Os autores gostariam de agradecer a Norman Krüger para o seu excelente suporte técnico.

1. Parte 1: Cultura da hNPCs em PuraMatrix <ol><li> Com antecedência, para a geração de um andaime com uma concentração de 0,25% PuraMatrix sem laminina, é necessário preparar as seguintes soluções </li><li> Prepare uma solução contendo sacarose 20% e uma solução contendo 10% de sacarose dissolvida em água destilada estéril. </li><li> Para solução 1 ml mix 120 da solução de sacarose 20% com 120 mL de água destilada em um tubo de 1,5 ml cônico. </li><li> Para a solução 2 mL mix 60 do PuraMatrix solução com 60 ml de solução de sacarose 20% em um tubo de 1,5 ml cônico. </li></ol> De uma preparação de um andaime com uma concentração de 0,25% PuraMatrix suplementado com laminina (8 mg por 100 mL Matrix), é necessário preparar as seguintes soluções. <ol class="lroman"><li> Para solução 1 ml mix 72 de água destilada com 120 ml de solução de sacarose 20% e 48 mL laminina em um tubo de 1,5 ml cônico. </li><li>Para a solução 2 mix solução PuraMatrix 60 mL com 60 mL da solução de sacarose 20% em um tubo de 1,5 ml cônico. </li></ol><ol start="5"><li> Para o encaixe de células no PuraMatrix preparar um 4-bem placa de cultura de células e coloque uma lamínula esterilizada de vidro (mm diâmetro 13) em dois poços. Armazenar a placa na bancada limpa para o uso posterior. Lamínulas de vidro são utilizadas apenas para os estudos imunocitoquímicos. Se não colorações imunocitoquímicos são destinados, a etapa pode ser ignorada. </li></ol> Para preparar o hNPCs para encapsulamento em um scaffolds 3D tem que se preparar as seguintes soluções. Diluir o Benzonase na solução Tripsina / EDTA, utilizando um factor de diluição de 1:10.000. Para uma mistura solução Trypsin-Inhibitor/Benzonase: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + Tripsina-inibidor (0,5 mg). <ol start="6"><li> Separar as células por adição de 500 solução de Tripsina / Benzonase mL e incubar por 5 min em uma incubadora (37 CO ° C, 5% 2). Parar a reação com solução Trypsin-Inhibitor/Benzonase. Posteriormente centrifugar as células destacadas por 5 min a 3000 x g. Lavar as células com 5 ml da solução de sacarose 10% e centrifugar novamente. Desprezar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em solução de sacarose 10%, a solução final deve conter células 1x10 6 células / ml. </li></ol> Os próximos passos, 1,8-1,11, deve ser feito o mais rápido possível, devido ao baixo pH da solução PuraMatrix, o que pode ser prejudicial para as células. <ol start="8"><li> Misture 60 mL de suspensão de células com a solução 1. </li><li> Adicione 120 ml de solução 1, que contém as células, para o tubo cônico com solução de 2 e misture cuidadosamente. </li><li> ML colocar 100 da mistura imediatamente sobre cada tampa desliza residia na placa de quatro poços. </li><li> Adicione lentamente 200 mL meio de cultura de células por poço e depois de 2-3 minutos outra mL 200. Isto irá iniciar o auto-montagem da matriz. </li><li> Incubar cells a 37 ° C, por 1h na bancada limpa em uma placa de aquecimento ou a área aquecida de sua bancada limpa. Na medida do possível não se movem a placa pois isso pode prejudicar a montagem das matrizes. </li><li> Remover a maior parte do meio, mas não todos, para evitar as matrizes caindo seco, com uma pipeta de 1000 mL. Adicionar 500 mL de meio de matrizes para lavar por 10 min. Finalmente retire a médio e adicionar 500 mL de médio fresco e colocar a placa de cultura em uma incubadora (37 ° CO C, 5% 2). Como as matrizes são sensíveis ao choque das placas deve ser movido o menos possível e armazenado, se possível, em uma incubadora separado. </li><li> O hNPCs aqui utilizados foram proliferaram por 7 dias no scaffolds 3D e diferenciação foi iniciada pela retirada dos fatores de crescimento 13. Meio foi trocado a cada 2-3 dias. </li></ol> 2. Parte 2: coloração imunocitoquímico de matrizes inteira <ol><li> Com antecedência, para o procedimento de coloração, é necessário preparar: absolução tampão de bloqueio constituído de soro de cabra normal de 5% e 0,3% de Triton X-100 (dissolvida em PBS, uma solução de paraformaldeído a 4% com base em 0,1 M PBS e se precisava de uma solução com 4 &#39;,6-Diamidin-2&#39;-phenylindoldihydrochlorid DAPI) para uma coloração núcleos contendo 100 ng DAPI / ml dissolvida em PBS. As amostras foram montadas com uma mistura de Mowiol e DABCO. </li><li> Para lavar as matrizes remover o meio com uma pipeta de 1000 mL e lavar os andaimes, uma vez com PBS por 5 minutos. </li><li> Para corrigir os andaimes remover o PBS e adicionar 400 mL de paraformaldeído (4% em 0,1 M PBS) para cada poço e incubar as matrizes por 30 minutos em temperatura ambiente. Os andaimes fixos podem ser armazenados em PBS suplementado com 0,02% NaN 3 a 4 ° C por várias semanas até vários meses. </li><li> Antes de uma coloração lavar os andaimes com PBS por 5 minutos. </li><li> Incubar os andaimes em solução de bloqueio