The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

Todos os procedimentos foram aprovados e executados em conformidade com o Comité de Cuidados e Uso do Vanderbilt Institucional Animal. 1. Rotulagem COI com Fluoróforo (Opcional) <ol><li> Escolha um corante fluorescente que irá reagir com uma amina primária livre (por exemplo, numa proteína), tal como ésteres de succinimidilo ou derivados de fluoresceína, para visualizar microesfera de carga. Dissolve-se um excesso molar de 8X (em relação a moles de COI) de fluoróforo em 200 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO). </li><li> Ressuspender 50 mg de COI até um volume final de 800 ul de uma solução de veículo (concentração final de 62,5 ng / ul). A solução de veículo irá variar dependendo da fonte do COI. NOTA: veículo típico incluem soluções tampão de fosfatos salino (PBS) ou DMSO. </li><li> Adicionar toda a solução de fluoróforo / DMSO do passo 1.1 e ressuspender o COI. Vortex durante a noite a 4 ° C. Alternativamente, vortex a mistura de reacção à temperatura ambiente(TA) durante 4 h. </li><li> Após a reacção de marcação, remover o excesso de fluoróforo usando uma coluna de dessalinização. <ol><li> Escorra tampão de armazenamento da coluna de dessalinização e lavar com 16 ml de água deionizada. Descarte todo o fluxo através. </li><li> Adicionar o COI marcado de forma fluorescente para a coluna de dessalinização. Elui-se com 1,2 ml de água desionizada e recolher o fluxo através. </li><li> Repetir passo de eluição mais quatro vezes, cada vez que a adição de 1,2 ml de água desionizada e recolhendo o fluxo através de uma amostra em separado. </li><li> Congelar todo o fluxo coletados através de amostras a -80 ° C e liofilizar de acordo com as instruções do fabricante para 24 horas. </li></ol></li></ol> 2. COI-carregado Preparação de Microesferas através da água-água-em óleo-em-emulsão usada solvente método de evaporação <ol><li> Adicionar 1 mg de COI marcado por fluorescência a 100 ul de água desionizada para formar a primeira fase de água (W1). </li><li> Dissolve-se 65 mg de poli (aci láctico-co-glicólicod) (50:50 lactido: glicolido de peso molecular 54000 - 69000) em 750 mL de diclorometano num tubo de microcentrífuga. Ultrasonicate para 10 - 30 segundos (a 160 W) para dissolver completamente o PLGA. Isto forma a fase de óleo (o). </li><li> Adicionar toda a fase W1 gerado no passo 2.1 para a fase S de uma forma gota a gota. Emulsionar usando um homogeneizador de mão a 20.000 rpm durante 30 segundos para formar a fase W1 / S. </li><li> Adicionar toda a fase W1 / S de uma maneira gota a gota a 15 ml de um 1% (peso / volume) de poli aquoso (álcool vinílico) de solução (PVA) e emulsionar usando um homogeneizador de mão a 20.000 rpm durante 30 seg . </li><li> Transferir todo da emulsão gerado no passo 2.4 para um 200 ml frasco de fundo redondo e sob um vácuo de 635 milímetros de Hg utilizando um evaporador rotativo durante 1 hora para remover o solvente e gerar a fase aquosa. </li><li> Alíquotas de 1 ml da fase aquosa gerado no passo 2.5 a catorze tubos de microcentrífuga. A centrifugação da solução aquosa no interior dos tubos de microcentrífuga a 7500xg durante 8 minutos. NOTA: Nesta etapa, as microesferas estão presentes na solução aquosa restante e concentrou-se para o fundo do tubo de microcentrífuga. </li><li> Cuidadosamente remover 900 ml de solução aquosa a partir dos tubos de microcentrífuga com uma micropipeta, pipetagem, de modo a não perturbar as microesferas na parte inferior do tubo de microcentrífuga. <ol><li> Lavam-se as microesferas de PVA em excesso por adição de 1 ml de água desionizada a cada tubo de microcentrífuga. Centrifugar a 7500 x g durante 8 min, e remover de novo cuidadosamente 900 ul de solução aquosa a partir dos tubos de microcentrífuga com uma micropipeta, pipetagem, de modo a não perturbar as microesferas na parte inferior do tubo de microcentrífuga. NOTA: A solução aquosa restante 100 ul contém as microesferas gerados. </li></ol></li><li> Congelar a solução aquosa de microesferas gerado no passo 2.7 a -80 ° C. </li><li> microesferas liofilizar num liofilizador utilizando de acordo com o fabricante doinstruções e armazenar a -20 ° C. NOTA: medir a eficiência de carregamento do COI dissolvendo completamente as microesferas de PLGA e a determinação da concentração de proteínas em relação a uma curva padrão de proteína livre 7. </li><li> Como controlo negativo, gerar um lote de microesferas &quot;em branco&quot; (doravante referidas como microesferas de controle). NOTA: A geração de microesferas de controlo é idêntica à geração de microsferas hidrófilas COI-carregados, sem adição de ICO a 800 ul da solução de veículo no passo 1.2. partículas de controlo de jogo em concentração em massa de PLGA em relação ao microesferas de PLGA COI-carregados para o ensaio mitogénio de células-β. </li></ol> 3. Preparação de Ilhota Meios de Cultura e Mídia Pré-ensaio <ol><li> Preparar 200 ml de meio de cultura de ilhotas intactas rato: meio RPMI 1640 suplementado com glucose 11 mM, soro de cavalo a 10%, 100 U / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina (daqui em diante referido como estádeixe meios de cultura). NOTA 1: Ao contrário de soro fetal de bovino (FBS), soro de cavalo carece