Nosso protocolo é significativo porque permite a produção eficiente em larga escala de esferoides de tecidos homogêneos, que são essenciais para nossas aplicações avançadas de engenharia de tecidos, desenvolvimento de medicamentos e modelagem de doenças. A principal vantagem desta técnica é sua capacidade de produzir grandes quantidades de esferóides de tecido uniforme de forma rápida e econômica, garante a alta viabilidade celular e a qualidade do esferóide consiste, o que é crucial em nossas várias aplicações biomédicas Ao produzir esteróides específicos do paciente, esta técnica oferece um modelo fisiologicamente preciso, permitindo a modelagem precisa da doença e a compreensão dos mecanismos moleculares e comportamentais, incluindo câncer. Este método pode fornecer informações sobre pesquisa de câncer, doenças neurodegenerativas e engenharia de tecidos, e pode ser aplicado ao desenvolvimento de medicamentos e medicina personalizada, aprimorando nossa compreensão de vários sistemas biológicos.
Nossa demonstração de visão é crítica, pois ilustra claramente etapas complexas, como inserção de dispositivos e semeadura de células, ajudando a evitar erros comuns e garantindo que a técnica adequada seja uma proteção para resultados consistentes. Comece adicionando o pó de agarose em um x PBS para preparar o gel de agarose 2% em um recipiente de vidro. Homogeneizar a suspensão com movimentos circulares.
Coloque o recipiente de vidro em um forno de micro-ondas e ajuste o tempo para 30 segundos. Pare o micro-ondas a cada cinco segundos, remova a garrafa de vidro e homogeneize manualmente a solução com movimentos circulares. Execute o processo de aquecimento, até que a solução atinja um estado límpido líquido.
Em seguida, adicione seis mililitros da solução de agarose a cada poço de uma placa de seis poços e aguarde 15 minutos ou até que a agarose solidifique. Em seguida, insira suavemente o dispositivo biológico impresso em 3D acima da agarose líquida e aguarde 30 minutos ou até que a agarose solidifique. Em seguida, remova suavemente o dispositivo da agarose e adicione dois mililitros de mídia DMEM.
Aguarde 10 minutos antes de descartar a mídia e substituí-la por um novo DMEM. Repita a lavagem três vezes. Uma vez feito isso, adicione dois mililitros de DMEM e coloque a placa de seis poços para semeadura de células a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono e 80% de umidade.
Cultive as células de fibroblastos de camundongo em frascos de cultura de células e mantenha-as a 37 graus Celsius em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono, até que 80% de confluência seja alcançada. Em seguida, lave as células com um x PBS e adicione a enzima de dissociação. Incube as células por dois a cinco minutos a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono e 80% de umidade.
Uma vez que as células estejam separadas do frasco de cultura celular, adicione um meio de crescimento para neutralizar a enzima de dissociação celular. Centrifugar a suspensão de células a 400 G durante cinco minutos à temperatura ambiente e contar as células. Para 50 vezes 10 elevado a cinco células tomadas em um tubo, adicione cinco mililitros de um x PBS.
Em seguida, centrifugar a suspensão da célula a 400 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante com uma pipeta antes de adicionar um mililitro do meio de cultura celular e homogeneizar a solução. Da placa de seis poços preparada anteriormente, remova dois mililitros de meio e adicione um mililitro da suspensão celular ao centro do molde de agarose formado pelo dispositivo biológico impresso em 3D.
Aguarde de 20 a 30 minutos para que as células sedimentem nas micro-ressecções antes de adicionar um mililitro de meio de cultura de células no poço. Coloque a placa de seis poços na incubadora a 37 graus Celsius por aproximadamente 24 a 48 horas para a formação de esferóides de tecido. O dispositivo semelhante a um carimbo impresso em 3D composto por micropinos cilíndricos foi fabricado com sucesso pelo método de estereolitografia usando uma resina fotocurável.
O dispositivo era simples, fácil de esterilizar, reutilizável e ajustável para diferentes tamanhos de placas de poços e placas de Petri. Gerou 750 microressecções homogêneas ou 4.716 por placas de seis poços. A retirada precoce do dispositivo da placa interrompeu o molde não aderente e deformou a geometria da microressecção.
As células semeadas nos moldes de agarose não aderentes sedimentaram e formaram os esferoides teciduais aproximadamente após 24 horas. Essa metodologia demonstrou com sucesso a produção em larga escala dos esferoides, mantendo sua forma, tamanho e viabilidade, e apoiou a cultura de esteróides por meses. A coisa mais importante a lembrar quando penso neste procedimento é inserir cuidadosamente o dispositivo para evitar bolhas de ar e adicionar suavemente o meio de cultura para evitar perturbar as células.
Após este procedimento, testes de drogas e análise de expressão gênica podem ser realizados. Respondendo a perguntas sobre eficácia de medicamentos, resposta salgada e genética aos tratamentos. Essa técnica permitirá novas pesquisas em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, permitindo a produção de esferóides em larga escala e alta qualidade, crítica para a bioimpressão 3D, e aumentará a qualidade e a quantidade das células para testes de toxicidade farmacêutica e cosmética.