buffer. Solução de bloqueio foi mudado três vezes a cada 2-3 horas e subsequcantes andaimes foram incubadas em solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover a solução tampão de bloqueio e adicionar o anticorpo primário dissolvida em PBS suplementado com soro de cabra normal de 1% e incubar as matrizes durante a noite a 4 ° C. </li><li> Remover a solução anticorpo primário e lavar andaimes 4 vezes por 2 h e, posteriormente, durante a noite a 4 ° C com PBS. </li><li> Remover o PBS e adicionar a solução com o anticorpo secundário, dissolvida em PBS suplementado com soro de cabra 1% normal, por 4 h à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Lavar as amostras com PBS 4-6 vezes por 1 hora e, posteriormente, durante a noite a 4 ° C no escuro. </li><li> Para uma coloração núcleos pode-se adicionar 400 mL da solução de DAPI por 30 min. </li><li> Para montar as amostras é necessário lâminas de microscópio. Adicionar 50 mL Mowiol / Dabco na lâminas de microscópio. Remova a tampa desliza a partir da placa de 4 bem e colocá-los cuidadosamente sobre o meio de montagem. </li><li> Aqui usamos um 8000 Biozeromicroscópio (Keyence, Alemanha, Karlsruhe) para obter micrografias única e z-stacks. Cada pilha contém 30 imagens de solteiro com uma distância de M 1-2. Usando o software analisador correspondentes a desfocagem inerente à fluorescência foi removido antes projeções completa do z-stacks foram produzidos. </li></ol> 3. Parte 3: Lançamento do hNPCs dos andaimes para a análise de citometria de fluxo <ol><li> Com antecedência, para a liberação das células de andaimes lavar os andaimes com 500 mL HBSS. </li><li> Transferir os andaimes por meio de uma pipeta de 1000 mL para um tubo cônico de 15 ml contendo meio de cultura celular. </li><li> Para perturbar a andaimes mecanicamente ressuspender a solução celular várias vezes com uma pipeta de 1000 mL e, posteriormente, centrifugar a solução a 3000 xg por 5 min. </li><li> Retire o sobrenadante com uma pipeta, adicionar 500 mL de tripsina / Benzonase solução e ressuspender o pellet celular várias vezes. </li><li> Incubar as células por 5 mina 37 ° C na solução de Tripsina / Benzonase. Para parar a reacção adicionar uma solução Trypsin-inhibitor/Benzonase ml e pipeta para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Centrifugar a suspensão celular 5 min a 3000 xg, remover o sobrenadante e lavar as células com tampão HBSS 2 ml. Repita este passo duas vezes. Este procedimento irá remover os restos da matriz. </li><li> Passe o celular através de um filtro solução suspensão celular (tamanho dos poros 70 mm) para remover agregados e recolher as células em meio de cultura celular. As células obtidas podem ser semeados novamente por exemplo, sobre lamínulas para estudos funcionais como patch clamp ou medições fluometric. Para processar as células para citometria de fluxo, as células corrigir imediatamente (ver 4.1). </li></ol> 4. Parte 4: Quantificação de βIII-tubulina células positivas por citometria de fluxo <ol><li> Fixar as células lançado obtida no passo 3.7 com PFA 1% por 15 min em temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 3000 xg e remove o sobrenadante. Se necessário, as células podem estar preparado para ser armazenado a 4 ° C para posterior análise. Portanto, as células ressuspender em tampão de lavagem (PBS suplementado com BSA 0,5% e 0,02% Na-azida). </li><li> Para prosseguir com a preparação para a citometria de fluxo, centrifugar a suspensão celular por 10 minutos a 350 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 25 mL da solução de anticorpos. Portanto, o primeiro anticorpo é misturado com tampão de saponina na concentração 1:100 por exemplo βIII-tubulina. O buffer de saponina consiste em PBS com uma concentração de 0,5% saponina, uma concentração de BSA de 0,5% e uma concentração de Na-azida de 0,02%. </li><li> Incubar a suspensão de células com o primeiro anticorpo para 2 h à temperatura ambiente em um agitador. Como controle negativo preparar uma amostra sem o primeiro anticorpo. </li><li> Para a etapa primeira lavagem adicionar 300 mL de buffer saponina diretamente para as células. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 350 x g. Para a segunda lavagem, descartaro sobrenadante, adicionar 300 mL de buffer e centrifugar a suspensão de células por 5 min a 350 x g. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 25 mL de solução contendo o anticorpo secundário (por exemplo Alexa Fluor 647, 1:1000, dissolvido em tampão saponina). Incubar as células com o anticorpo secundário 1h à temperatura ambiente, no escuro. </li><li> Para a etapa primeira lavagem adicionar 300 mL de buffer saponina diretamente para as células. Centrifugar a suspensão celular por 5 min a 350 x g. Para a segunda lavagem, descartar o sobrenadante, adicionar 300 mL de buffer e centrifugar a suspensão de células por 5 min a 350 x g. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 mL de tampão de lavagem para a análise de citometria de fluxo. </li></ol> 5. Resultados representante Um exemplo de hNPCs cultivadas em auto-montagem de andaime PuraMatrix hidrogel é mostrado na figura 1. O hNPCs crescer em estruturas esféricas como na PM não modificado. Nesta condição culturas, as células dificilmente pode ser reconhecido em uma transmissão de luz, apesar de feixes de processos entre as esferas são visíveis (fig. 1A). Dependendo das condições de cultura do tipo de célula utilizada, a matriz pode ser modificado por exemplo, pela adição de laminina. Para a linha de células hNPC ReNcell VM (Millipore) laminina é necessário para induzir um padrão de crescimento com agregados menos densos, mas uma distribuição mais homogênea das células (Fig 1b). Independente das modificações, a matriz pode ser usado para estudar a diferenciação neuronal, por exemplo. Figura 1C apresenta uma coloração do hNPCs para o marcador neuronal βIII-tubulina. Neste exemplo as células foram cultivadas por 7 dias na matriz e, posteriormente, diferenciada por 4 dias, onde a diferenciação foi induzida pela retirada do EGF e fatores de crescimento. BFGF 13 corpos celulares e uma densa rede de processos construída pelas células pode ser reconhecidos facilmente. No entanto, é óbvio que uma quantificação do número de células é demorado, como um grande número deimagens de diferentes regiões da matriz tem de ser analisada, para se obter uma base de dados confiável para uma análise estatística. Em 1D fig pode-se ver um exemplo de células libertada da matriz e, posteriormente, tecendo sobre lamínulas. Essas células poderiam ser usadas para estudos funcionais. A liberação das células do scaffolds 3D oferece a possibilidade de analisar diferentes parâmetros, como expressão de proteínas marcadoras ou a taxa de sobrevivência das células por AnnexinV / PI coloração ou um ensaio de TUNEL. A Figura 2 mostra um exemplo de uma análise de citometria de fluxo da percentagem de células βIII-tubulina +. O controle negativo (células não marcadas para βIII-tubulina) é mostrado na Figura 2a. Esses controles são usados ​​para determinar o portão para a detecção mais recente do βIII-tubulina + células (fig. 2B). Uma comparação de uma contagem manual de células e uma análise por citometria de fluxo é mostrado na figura 2C. A porcentagem de células βIII-tubulina + foi determINED pela contagem do número total de células (por meio de uma coloração DAPI nuclear) eo número de células βIII-tubulina + nas fotos de fluorescência. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig1.jpg" /> Figura 1. hNPCs cultivadas em PuraMatrix hidrogel de auto-montagem de peptídeos. A hNPCs) encapsulado em PuraMatrix (PM) crescer em spheric, densas estruturas lotado, onde o diâmetro das esferas pode ser até várias centenas de M. Entre as esferas pode-se reconhecer pacotes de processos construída pelas células (setas). B) As células encapsuladas em PuraMatrix suplementado com laminina (PML) crescem em estruturas menos denso, mais homogeneamente distribuída. Na laminina complementada matriz pode-se reconhecer células individuais em áreas menos densas (setas), no entanto, é quase impossível quantificar o número de células. C) hNPCs diferenciados para 4 dias em PML marcador neuronal expressar como βIII-tubulina (verde). Para avaliaçãote a porcentagem de células positivas é preciso determinar o número total de células por uma coloração núcleos como o DAPI (azul). A microfotografia apresenta a projeção total de um z pilha de fotos tiradas com Biozero-8000 microscópio. D) Células lançado a partir da matriz podem ser semeadas em lamínulas por exemplo, para estudos funcionais. A microfotografia mostra células cultivadas por 3d, posteriormente, ao processo de libertação. A coloração para βIII-tubulina (vermelho) revela uma morfologia semelhante às células hospedado no andaime 3D. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3830/3830fig2.jpg" /> Figura 2. Células de fluxo citometria liberado PuraMatrix. Para superar a quantificação demorada de microfotografias foi utilizado um protocolo para liberação de células cultivadas em PuraMatrix que dá acesso a uma análise mais rápida por citometria de fluxo. Um células) Unstained foram usados ​​como controle negativo, para definir o portão (moldura preta) para a análise posteriormentede, por exemplo βIII-tubulina células. B) Para quantificar o percentual de βIII-tubulina + células mesma porta, situado no controle negativo, foi utilizado. Células positivas aparecem na parte direita do eixo x, onde também uma população intermediária foi observado (frame pontilhada), restos celulares mais provável que representam. C) A comparação do manual células contadas e células contadas por citometria de fluxo revelou uma proporção muito maior de células positivas, onde a dependência temporal do número de βIII-tubulina + foi comparável, o que indica a confiabilidade do protocolo de citometria de fluxo.