lactogénio placentário, um indutor de proliferação de células β, que confunde análise no ensaio de proliferação. NOTA 2: À medida que as microesferas de PLGA não são esterilizados antes da utilização, a adição de antibióticos ao meio de cultura é crucial para evitar a contaminação microbiológica. </li><li> Retirar 25 ml de meio de cultura ilhéu com uma pipeta eletrônico e coloque em um tubo de 50 ml. Suplemento de 25 ml de meio de cultura ilhota no tubo de 50 ml com uma concentração final de 0,2 mM de EGTA para gerar o meio de pré-ensaio. NOTA: A adição de EGTA solta suavemente contatos célula-célula nas ilhotas sem alterar a arquitetura da ilhota. Isto ajuda a garantir o COI pode atingir as células internas da ilhota e ajuda a prevenir a necrose da ilhota central. </li></ol> 4. Cultura de Intact mouse Ilhotas <ol><li> Isolar ilhotas intactas a partir de uma estirpe de pré-selecionado, o sexo, AGE, e genótipo de murganhos após uma digestão com colagenase a 8,9 rotina de pâncreas. Piscina juntos ilhotas de como amostras. </li><li> Aliquota de 40 ilhéus em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços em 200 ul de meio de cultura das ilhotas. Visualmente ilhotas tamanho-fósforo por poço (uma avaliação precisa da equivalência das ilhotas (IEQ) entre as amostras não é necessário). Encha os poços vazios imediatamente adjacentes aos poços com ilhotas com 200 mL de água estéril para fornecer um buffer de evaporação. Cultura ilhotas em meios durante a noite a 37 ° C sob uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO 2. </li></ol> 5. Re-suspensão de microesferas de controle de PLGA COI-carregados e <ol><li> Após a recuperação da ilhota dia para o outro, microesferas ressuspender por adição de meio de pré-ensaio de uma alíquota de liofilizados microesferas de PLGA COI-carregado de tal modo que a concentração final de ICO no tubo de microcentrífuga é de 10 ng / ul (a quantidade de COI presentes numa dada quantidade de os micros geradospheres foi determinado no passo 2.9). Sonicar as microesferas ressuspensas COI-carregados em um banho de água gelada durante 10 minutos a 160 W com 10 seg longos impulsos a 4 ° C. </li><li> Ressuspender controlo microesferas de PLGA por adição do mesmo volume de meio de pré-ensaio para um volume igual de controlo liofilizado microesferas de PLGA. Sonicar os ressuspensos microesferas de PLGA de controlo num banho de água gelada durante 10 minutos a 160 W com 10 seg longos impulsos a 4 ° C. </li><li> Visualmente confirmar microsferas são dispersas por pipetagem 2 ul de microesferas ressuspensas entre duas lamelas de vidro. Visualize microesferas utilizando uma objectiva de 40x em um epifluorescência ou brightfield microscópio. </li><li> Se agregação significativa das microsferas é ainda visível, sonicado num banho de água gelada por mais 10 minutos adicionais a 160 W com 10 seg longos impulsos a 4 ° C e repetição visualização de microesferas ressuspenso. </li></ol> 6. Tratamento de Ilhotas com controle de PLGA Microesferas COI-carregados ou &lt;/ P&gt; <ol><li> Para cada cavidade a ser tratada com microesferas carregadas COI-, preparar meio de ensaio por diluição a 10 ng / ul de microesferas de COI ressuspensas em meio de pré-ensaio para um volume final de 100 ul e uma concentração final pré-determinada. NOTA: A concentração final óptima da proteína vai variar para cada COI utilizado para este ensaio. Idealmente, uma gama de concentrações finais são testadas. </li><li> Para cada cavidade a ser usada como um controlo, preparar controlo de meio de ensaio por diluição das microesferas de PLGA de controlo ressuspensos gerados no passo 5.2 com o mesmo volume de diluição utilizada para diluir as microesferas COI-carregados no passo 6.1. NOTA: As ilhotas tratadas com meio de ensaio de controlo irá servir como um controlo negativo para permitir a detecção de qualquer efeito das microesferas em branco pode ter sobre os resultados experimentais. </li><li> remover cuidadosamente 100 ul de meio de cultura ilhotas de cada poço com uma micropipeta de tal modo que não há ilhotas são desalojadas dos poços. Delicadamente adicionar 100 μl de meio de ensaio ou 100 ul de meio de ensaio de controlo a cada poço. </li><li> Incubar ilhotas a 37 ° C sob uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2 durante três dias. </li></ol> 7. A dispersão ilhotas intactas Onto lâminas de microscópio <ol><li> Após três dias, usar uma micropipeta cuidadosamente para remover e descartar meio de ensaio de todos os poços, de modo a não deslocar ilhotas. Delicadamente adicionar 200 mL PBS para ilhotas de lavá-los do meio de ensaio. Remova cuidadosamente e elimine PBS com uma micropipeta e lavar cuidadosamente ilhotas novamente com uma 200 ul adicionais PBS. </li><li> Remova e descarte PBS com uma micropipeta e adicione 100 ml de 0,025% de tripsina, a solução 2 mM EDTA. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Pipetar ilhotas na solução de tripsina-EDTA cima e para baixo a cada 2 min até ilhotas são visualmente confirmada a ser dispersos em células individuais (note que alguns pequenos aglomerados de células pode ainda estar presente) utilizando um microscópio de luz. Transferir todo o volume de cada poço individualLY em tubos de microcentrífuga labeled-. </li><li> Adicionar 400 ul de meio de cultura de ilhotas a cada tubo de microcentrífuga para parar a dissociação de células mediada por tripsina. </li><li> Centrifugar as amostras durante 5 minutos a 100 xg, a 4 ° C para sedimentar as células das ilhotas para o fundo de tubos de microcentrífuga. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta, e pellet ressuspender em 200 meios de cultura ilhéu ul fresco. </li><li> Usando uma cito-centrífuga, centrífuga dissociada ilhotas a 140 xg por 3 min em lâminas de microscópio carregadas. </li><li> Ar lâminas secar à temperatura ambiente durante 10 min, em seguida, desenhar uma caixa em torno das ilhotas dissociadas com uma caneta de marcação hidrofóbico. </li><li> Fixar as células com 75 uL de 4% de paraformaldeído (PFA) a TA durante 10 min. Remover PFA 4% e lavar cuidadosamente as células em 75 ul PBS duas vezes. Após a lavagem, permeabilizar as células com 75 uL de 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 10 min. Em seguida, lavar as células com 75 ul de PBS. Cuidado: PFA é conhecido por ser alergénicos, cancerígenos, e tóxico. </li></ol&gt; 8. Imunofluorescência Rotulagem de Dissociated Ilhotas de insulina ea proliferação celular Marker, Ki67 <ol><li> Preparar uma câmara úmida, colocando duas toalhas de papel molhado no fundo de uma caixa de slides capacidade microscópio 100 slide. </li><li> Colocar as lâminas planas para baixo (células voltadas para cima) em câmara úmida. Preparar as amostras para rotulagem por aspiração do PBS do passo de lavagem anterior, utilizando uma micropipeta e a adição de 75 ul de solução de bloqueio (5% normal asno soro (NDS) em PBS) a cada diapositivo para bloquear a ligação não específica de anticorpos contra os espécimes. Incubar as lâminas em solução de bloqueio durante 1 h à TA. </li><li> Delicadamente aspirado bloqueio solução usando uma micropipeta e adicionar 75 ul de solução de anticorpo primário contendo de cobaia anti-insulina de coelho e os anticorpos anti-Ki67, diluiu-se 1 ug / ml em 5% de NDS em PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h. NOTA: marcadores alternativos de proliferação celular incluem proliferando antigénio da célula nuclear (PCNA) e fosfohistone H3 (PH3), </li><li> Aspirar cuidadosamente solução de anticorpo primário utilizando uma micropipeta e lavar as células com 75 ul de PBS. Aspirar PBS utilizando uma micropipeta e lavar as células mais duas vezes, cada vez com 75 ul de PBS. Incubar cada amostra com 75 ul de anticorpo secundário anti-cobaia de Cy5 e Cy3 anticorpo secundário anti-coelho diluída a 2 ug / ml em solução de bloqueio durante 1 h à TA. NOTA: Não use anticorpos secundários marcados com o mesmo ou espectralmente sobreposição fluoróforo que já foi usado para rotular as microesferas. </li><li> A solução de anticorpo secundário aspirado utilizando uma micropipeta e incuba-se 75 ul de 300 nM DAPI em PBS durante 3 min a RT. Aspirar DAPI utilizando uma micropipeta e enxaguar em água desionizada, durante 5 min. </li><li> Gentilmente aspirar água de amostras utilizando uma micropipeta. Detectar uma gota (cerca de 100 L) de solução de montagem de secagem rápida contendo antifade reagente sobre uma lamela de vidro. Inverta o lado do microscópio amostra deslizar para baixo, onto a solução de montagem. Pressione suavemente as lamelas contra a lâmina utilizando uma ponta de pipeta para remover as bolhas e limpe o excesso de líquido com um tecido de limpeza macio. Permitir lamelas secar durante a noite à TA. </li></ol> 9. Aquisição de Imagem e Análise <ol><li> Use um microscópio de epifluorescência com uma câmera acoplada para aquisição de imagem. Para cada fluoróforo, determinar o tempo de exposição óptimo (tipicamente 20 ms para DAPI, 40 - 80 mseg para insulina, e 250 mseg de Ki67). Certifique-se de parâmetros de aquisição de imagem são iguais para todas as amostras. </li><li> Para cada amostra, contar manualmente 3.000 células de insulina-positivos e dos que contar quantos são também Ki67-positivas. Quantidade de apenas as células de insulina positivas que têm um núcleo bem definida e claramente visíveis. Calcula-se a percentagem de proliferação de células-p para cada amostra dividindo o número de células de Ki67-positivas / insulina-positivo pelo número total de células de insulina positivas e multiplicando por 100. </li><li> Depois determining a percentagem de proliferação de células-p, para cada amostra para determinar se uma diferença estatisticamente significativa na proliferação de células β existe entre o controlo e amostras experimentais por análise de resultados com um ANOVA de uma via utilizando o software estatístico disponível comercialmente. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease.">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O estudo da proliferação de células β em cultura é normalmente prejudicada por várias dificuldades. Em primeiro lugar, as linhas de células imortalizadas β são caracterizados por níveis mais elevados de proliferação do que o que é encontrado em células beta em ilhéus endógenos vivo. Além disso, estas linhas de células imortalizadas não têm a arquitetura normal crítico para a função das células β normal. Estes dois factos fazem com que seja difícil para determinar se os resultados obtidos utiliz...

