Este projeto foi financiado pelo NIH (R21EB013717) e OVCR IUPUI (RSFG). O autor agradece a Sra. Han Shih por sua assistência técnica.

A. Macrómero e Peptide Synthesis <ol><li> Sintetizar quatro braço-PEG-norborneno (PEG4NB) e arylphosphanate fotoiniciador lítio (LAP), usando protocolos estabelecidos 18,19. </li><li> Sintetizar bis-cisteína contendo quimotripsina sensível peptídeo CGGY ↓ C (seta indica quimotripsina local de clivagem) utilizando padrão de síntese de péptidos em fase sólida num sintetizador de péptidos de microondas (CEM Discover SPS). <ol class="lalpha"><li> Calcula-se a quantidade de resina (Rink amida-resina MBHA) necessário com base na relação de substituição da resina e a escala de síntese. Inchar a resina no seio de dimetilformamida (DMF) num recipiente de reacção (RV), durante 15 min. </li><li> Remover grupo protector Fmoc a partir da resina utilizando uma solução de desprotecção, contendo 20% de piperidina e 0,1 M de HOBt em DMF. Use os parâmetros listados na tabela abaixo para o forno de microondas, Fmoc-desprotecção (para todos os ácidos Fmoc-amino): <table border="1"><tbody><tr><td> Escala de síntese </strong&gt; </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmole </td></tr><tr><td> Poder </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> Temperatura </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> Tempo </td><td> 3 min </td><td> 3 min </td></tr></tbody></table></li><li> Após desprotecção, lavar a resina com DMF e executar o teste de ninhidrina para confirmar a remoção do Fmoc (exposição de amina N-terminal). Resina deve ficar azul após 2 min a 95 ° C. </li><li> Após a desprotecção bem sucedida par, o Fmoc-aminoácido primeiro no terminal-C (síntese decorre de C-para N-terminal) de uma solução de base de activador (0,28 M di-isopropiletilamina (DIEA) em DMF), com os parâmetros listados na tabela a seguir . <table border="1"><tbody><tr><td> Escala de síntese </td><td> 0,1 mmol </td><td> 0,2 mmole </td&gt; </tr><tr><td> Poder </td><td> 20 W </td><td> 50 W </td></tr><tr><td> * Temperatura </td><td> 75 ° C </td><td> 75 ° C </td></tr><tr><td> * Tempo </td><td> 5 min </td><td> 5 min </td></tr></tbody></table> * Para Cisto e Seu, use 50 ° C e 10 min para reduzir racemização. </li><li> Enxaguar a resina e executar o teste de ninidrina para qualitativamente confirmar a conclusão do acoplamento (desaparecimento da amina N-terminal). Resina deve ser claro depois de 5 min a 95 ° C. Repita o passo de acoplamento (A.2.d) se o teste de ninidrina retorna resultado positivo (cor azul). </li><li> Repetir a desprotecção (passo A.2.b) e de acoplamento (A.2.d passo) para aminoácidos adicionais na sequência termina com uma etapa de desprotecção final. </li><li> Escorra a RV, lavar a resina com 25 ml de diclorometano (DCM). Este passo é para enxaguar DMF, que é uma base e impede a clivagem do péptido. </li><li> Prepare cocktail de clivagem pela mistura de 250 mg de fenol em 4,75 ml de ácido trifluoroacético (TFA), 0,125 ml de triisopropilsilano (TIS) e 0,125 ml de DDQ 2 O. </li><li> Adicionar a solução de clivagem para a RV e decompor durante 30 minutos no micro-ondas sintetizador de péptidos (Power = 20 W; Temperatura = 38 ° C). </li><li> Recolher a solução de péptido em um tubo de centrífuga de 50 ml, utilizando tubagem de vácuo. </li><li> Peptídeo clivado precipitado em 40 ml de éter, o tubo de vórtice e centrifuga-se a 3000 rpm durante 5 min para recolher o péptido. </li><li> Escorra o sobrenadante e repetir A.2.k passo duas vezes. </li><li> Recolher e secar em vácuo de péptidos. </li><li> Purifica-se o péptido por HPLC e caracterizá-lo com a espectrometria de massa. </li></ol></li></ol> B. Preparação de Material e Esterilização <ol><li> Preparar solução a 20% em peso de PEG4NB em PBS, vórtice a mistura até que o macrómero dissolve-se completamente, e esterilizar a solução de macrómero a utilização de um filtro de seringa. Armazene a solução de esterilização a -20 ° C (preparar alíquotaspara armazenamento de longo prazo). </li><li> Preparar e esterilizar 2% em peso de foto-iniciador (LAP) solução em PBS. Armazene a solução de esterilização a temperatura ambiente, protegida da luz. </li><li> Dissolve-se o peptídeo (CGGYC) em PBS, a mistura de vórtice e seringa filtrar a solução para esterilização. Alíquota da solução de péptido e armazenar a -20 ° C até ser usado (evitar congelar-descongelar). </li><li> Determinar tiol (-SH), concentração na solução do péptido preparado usando o reagente de Ellman (seguir o protocolo do fabricante). Este passo irá dar uma concentração de péptido precisas (isto é, [SH] / 2) que é necessária