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	<li>Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+scaffolds+for+3D+tissue+cell+cultures.">Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures.</a> Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).</li><li>Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+scaffolds+for+3-d+tissue+cell+cultures+and+regenerative+medicine.">Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine.</a> Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).</li><li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Culture:+building+a+better+matrix.">Cell Culture: building a better matrix.</a> Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).</li><li>Hauser, C. A., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+self-assembling+peptide+nanofiber+biological+materials.">Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).</li><li>Teng, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+recovery+following+traumatic+spinal+cord+injury+mediated+by+a+unique+polymer+scaffold+seeded+with+neural+stem+cells.">Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).</li><li>Silva, G. 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ONE. 1, e119-e119 (2006).</li><li>Taraballi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine-spacers+influence+functional+motifs+exposure+and+self-assembling+propensity+of+functionalized+substrates+tailored+for+neural+stem+cell+cultures.">Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures.</a> Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).</li><li>Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+assembly+of+a+self-complementary+oligopeptide+to+form+a+stable+macroscopic+membrane.">Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 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Não há conflitos de interesse declarados.

O uso do 3D-scaffolds oferece a oportunidade de estudar o desenvolvimento de diferentes tipos de células em uma situação de cultura de células mais perto a situação in vivo. No entanto, quanto à análise da diferenciação neuronal por exemplo, ou estudos funcionais é preciso superar alguns obstáculos para obtenção de dados confiáveis ​​para quantificação por exemplo, de tipos de células. Aqui descrevemos a cultura de hNPCs no hidrogel baseada peptídeo s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> PuraMatrix hidrogel peptídeo </td><td> BD Bioscience </td><td> 354250 </td><td></td></tr><tr><td> Rato laminina I </td><td> Cultrex </td><td> 400-2009090 </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma </td><td> S9378-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Dako </td><td> X0907 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Roth </td><td> 3051,3 </td><td></td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Biochrom AG </td><td> L 1825 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170-088 </td><td> Solução de Hanks salina balanceada 1X </td></tr><tr><td&gt; Anticorpo βIII-tubulina </td><td> Santa Cruz </td><td> Sc-51670 </td><td> Mouse, monoclonal, 1:500 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11.029 </td><td> Cabra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 568 </td><td> Invitrogen </td><td> A 11.031 </td><td> Cabra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A 21.235 </td><td> Cabra α mouse, 1:1000 </td></tr><tr><td> Mowiol Reagente 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> Aldrich </td><td> D2 ,780-2 </td><td> 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano 98% </td></tr><tr><td> Coador celular </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> 70 mM tamanho dos poros </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Merck </td><td> 7695 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina/ EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase 250 U / mL </td><td> Merck </td><td> 1.01654.0001 </td><td></td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina </td><td> Sigma </td><td> T6522 (500 mg) </td><td></td></tr><tr><td> 20% HSA </td><td> Octapharma </td><td> A albumina humana-Kabi 20% </td><td></td></tr></tbody></table>

cultivation of human neural progenitor cells in a 3-dimensional self-assembling peptide hydrogel

