úmida.
Use um pequeno pedaço de esponja de gelatina embebida em tampão de córtex para parar qualquer sangramento. Use uma peça fresca para comprimir um lado da craniotomia e drenar qualquer tampão e sangue da superfície dural sem tocar na dura. Este é o passo mais crítico para preparar a janela clara.
A dura dura deve ser intacta e a escova deve ser removida da dura exposta. Em seguida, use uma ponta de pipeta para aplicar uma camada fina de 1% de baixa agarose de fusão, dissolvida em tampão de córtex. Aplique uma tampa redonda de vidro de três milímetros na camada de gel de agarose.
Remova todas as bolhas entre o deslizamento da tampa e a camada de gel de agarose derramando em excesso de gel de agarose entre elas. Use pinças para remover o excesso de gel, salientes sob o deslizamento da tampa. Misture o pó de cimento e o líquido de cimento.
Use uma ponta de pipeta para aplicar a mistura no crânio antes que se solidifique. Em seguida, conecte uma barra de titânio feita sob medida ao osso craniano usando cimento dental. Alinhe a barra de titânio e a tampa deslize paralelamente às imagens de captura fácil.
Cubra o crânio exposto com cimento dental. Então, subcutâneamente injete um analgésico. Coloque o filhote em uma gaiola de recuperação em uma almofada de calor de 37 graus celsius por uma hora até que o cimento dentário se solidifique.
Para começar a imagem, primeiro defina o comprimento de onda laser de dois fótons. Para excitação RFP, use um comprimento de onda de 1000 nanômetros. Limpe a superfície da tampa com 70% de etanol.
Conecte o filhote anestesiado à placa de titânio no estágio de imagem, usando a barra de titânio. Use o estágio goniômetro, para ajustar a cabeça, de modo que o deslizamento da tampa seja paralelo à lente objetiva. Mantenha a temperatura corporal do filhote durante a imagem usando uma almofada de aquecimento fixada em 37 graus Celsius e reduza a concentração de isoflurane para 0,7% a 1%Coloque o estágio de imagem sob a lente objetiva de 20x do microscópio de dois fótons.
Aplique uma gota de água no deslizamento da tampa. Defina o software para adquirir imagens de pilha Z em intervalos de 1,4 mícrons. Para a imagem de neurônio de camada quatro, ajuste a largura Z entre 150 e 300 mícrons para imaginar toda a morfologia dendrítica.
Use varredura lenta e média para obter imagens claras mostrando a morfologia neuronal. Normalmente leva mais de 20 minutos para adquirir toda a morfologia dendrítica. Esta imagem mostra uma imagem representativa da pilha Z da camada quatro neurônios corticais do filhote P5.
A seta indica que o neurônio deve ser analisado. Neurônios com dendritos borrados devem ser removidos da análise. Esta imagem mostra uma imagem de ampliação mais elevada do neurônio indicado na imagem anterior.
Pontas de flecha azul indicam pontas dendríticas que serão retraídas no próximo ponto, e as pequenas pontas de flecha branca indicam o axônio de uma célula vizinha. Após 4,5 horas, as pontas dendríticas com pontas de flecha azul são retraídas, e as pontas dendríticas com pontas de flecha amarelas são alongadas. Uma reconstrução representativa da morfologia dendrítica é mostrada aqui, neurônios mostrando dendritos desconectados como visto aqui, devem ser excluídos das análises.
Ao tentar este procedimento, é importante manter a dura-dura intacta, durante o processo. Por meio desse procedimento, outros métodos como a imagem de propulsão podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas ao padrão de atividade do neurônio no cérebro neonatal.