células beta pancreáticas são as únicas células produtoras de insulina no corpo e são essenciais para manter a homeostase da glicose do sangue. Quando os indivíduos saudáveis possuem massa suficiente de células β e funcionar para regular adequadamente a glicose no sangue, indivíduos com diabetes são caracterizados pela insuficiente massa de células β e / ou função de 1,2. Foi proposto que a indução da proliferação de células β em última instância pode aumentar a massa de células β e restaurar a homeostase de glucose em indivíduos com diabetes 3. No entanto, é necessária a avaliação e validação de potenciais compostos de proliferação de células β em ilhotas intactas antes de terapias eficazes podem ser desenvolvidas. O transplante de ilhotas humanas de cadáveres em indivíduos com diabetes restaura a homeostase da glicose no sangue durante algum tempo, mas a disponibilidade e sucesso deste procedimento experimental é dificultada pela escassez de ilhotas humanos disponíveis para transplante e pela morte das células beta nas ilhotas rétransplante er 4. Mesmo com a descoberta de factores que induzem a multiplicação das células produtoras de insulina, um grande desafio ainda existe no fornecimento destes factores a locais relevantes in vivo. Uma estratégia para a entrega local sustentada de compostos proliferativas de células β é ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA). PLGA tem uma história de uso na FDA aprovou produtos de entrega de drogas devido à sua alta segurança, biodegradabilidade, e cinética de libertação prolongada 5. Especificamente, é um copolímero de PLGA de lactido e glicolido que degrada por meio de hidrólise com água in vivo ou em cultura em ácido láctico e ácido glicólico, que são metabolitos que ocorrem naturalmente no corpo. O composto de fármaco encapsulado possa ser libertado no ambiente circundante por ambos difusão e / ou mecanismos de libertação controlada por degradação. A encapsulação de COI proporciona protecção contra a degradação enzimática, melhorar a biodisponibilidade do reagente em relação ao unencapsulated COI 5. Sugerimos que as microesferas de PLGA podem ser usadas para administrar compostos candidatos para ilhotas intactas em cultura, e, finalmente, in vivo. Testar a eficácia de PLGA para administrar agentes mitogénicos de células β para ilhotas ex vivo é crítico antes de protocolos de transplante são exploradas. Actualmente, não existe uma técnica para medir a proliferação de células β em animais vivos. Experimentos para avaliar a eficácia de compostos potenciais de proliferação in vivo, portanto, requerem administração destes compostos a animais vivos, com dissecção posterior e processamento de pancreata para imunomarcação. Tais protocolos são caros e laborioso, e requer o composto a ser administrada sistemicamente, sem qualquer garantia de que eles vão atingir as ilhotas. Por outro lado, várias linhas de células imortalizadas β estão disponíveis para o estudo de células produtoras de insulina em cultura, mas estas linhas de células têm a arquitectura dos ilhéus e ENVIRONMENt encontrada em organismos vivendo 6. Linhas de células imortalizadas β são também caracterizados como tendo um grau muito mais elevado de replicação de células beta endógeno in vivo, complicando, assim, a análise dos compostos que induzem a proliferação. Neste estudo, descrevemos um protocolo que utiliza ilhotas intactas isoladas a partir de ratinhos adultos. Ao contrário de linhas de células-β, ilhotas intactas reter arquitetura normal das ilhotas. Do mesmo modo, em contraste com experiências realizadas in vivo, a administração de compostos proliferativas directamente para ilhotas intactas em cultura reduz significativamente a quantidade de reagentes que é necessário para medir com precisão a proliferação de células β. O estudo actual utiliza PLGA para administrar um COI, neste exemplo, crescimento de tecido conectivo do Factor humano recombinante (rhCTGF). O método aqui descrito confere uma vantagem significativa sobre a administração do composto em bruto de ilhotas de cultura, uma vez que permite uma libertação contínua do composto em the meios de comunicação. Notavelmente, este ensaio pode ser modificado para administrar uma ampla variedade de proteínas e anticorpos de interesse para ilhotas intactas. Efeitos sobre outros tipos de células endócrinas, incluindo células-ct, também podem ser analisados.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>For labeling COI with fluorophore</td></tr><tr><td>DMSO Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>For dissolving fluorophore in step 1</td></tr><tr><td>Disposable PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Desalting column used in step 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Dextrose Anhydrous</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibiotics for islet media</td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Supplement for pre-assay islet media</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Used in dissociating islets</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>For fixing cells</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>For permeabilizing cells</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Blocking reagents for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 antibody</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>For nuclei visualization in immunofluorescence</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Fast drying mounting media</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &amp;deg;C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>For lyophilization of microspheres</td></tr></tbody></table>