A influência de três dimensões (3D) andaimes em diferenciação, proliferação, crescimento e finalmente neuronal é de grande interesse, a fim de encontrar novos métodos de terapias baseadas em células e padronizado em distúrbios neurológicos ou doenças neurodegenerativas. Estruturas 3D são esperados para proporcionar um ambiente muito mais próximo da situação in vivo do que as culturas 2D. No contexto da medicina regenerativa, a combinação de andaimes biomaterial com tronco neurais e células progenitoras é uma grande promessa como uma ferramenta terapêutica. 1-5 sistemas Cultura emular um ambiente tridimensional foram mostrados para influenciar a proliferação e diferenciação em diferentes tipos de caule e células progenitoras. Aqui, a formação e funcionalização do 3D microenviroment é importante para determinar a sobrevivência e destino das células incorporado. 6-8 Aqui usamos PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), um peptídeo com base hidrogel andaime,que é bem descrito e utilizado para estudar a influência de um ambiente 3D sobre diferentes tipos celulares. 7,11-14 PuraMatrix podem ser facilmente personalizados ea fabricação sintética do nano-fibras fornece um sistema de cultura 3D de alta confiabilidade, que é, além xeno-free. Recentemente, têm estudado a influência da concentração de PM-sobre a formação do andaime. 13 Neste estudo as concentrações utilizadas da PM teve um impacto direto sobre a formação da estrutura em 3D, que foi demonstrada por microscopia de força atômica. Uma análise posterior da sobrevivência e diferenciação dos hNPCs revelou uma influência das concentrações utilizadas da PM sobre o destino das células incorporado. No entanto, a análise de sobrevida ou diferenciação neuronal por meio de técnicas de imunofluorescência possuir alguns obstáculos. Para obter dados confiáveis, é preciso determinar o número total de células dentro de uma matriz para obter o número relativo de exemplo. células neuronais marcados por βIII-tubulina. Este pré-requisitos de uma técnica para analisar os andaimes em todas as dimensões de 3 por um microscópio confocal ou uma técnica comparável como microscópios de fluorescência capaz de tomar z-stacks da amostra. Além disso, este tipo de análise é extremamente demorado. Aqui demonstramos um método para liberar as células dos andaimes 3D para a análise posterior por exemplo, por citometria de fluxo. Neste protocolo células progenitoras neurais (hNPCs) da linha celular ReNcell VM (Millipore EUA) foram cultivadas e diferenciadas em 3D-scaffolds consistindo de PuraMatrix (PM) ou PuraMatrix suplementado com laminina (PML). Em nossas mãos um PM-concentração de 0,25% foi ideal para o cultivo das 13 células, no entanto, a concentração pode ser adaptado para outros tipos celulares. 12 As células liberado pode ser usado para, por exemplo estudos imunocitoquímicos e posteriormente analisadas por citometria de fluxo. Isso acelera a análise e more mais, o resto os dados obtidos sobre uma base mais ampla, melhorando a confiabilidade dos dados.

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Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

Aqui nós descrevemos o uso de uma auto-montagem 3-dimensional andaime para a cultura humana células progenitoras neurais. Nós apresentamos um protocolo para liberar as células da scaffolds a serem analisados ​​posteriormente por exemplo, por citometria de fluxo. Este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células para realizar estudos detalhados mecanicamente.

Cultivo de células progenitoras neurais em um hidrogel Peptide 3-dimensional de auto-montagem

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.5K visualizações.  University of Rostock. Aqui nós descrevemos o uso de uma auto-montagem 3-dimensional andaime para a cultura humana células progenitoras neurais. Nós apresentamos um protocolo para liberar as células da scaffolds a serem analisados ​​posteriormente por exemplo, por citometria de fluxo. Este protocolo pode ser adaptado para outros tipos de células para realizar estudos detalhados mecanicamente.