para o cálculo da quantidade de péptido a ser utilizado em tiol-eno foto-clique reacções. </li><li> Preparar moldes de gelificação, cortando a porção superior fora de seringas de 1 ml estéreis descartáveis ​​usando uma lâmina de barbear (ponta aberta para a remoção do gel). Esterilizar os moldes de seringas em autoclave. </li><li> Com base na formulação de gel desejada (tiol para eno ratio = 1) e as concentrações de mate estoqueriais, calcular o volume necessário de polímero, agente de reticulação de péptidos, fotoiniciador, e soluções tampão requeridas. </li></ol> C. Preparação celular <ol><li> Equilibre meio de cultura celular (alta glucose DMEM contendo 10% de soro fetal de bovino; antibiótico-antimicótico com 100 U / penicilina ml, estreptomicina 100 ug / ml, 250 ng / ml de Fungizone, e 50 uM β-mercaptoetanol), Hank solução salina equilibrada ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + livre), e de Tripsina-EDTA a 37 ° C. </li><li> Remover frascos contendo MIN6 β células de incubadora de CO 2 e colocar as garrafas no câmara de fluxo laminar. </li><li> Aspirar os meios de cultura de células a partir dos balões e enxaguar a célula com HBSS. </li><li> Tripsinizar as células utilizando 3 ml de 2X (0,1%) Tripsina-EDTA e incubar os balões durante 4 min a 37 ° C e 5% CO 2. <ul><li> Nota: Use 2X solução de tripsina permite a dissociação completa do MIN6 β células em suspensão de célula única. </li></ul> &lt;/ Li&gt; <li> Após a incubação, os frascos toque na superfície do exaustor suavemente para separar completamente as células. Confirmar o desprendimento e dissociação das células, usando um microscópio. </li><li> Adicionar um volume igual de meio de cultura celular para neutralizar a tripsina. Misture bem a solução por pipetagem suave, em seguida, transferir a mistura para um tubo de centrífuga e canónico durante 5 min a 1000 rpm. </li><li> Aspirar o sobrenadante e gentilmente re-suspender as células em 4-5 ml de meio de cultura. </li><li> Determinar a densidade celular, utilizando 50% de tampão de azul de Trypan, em um hemocitómetro. </li></ol> D. Hidrogel de fabricação e encapsulamento celular <ol><li> Uma vez que as células estão prontas, mistura (com base numa razão de 1:1 a tiol eno) os volumes necessários de PEG4NB, CGGYC, LAP, a solução da célula e, em HBSS em um tubo de microcentrífuga. </li><li> Misture a solução suavemente com uma pipeta para se obter uma mistura homogénea e adicionar 25 uL da solução resultante para um molde de uma seringa. Expor a seringa à luz UV (365nm, 5 mW / cm 2) durante 2 min. </li><li> Fotopolimerização seguinte, géis mergulhar num meio com 24 cavidades da placa de cultura estéril contendo células e incubar os hidrogéis de 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Lave as células carregadas de hidrogéis em meio de cultura de células durante 30 minutos para lavar as células fracamente ligados e não-reticuladas macrómeros. Transferir o gel para um meio fresco. </li><li> Meios de cultura de células de actualização a cada 2 a 3 dias. </li></ol> E. Ensaio de viabilidade celular Morfologia da célula encapsulada pode ser observada usando microscopia de luz (uma vez que os hidrogeles são sintetizados transparente). A viabilidade celular pode ser visualizado e medido qualitativamente utilizando vivo / Dead coloração e quantitativamente utilizando o reagente AlamarBlue. E.1. Vivo / Morto coloração <ol><li> Descongele reagentes ao vivo / Dead coloração à temperatura ambiente. </li><li> Num tubo de canónica adicionar PBS de acordo com o número de amostras (n) a ser corado: <strong&gt; O volume total de PBS = n × 500 ul </li><li> Pipetar ul de 0,25 calceína AM e 2 ul de EthD-1 por 1 ml de PBS ao tubo contendo PBS canónica. Solução a vórtice para misturar os componentes. </li><li> Incubar células carregadas de hidrogéis à solução de coloração Live / Dead (0,5 ml / amostra) durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador orbital. </li><li> Utilizando uma pipeta de Pasteur, remover a solução de corante e lavar a amostra duas vezes com PBS. </li><li> Coloque em uma amostra de lamínula ou lâmina de vidro. Observe e células de imagem usando um microscópio confocal. </li></ol> E.2. AlamarBlue Ensaio <ol><li> Preparar 10 v / v% solução AlamarBlue em meio de cultura celular. </li><li> Remover hidrogéis da incubadora e aspirar a mídia para fora de cada bem, sem fazer qualquer contato com o hidrogel. </li><li> Incubar células carregadas de hidrogéis e um (controle negativo) bem vazio em 500 ul de solução a 10% AlamarBlue durante 16 horas. </li><li> Após a incubação, 200 uL de pipetada solução de AlamarBlue