sustained administration of &#946;-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres

O desenvolvimento de biomateriais aumentou significativamente o potencial para a entrega de drogas alvo para uma variedade de tipos de células e de tecidos, incluindo as células beta pancreáticas. Além disso, biomateriais partículas, hidrogéis, e andaimes também oferecem uma oportunidade única para administrar sustentada, a entrega de drogas controlável a p-células em cultura e em modelos de tecidos transplantados. Estas tecnologias permitem o estudo de fatores de proliferação de células β candidato usando ilhotas intactas e um sistema de translação relevante. Além disso, determinar a eficácia ea viabilidade de fatores candidatos para estimular a proliferação de células β em um sistema de cultura é fundamental antes de avançar para modelos in vivo. Aqui, nós descrevemos um método para co-cultura ilhotas intactas rato com o composto biodegradável de interesse (COI) poli -loaded (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) com a finalidade de avaliar os efeitos das sustentada in situ release of factores mitogénicos sobre a proliferação de células β. Esta técnica descreve em detalhe como gerar microesferas de PLGA contendo uma carga desejado, utilizando reagentes disponíveis comercialmente. Embora a técnica descrita utiliza factor de crescimento humano recombinante conjuntivo tecido (rhCTGF) como um exemplo, pode ser prontamente utilizada uma ampla variedade de COI. Além disso, este método utiliza placas de 96 poços para minimizar a quantidade de reagentes necessários para avaliar a proliferação de células β. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para utilizar biomateriais alternativos e outras características da célula endócrina, tais como a sobrevivência de células e estado de diferenciação.