Vídeo: Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Bioengenharia

Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

Organotípica Colágeno Ensaio I: Uma Plataforma maleável para Avaliar Comportamento celular em um contexto de 3-Dimensional

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

Adaptation of a Haptic Robot in a 3T fMRI

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing radiation, millimeter spatial accuracy of anatomical and functional data 2, and nearly real-time analyses 3. Haptic robots provide precise measurement and control of position and force of a cursor in a reasonably confined space. Here we combine these two technologies to allow precision experiments involving motor control with haptic/tactile environment interaction such as reaching or grasping. The basic idea is to attach an 8 foot end effecter supported in the center to the robot 4 allowing the subject to use the robot, but shielding it and keeping it out of the most extreme part of the magnetic field from the fMRI machine (Figure 1).
The Phantom Premium 3.0, 6DoF, high-force robot (SensAble Technologies, Inc.) is an excellent choice for providing force-feedback in virtual reality experiments 5, 6, but it is inherently non-MR safe, introduces significant noise to the sensitive fMRI equipment, and its electric motors may be affected by the fMRI's strongly varying magnetic field. We have constructed a table and shielding system that allows the robot to be safely introduced into the fMRI environment and limits both the degradation of the fMRI signal by the electrically noisy motors and the degradation of the electric motor performance by the strongly varying magnetic field of the fMRI. With the shield, the signal to noise ratio (SNR: mean signal/noise standard deviation) of the fMRI goes from a baseline of &tilde;380 to &tilde;330, and &tilde;250 without the shielding. The remaining noise appears to be uncorrelated and does not add artifacts to the fMRI of a test sphere (Figure 2). The long, stiff handle allows placement of the robot out of range of the most strongly varying parts of the magnetic field so there is no significant effect of the fMRI on the robot. The effect of the handle on the robot's kinematics is minimal since it is lightweight (&tilde;2.6 lbs) but extremely stiff 3/4" graphite and well balanced on the 3DoF joint in the middle. The end result is an fMRI compatible, haptic system with about 1 cubic foot of working space, and, when combined with virtual reality, it allows for a new set of experiments to be performed in the fMRI environment including naturalistic reaching, passive displacement of the limb and haptic perception, adaptation learning in varying force fields, or texture identification 5, 6.

The adaptation and use of a haptic robot in a 3T fMRI is described.

Adaptação de um robô Haptic em um fMRI 3T

Functional magnetic resonance imaging (fMRI) provides excellent functional brain imaging via the BOLD signal 1 with advantages including non-ionizing ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

Campo elétrico controlado de migração dirigida de células progenitoras neurais em ambientes 2D e 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

O cultivo de células de mamíferos utilizando um uso único sistema pneumático Bioreactor

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Ácido hialurônico baseado hidrogel para 3-Dimensional cultura de células de Glioblastoma derivado de paciente

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Synthesis of Strong Adhesive Hydrogel, Gelatin O-Nitrosobenzaldehyde

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB) - which is mainly used for tissue regeneration and has been validated in animal models of corneal injury and inflammatory bowel disease. This is a novel hydrogel formed by modifying biological gelatin with o-nitrosobenzaldehyde (NB). Gelatin-NB was synthesized by activating the carboxyl group of NB-COOH and reacting with gelatin through 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The obtained compound was purified to generate the final product, which can be stably stored for at least 18 months. NB has a strong adhesion to -NH2 on the tissue, which can form many C = N bonds, thus increasing the adhesion of gelatin-NB to the tissue interface. The preparation process comprises steps for the synthesis of the NB-COOH group, modification of the group, synthesis of gelatin-NB, and purification of the compound. The goal is to describe the specific synthesis process of gelatin-NB in detail and to demonstrate the application of gelatin-NB to damage repair. Moreover, the protocol is presented to further strengthen and expand the nature of the material produced by the scientific community for more applicable scenarios.

The protocol presented here shows the synthesis of a strong adhesive hydrogel gelatin o-nitrosobenzaldehyde (gelatin-NB). Gelatin-NB has rapid and efficient tissue adhesion ability, which can form a strong physical barrier to protect wound surfaces, so it is expected to be applied to the field of injury repair biotechnology.

Síntese de Hidrogel Adesivo Forte, Gelatina O-Nitrosobenzaldeído

Adhesive materials have become popular biomaterials in the field of biomedical and tissue engineering. In our previous work, we presented a new material - ...