numa placa de 96 poços e fluorescência medida utilizando um leitor de microplacas (excitação: 560 nm, emissão: 590 nm). <ul><li> Maior actividade metabólica celular reduz o corante para conferir uma maior leitura de fluorescência. </li><li> Certifique-se de incluir pelo menos dois poços de 10% de solução Alamarblue como espaços em branco. Ao analisar os dados, subtrair o valor em branco média de fluorescência a partir da leitura de fluorescência das amostras. </li></ul></li></ol> F. Chymotrypsin Mediada Erosão Gel e Recuperação Spheroid <ol><li> Prepare 1 mg / ml de tripsina-livre solução α-quimotripsina em HBBS e estéril da solução no filtro. </li><li> Incubar hidrogéis à solução quimotripsina (500 uL para cada gel) à temperatura ambiente com agitação suave até que a erosão gel completa seja alcançada. <ul><li> Para um gel de 25 ul, o tempo para a erosão completa é de cerca de 5 min. </li></ul></li><li> Colocar a placa em gelo durante alguns minutos para reduzir a actividade dequimotripsina. </li><li> Transferir a solução de células em 1 ml de tubo e centrifuga-se a 300 rpm, 4 ° C durante 2 min. </li><li> Cuidadosamente remover o sobrenadante com uma pipeta de pasto e gentilmente ressuspender os esferóides em HBSS. </li><li> Transferir a solução recuperada esferóide para uma placa de 24 poços e colocar a placa em gelo para permitir que os esferóides se estabelecer. </li><li> Para a análise de tamanho, a aquisição de imagens de contraste de fase dos esferóides liquidadas utilizando um microscópio de luz. Medida recuperado diâmetros esferóides usando softwares como o elemento Nikon software ou ImageJ. </li></ol> G. Ensaio Funcional de esferóides Recuperadas G.1. Glucose a secreção de insulina estimulada a partir dos esferóides de células recuperadas <ol><li> Numa placa de 24 poços, incubam os géis em 500 ul de 2 mM de glucose baixa Kerbs-tampão de Ringer (KRB), durante 1 hora. </li><li> Corroer o gel e recuperar esferóides de células utilizando passos F.1 a F.6. </li><li> Aspirar o sobrenadante cuidadosamente, sem fazer qualquercontacto com os esferóides de células e ressuspender os esferóides em 500 ul de 2 mM de glucose KRB baixo. </li><li> Transferir 100 uL de solução de esferóides de células para um tubo de 0,6 ml e colocá-lo em gelo para a quantificação de ATP intracelular. </li><li> Dividir a solução de células remanescente em esferóide metade (em dois tubos de microcentrifugação) e centrifugar durante 2 minutos a 300 rpm e 4 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante (quase para o fundo) e ressuspender a primeira metade de esferóides de células em 1 ml de 25 mM de glicose alta KRB e segunda metade, em 1 ml de 2 mM de glucose KRB baixo. </li><li> Pipetar suavemente e transferir a solução contendo esferóides de células recuperadas a uma placa de 24 poços. Incubar a placa durante 1 hora a 37 ° C e 5% CO 2. </li><li> Após a incubação, transferir a solução para um tubo de microcentrifugação e centrifugar durante 2 minutos a 1.000 rpm e 4 ° C. </li><li> Transferir 500 uL do sobrenadante a partir do tubo centrifugado para outro tubo de microcentrífuga e armazenar a 4 ° C para insulinaELISA. </li><li> Executar o protocolo do fabricante de insulina ELISA seguinte. </li></ol> G.2. CellTiter Ensaio Glo <ol><li> Padrões de ATP: Prepara-se uma solução de ATP 10 uM e realizar diluições em série para se obter uma série de 8 de soluções-padrão. </li><li> Para uma placa de 96 branco cavidade, adicionar 50 ul de uma solução de esferóide célula (a partir do passo G.1.6) e padrões. </li><li> A cada poço contendo as amostras e os padrões, adicionar 50 ul de reagente CellTiter Glo e incubar à temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Após a incubação, a contagem de medida de luminescência das amostras e padrões usando um leitor de microplacas e calibrar as concentrações de ATP de amostras, utilizando uma curva de regressão linear gerados pelos padrões de ATP. </li><li> Determinar a concentração de ATP total em amostra e multiplicar pelo factor de diluição da amostra para obter a concentração de ATP intracelular em uma célula carregada de hidrogel. </li></ol> G.3. Determinar a secreção de insulina <ol><li> Calcular a amount de insulina secretada a partir dos esferóides recuperados, tendo a razão entre a quantidade de insulina segregada no meio de glucose elevada a quantidade de insulina segregada no meio de glucose baixa. </li><li> Normalizar o teor de insulina quantificados de esferóides de células com respectiva quantidade de ATP intracelular dos esferóides celulares recuperados. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

