Este protocolo foi projetado para investigar o crosstalk de células epiteliais e células imunes inatas de primeira linha, especificamente células T inatas, que é o nosso interesse. Células primárias de fontes humanas são usadas nesta técnica, permitindo a investigação individual do crosstalk fisiológico relevante para o que está acontecendo em humanos. Células T inatas foram implicadas em melhorar a sobrevivência de pacientes infectados pela gripe.
Saber como eles são ativados pode ajudar no desenvolvimento de anti-influenza e terapia antiviral. Este método foi projetado para identificar fatores que podem ativar as células T inatas, o que pode ajudar no desenvolvimento de medidas preventivas contra a infecção por vírus respiratório. No dia zero, infecte células epiteliais nasais humanas, ou HNECs.
Primeiro, conte as células adicionando 150 microliters de 1x trypsin EDTA à câmara apical da inserção da membrana e 350 microliters de 1x trypsin EDTA à câmara basal do poço representativo. Incubar as células a 37 graus Celsius por 10 minutos ou até que as células se desprendem da membrana. Lave as células na membrana tubondo para cima e para baixo e colete a suspensão em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro.
Adicione 200 microliters de DMEM para saciar a atividade de trypsin. Em seguida, conte células através de coloração azul trypan. Calcule a multiplicidade necessária de infecção, ou MOI, do vírus com base na contagem celular por poço.
Diluir o estoque do vírus de acordo com o RPMI completo no gelo. Para os demais poços para o experimento de infecção, adicione um 1x DPBS nas câmaras apical das pastilhas de membrana. Incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos e remover o 1x DPBS.
Altere o meio basal nas pastilhas de membrana para completar o meio RPMI transferindo as pastilhas para uma nova placa com RPMI completo adicionado aos poços. Adicione o inóculo do vírus preparado na câmara apical da inserção da membrana. Incubar a 35 graus Celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% por uma hora e remover o inóculo viral da câmara apical.
Mude o meio basal da membrana para meio RPMI fresco e incubar a 35 graus Celsius em uma atmosfera de dióxido de carbono de 5% por 24 a 72 horas. Semente o número necessário de células mononucleares de sangue periféricos, ou PBMCs, em meio RPMI completo, adicionando diretamente a suspensão PBMC na câmara basal de cada poço de HNECs infectados a partir do dia zero. Incubar a 37 graus Celsius por 24 a 48 horas.
Para coletar o supernatante apical, adicione 1x DBPS a cada câmara apical e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, recolhe o DPBS em tubos de 1,5 mililitro. Aliquot o supernatante para o ensaio da placa em um novo tubo de 1,5 mililitro e congele imediatamente tanto o estoque quanto as alíquotas a menos 80 graus Celsius.
Para coletar HNECs de forma de RNA, transfira a pastilha da membrana para um poço limpo. Adicione tampão de rna à câmara apical e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Colete o supernante em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e armazene-o a menos 80 graus Celsius até a extração de RNA para análise molecular.
Finalmente, colher PBMCs raspando suavemente a superfície do poço com a base ampla de uma ponta de pipeta estéril para desalojar os PBMCs ativados que podem ser aderentes à superfície do poço. Colete o meio basal contendo PBMCs em um tubo de centrífuga de dois mililitros. Lave os poços duas vezes com 300 microliters de 1x DPBS e colete a lavagem no mesmo tubo de dois mililitros.
Centrifugar o tubo de dois mililitros e coletar o supernatante em um tubo fresco de dois mililitros sem perturbar a pelota celular. Armazene o supernatante aspirado a menos 80 graus Celsius para análise de citocina e quimioterapia. Resuspende a pelota de célula restante em 200 microlitres de 1x DPBS.
Este protocolo pode ser usado para estudar células T inatas após a infecção por influenza sem a necessidade de células epiteliais e imunes do mesmo doador. Uma amostra da progressão esperada dos HNESPCs à medida que crescem na camada alimentador 3T3 é mostrada aqui. Estes foram utilizados para diferenciação na cultura de interface ar/líquido para obter HNECs multicamadas com células funcionais, ciliadas e cálices.
Usando os HNECs, a ativação de células T inatas pode ser investigada usando citometria de fluxo. Esses resultados mostram a detecção de células T invariantes associadas à mucosa, ou células MAIT, V delta um, células Gamma delta T, e as células T assassinas naturais, ou NKT. Essas células foram significativamente aumentadas na cocultura envolvendo HNECs infectados com vírus da gripe.
Essa configuração pode então ser aplicada a outras cepas de vírus da gripe, ou populações de células imunes inatas para observar sua respectiva ativação sob condições de co-cultura com células epiteliais infectadas. O cálculo preciso do número das células epiteliais nasais humanas para garantir que a multiplicidade certa de infecção seja usada é importante para níveis ideais e tempo de ativação. O crosstalk entre células epiteliais e células imunes inatas está cada vez mais ganhando atenção, e isso pode ser aplicado ainda mais a quaisquer outros métodos que envolvam imunologia respiratória aguda ou crônica.