A Figura 1 é uma representação visual das microesferas geradas utilizando o protocolo anterior. O protocolo aqui descrito proporciona microesferas rhCTGF-carregada de vários tamanhos. A maior fracção de microsferas vai situar-se entre 1 e 10 um de diâmetro, embora algumas microsferas que podem ser maiores (Figura 2). Se desejado, o tamanho de microsferas pode ser ajustada e optimizada com base em parâmetros de fabrico, tais como ...

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Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Usando biodegradável poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K visualizações.  Vanderbilt University Medical Center. Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

Vídeo: Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

Geração de alginato Microesferas para aplicações biomédicas

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Medicina

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Bioengenharia

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and survival post-transplantation. This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using an ultrathin heparin-incorporated starPEG (Hep-PEG) nanocoating. To generate the Hep-PEG nanocoating for pancreatic islet surface engineering, heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS) was first synthesized by modification of its carboxylate groups using N-(3-dimethylamino propyl)-N'-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The Hep-PEG mixture was then formed by crosslinking of the amino end-functionalized eight-armed starPEG (starPEG-(NH2)8) and Heparin-NHS. For islet surface coating, mouse islets were isolated via collagenase digestion and gradient purification using Histopaque. Isolated islets were then treated with ice cold Hep-PEG solution for 10 min to allow covalent binding between NHS and the amine groups of islet cell membrane. Nanocoating with the Hep-PEG incurs minimal alteration to islet size and volume and heparinization of the islets with Hep-PEG may also reduce instant blood-mediated inflammatory reaction during islet transplantation. This "easy-to-adopt" approach is mild enough for surface engineering of living cells without compromising cell viability. Considering that heparin has shown binding affinity to multiple cytokines, the Hep-PEG nanocoating also provides an open platform that enables incorporation of unlimited functional biological mediators and multi-layered surfaces for living cell surface bioengineering.

This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using a heparin-incorporated starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemistry between the N-hydroxysuccinimide groups of the nanocoating and the amine groups of islet cell membrane.

Engenharia de superfície de ilhotas pancreáticas com uma nanocápsula StarPEG heparinizado

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

A-alta conteúdo<em&gt; In Vitro</em&gt; Replicação plataforma de descoberta de células-β das ilhotas pancreáticas

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Um Método para Mouse ilhotas pancreáticas Isolamento e intracelular cAMP Determinação

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologia

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In Vitro Pâncreas Organogenesis de dispersos rato embrionárias Progenitores

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Administração sustentada dos mitógenos de células β para intactas mouse Ilhotas

Resumo

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