O protocolo descrito apresenta detalhes sobre a encapsulação de células simples em tiol-eno hidrogeles formados a passo de crescimento de fotopolimerização. Enquanto uma proporção estequiométrica de 1:1 de norborneno para grupos funcionais tiol foi utilizada neste protocolo, a razão pode ser ajustada de acordo com as experiências. Para além de uma formulação correcta, é importante para manter a homogeneidade da solução de pré-polímero. Em particular, a utilização de pipetagem suave para assegurar que...

Hidrogéis são hidrofílicas polímeros reticulados com potencial excepcional como materiais de andaimes para reparar e regenerar os tecidos. 1-3 O alto teor de água de hidrogéis permite fácil difusão de oxigênio e troca de nutrientes e produtos metabólicos celulares, os quais são fundamentais para a manutenção da viabilidade celular. Além disso, os hidrogéis são excelentes veículos para a libertação controlada e distribuição das células, devido a sua alta tunability. Dois hidrogeles sintéticos tais como aqueles preparados a partir de poli (etileno glicol) (PEG) são cada vez mais utilizados em aplicações de engenharia de tecidos, em grande parte devido à sua cytocompatibility, tecido- como a elasticidade, e tunability elevado em material as propriedades físicas e mecânicas. 4-6 Apesar de uma plataforma de hidrogel de uso geral, os estudos mostraram que o PEG diacrilato (PEGDA) hidrogeles formados por cadeia de crescimento photopolymerizations têm uma tendência para danificar as células encapsuladas during reticulação da rede e na encapsulação de células in situ. 7 O dano celular foi largamente atribuída a espécies de radicais livres gerados pelas moléculas de fotoiniciador, que se propagam através dos grupos de vinil sobre PEGDA a cadeias de polímero em ligação cruzada de hidrogéis. Infelizmente, estas espécies radicalares também provocar tensões e danos celulares durante a encapsulação de células, especialmente para radical células sensíveis, tais como as células pancreáticas β. 8-10 De modo a obter um tamanho de malha maior para uma melhor difusão e sobrevivência celular, pesos moleculares mais elevados PEGDA são muitas vezes utilizados para a encapsulação de células. Isto, no entanto, compromete a cinética de polimerização e causa sub-óptimas propriedades de gel biofísicos. 7,11,12 Além das desvantagens acima mencionadas, é muito difícil recuperar as estruturas celulares a partir de hidrogéis PEGDA devido à natureza heterogeneidade e não degradável de as redes reticuladas. Enquanto protease sensíveis péptidos podem ser incorporadosem PEG backbone de macrómero para processar os hidrogéis de outro modo inertes PEGDA sensíveis à clivagem enzimática, a conjugação frequentemente utiliza reagentes dispendiosos e as redes resultantes contêm ainda elevado grau de heterogeneidade devido à natureza da cadeia de crescimento-polimerização. 13-15 Recentemente, o PEG-péptido hidrogeles formados via passo crescimento fotopolimerização-tiol-eno Foi demonstrado que exibem propriedades preferenciais para a encapsulação de células sobre hidrogeles formados por fotopolimerização cadeia crescimento. 7 A cinética de gelificação superiores de tiol-eno hidrogéis é atribuído ao clique &quot; &quot;natureza da reação entre o tiol e funcionalidades Ene. Em comparação com o crescimento da cadeia de polimerização de PEGDA, tiol-eno reacção é menos inibida de oxigénio o que resulta em taxas mais rápidas de gelificação. 16,17 tiol-eno hidrogeles também têm uma maior eficiência de polimerização e melhores propriedades biofísicas do gel comparado com o crescimento da cadeia-PEGDA hidrogéis, 7 , 18 &lt;/ Sup&gt;, que resulta em dano celular limitada causada por espécies de radicais livres durante a fotopolimerização. Anteriormente, tiol-eno hidrogéis formada por quatro braços-PEG-norborneno (PEG4NB) macrómero e de cisteína bis-reticuladores contendo péptidos, tais como a protease sensíveis péptidos têm sido utilizados para a encapsulação de células. Tunability 7,18 Alta de redes de hidrogel de PEG proporciona um flexível e controlável microambiente 3D para investigar a sobrevivência de células e de actividade, enquanto que a utilização de protease-sensitive sequência peptídica fornece uma forma suave para a recuperação de estruturas celulares formadas naturalmente dentro de hidrogéis. Neste protocolo, utilizamos passo crescimento fotopolimerizável tiol-eno hidrogéis fabricado usando 4-braço PEG-norborneno (PEG4NB) e um agente de reticulação de péptidos quimotripsina-sensível (CGGY ↓ C) para a encapsulação de células β MIN6. Este protocolo sistematicamente elabora técnicas para estudar a formação de proliferação, sobrevivência e esferóide de MIN6β células-tiol-eno hidrogeles. Nós ainda proporcionar um método para a recuperação de células β esferóide e caracterização biológica de esferóides recuperados.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 4 braço-PEG (20 kDa) </td><td> Jenkem Tecnologia EUA </td><td> 4ARM-PEG-20K </td><td></td></tr><tr><td> Fmoc-aminoácidos </td><td> Anaspec </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vivo / Morto kit viabilidade celular </td><td> Invitrogen </td><td> L3224 </td><td> Inclui calceína AM e etídio homodímero-1 </td></tr><tr><td> Reagente AlamarBlue </td><td> Abd Serotec </td><td> BUF012 </td><td></td></tr><tr><td> CellTiter reagente Glo </td><td> Promega </td><td> G7570 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Lonza </td><td> 17-512F </td><td> Sem Ca +2 e Mg +2 </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Lonza </td><td> 10547F </td><td> SemCa +2 e Mg +2 </td></tr><tr><td> Glicose alta DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco </td><td> 16000-044 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiótico-antimicótico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td><td></td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7522-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 15400-054 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-livre α-quimotripsina </td><td> Worthington Corp Bioquímica </td><td> LS001432 </td><td></td></tr><tr><td> Rato Inusin ELISA kit </td><td> Mercodia </td><td> 10-1247-01 </td><td></td></tr><tr><td> Uma seringa descartável ml </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generation and recovery of &beta;-cell spheroids from step-growth peg-peptide hydrogels

Os hidrogéis são polímeros reticulados hidrófilos que proporcionam um microambiente tridimensional com tecido semelhante a elasticidade e permeabilidade elevada para a cultura de células ou tecidos terapeuticamente relevantes. Hidrogeles preparados a partir de poli (etileno glicol) (PEG), os derivados são cada vez mais utilizados para uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos, em parte devido às suas propriedades e cytocompatible sintonizáveis. Neste protocolo, utilizamos tiol-eno etapa de crescimento photopolymerizations para fabricar PEG peptídeo-hidrogéis para encapsular pancreático MIN6 b-células. Os géis foram formadas por 4 braços PEG-norborneno macrómero (PEG4NB) e um agente de reticulação de péptidos quimotripsina-sensível (CGGYC). A natureza hidrófila e não-incrustante de PEG proporciona um microambiente cytocompatible para sobrevivência e proliferação celular em 3D, enquanto o uso de quimotripsina sensível sequência peptídica (C GGY ↓ C, seta indica local de clivagem da enzima, enquanto cisto terminaiseine resíduos foram adicionados por tiol-eno reticulação) permite uma recuperação rápida de estruturas celulares que formam dentro do hidrogel. O protocolo que se segue desenvolve técnicas para: (1) encapsulamento dos MIN6 β células-tiol-eno hidrogéis, (2) ensaios de viabilidade qualitativa e quantitativa de células para determinar a sobrevivência e proliferação das células, (3) A recuperação de esferóides de células usando quimotripsina mediada gel erosão, e (4) a análise estrutural e funcional dos esferóides recuperados.

<html> As Figuras 1-4 mostram os resultados de sobrevivência representativos para a encapsulação, a proliferação, a formação de esferóides, e recuperação esferóide tiol-eno em hidrogéis. Figura 1 mostra o esquema da reacção de (1) um passo de crescimento de fotopolimerização tiol-eno usando PEG4NB e CGGYC, e ( 2) a quimotripsina erosão gel mediada que segue um mecanismo de erosão de superfície. Figuras 2 e 3 apresentam os resultados ob...

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Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

O protocolo a seguir fornece técnicas para encapsular as células pancreáticas β na etapa de crescimento-PEG-péptido hidrogeles formados por reacções foto-clique tiol-eno. Esta plataforma de material não só proporciona um microambiente cytocompatible para encapsulamento de células, mas também permite que controlado pelo utilizador a recuperação rápida de estruturas de células formadas dentro dos hidrogéis.

Geração e recuperação de β-esferóides de células a partir do passo de crescimento-PEG-péptido Hidrogéis

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

generation-recovery-cell-spheroids-from-step-growth-peg-peptide

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

14.1K visualizações.  Indiana University - Purdue University at Indianapolis. O protocolo a seguir fornece técnicas para encapsular as células pancreáticas β na etapa de crescimento-PEG-péptido hidrogeles formados por reacções foto-clique tiol-eno. Esta plataforma de material não só proporciona um microambiente cytocompatible para encapsulamento de células, mas também permite que controlado pelo utilizador a recuperação rápida de estruturas de células formadas dentro dos hidrogéis.

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A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells within a tissue, however, are typically encased within a closely packed tissue mass in which cells establish intimate connections with many near-neighbors and with extracellular matrix components. Accordingly, the chemical milieu and physical forces experienced by cells within a 3D tissue are fundamentally different than those experienced by cells grown in monolayer culture. This has been shown to markedly impact cellular morphology and signaling. Several methods have been devised to generate 3D cell cultures including encapsulation of cells in collagen gels1or in biomaterial scaffolds2. Such methods, while useful, do not recapitulate the intimate direct cell-cell adhesion architecture found in normal tissues. Rather, they more closely approximate culture systems in which single cells are loosely dispersed within a 3D meshwork of ECM products. Here, we describe a simple method in which cells are placed in hanging drop culture and incubated under physiological conditions until they form true 3D spheroids in which cells are in direct contact with each other and with extracellular matrix components. The method requires no specialized equipment and can be adapted to include addition of any biological agent in very small quantities that may be of interest in elucidating effects on cell-cell or cell-ECM interaction. The method can also be used to co-culture two (or more) different cell populations so as to elucidate the role of cell-cell or cell-ECM interactions in specifying spatial relationships between cells. Cell-cell cohesion and cell-ECM adhesion are the cornerstones of studies of embryonic development, tumor-stromal cell interaction in malignant invasion, wound healing, and for applications to tissue engineering. This simple method will provide a means of generating tissue-like cellular aggregates for measurement of biomechanical properties or for molecular and biochemical analysis in a physiologically relevant model.

We describe a simple, rapid method of generating 3D tissue-like spheroids and their potential application to quantify differences in cell-cell interactions.

Uma simples gota de suspensão Protocolo Cultura de Células para a geração de esferóides 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

Bioengenharia

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formação Light-mediada e padronização de hidrogéis para aplicações de cultura celular

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizável hidrogéis a partir de Pulmonar Matriz Extracelular para Cultura Celular 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Tensão controlada de hidrogéis 3D sob imagem de microscopia ao vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

Biofabricção assistida por microscopia de oxigênio acessível de esferoides multicelulares

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Fragmenting Bulk Hydrogels and Processing into Granular Hydrogels for Biomedical Applications

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have many advantageous properties, including injectability, microscale porosity, and tunability by mixing multiple microgel populations. Methods to fabricate microgels often rely on water-in-oil emulsions (e.g., microfluidics, batch emulsions, electrospraying) or photolithography, which may present high demands in terms of resources and costs, and may not be compatible with many hydrogels. This work details simple yet highly effective methods to fabricate microgels using extrusion fragmentation and to process them into granular hydrogels useful for biomedical applications (e.g., 3D printing inks). First, bulk hydrogels (using photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) as an example) are extruded through a series of needles with sequentially smaller diameters to form fragmented microgels. This microgel fabrication technique is rapid, low-cost, and highly scalable. Methods to jam microgels into granular hydrogels by centrifugation and vacuum-driven filtration are described, with optional post-crosslinking for hydrogel stabilization. Lastly, granular hydrogels fabricated from fragmented microgels are demonstrated as extrusion printing inks. While the examples described herein use photocrosslinkable HA for 3D printing, the methods are easily adaptable for a wide variety of hydrogel types and biomedical applications.

This work describes straightforward, adaptable, and low-cost methods to fabricate microgels with extrusion fragmentation, process the microgels into injectable granular hydrogels, and apply the granular hydrogels as extrusion printing inks for biomedical applications.

Fragmentando hidrogéis a granel e processando em hidrogéis granulares para aplicações biomédicas

Granular hydrogels are jammed assemblies of hydrogel microparticles (i.e., &#34;microgels&#34;). In the field of biomaterials, granular hydrogels have ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

Geração, Triagem de Alto Rendimento e Biobanco de Esferoides Cardíacos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos.

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...