Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (AR-49419, DD), Associação de Distrofia Muscular (DD), e treinamento NIH concessão T90DK70105 (CH).

1. Avaliação das propriedades contráteis e passiva da EDL vivo Muscle Ex As propriedades contráteis e passiva do músculo EDL são medidos ex vivo utilizando o Scientific Aurora in vitro sistema de teste muscular. Consulte a Tabela 1 para materiais e equipamentos. 1.1 Preparação Equipment <ol><li> Montar o banho de tecido de órgãos, assegurando o oxytube ao banho de tecidos da água da camisa. Anexar o banho montadas para o aparelho de montagem de músculo. Conecte a linha de gás para o oxytube. Fixar as linhas de circulação de água para o banho de tecido de jaqueta de água e colocar a válvula de agulha no interior do banho de drenagem. </li><li> Ligar o banho de água circulante e ajustar a temperatura a 30 ° C 7. Permitir 5 PSI (libras por polegada quadrada) de 95% de O 2 -5% CO 2 a fluir através do oxytube. Encha a banheira com tampão de Ringer. Equilibre a memória intermédia para, pelo menos,10 min, com um fluxo de gás constante, ajustando a válvula de oxytube. </li><li> Ligue os instrumentos (estimulador, de modo duplo sistema de alavanca, e interface de sinal). Carregue a dinâmica muscular controlo de software (DMC) de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 1,2 dissecção músculo EDL Todos os estudos com animais devem ser aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de uso. <ol><li> Anestesiar o rato com injeção intraperitoneal de 2,5 ul / g de peso corporal do coquetel anestésico (consulte a seção de materiais). Durante todo o procedimento cirúrgico, a profundidade de sedação foi verificada através da realização de um aperto do dedo do pé. Um suplemento de 10% da dose inicial do anestésico é administrado quando necessário para manter o animal sob anestesia. Raspar o membro posterior. Manter a temperatura interna do corpo a 37 ° C antes do procedimento de dissecção colocando o rato sobre uma almofada de aquecimento. A temperatura do corpo é monitorizada por medição da temperat constante rectalure utilizando uma sonda térmica. </li><li> Posicione o mouse sobre a supina bordo dissecção (Figura 1). Retire a pele da perna para expor os músculos dos membros posteriores. Fixar a perna no bloco Sylgard usando dois pinos costureira, uma em pé e outra no músculo gracilis. Coloque uma lâmpada de calor acima do corpo do rato para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Constantemente superfuse todos os músculos expostos com tampão de Ringer. Drenar o excesso de tampão por meio de uma linha de vácuo. </li><li> Expor o tendão distal TA eo ligamento extensor sob estereomicroscópio dissecando a pele para o pé. Remova cuidadosamente a fáscia que cobre o músculo TA. Cortar o ligamento extensor para liberar o tendão distal TA. </li><li> Cortar o tendão distal TA e usá-lo para descolar do músculo TA. Remova cuidadosamente o músculo TA em seu anexo proximal. Coloque um pedaço fino de algodão embebido em tampão de Ringer ao lado do músculo EDL para absorver hemorragia causada pela ruptura da vasculatura do músculo TA. Utilizar a linha de vácuo para remover o excesso de tampão e sangue. </li><li> Atar um nó duplo quadrados seguido de um nó do laço usando uma sutura de seda de pão na junção tendão do músculo (MTJ) do músculo EDL distal (Figura 2). Fazer uma incisão na porção distal do músculo biceps femoris para expor o músculo EDL proximal. Repetir o mesmo conjunto de nós (Figura 2) na MTJ do tendão proximal EDL. Prenda o gancho do braço de alavanca para tanto o proximal ou os nós distais com um nó duplo quadrado usando a mesma linha de sutura. Cortar a linha de sutura restante. </li><li> Cortar o tendão proximal EDL superior ao nó de sutura proximal. Levantar-se o músculo EDL com o gancho e cortar a vasculatura por baixo do músculo. Cortar o tendão distal EDL inferior para o nó de sutura distal para remover o músculo EDL a partir do membro posterior. Cobrir o membro exposto posterior com um pedaço de algodão Ringer tampão encharcado. </li><li> Prenda o gancho ao braço de alavanca. Alinhar o músculo verticalmenteentre dois eletrodos. Fixe a linha de sutura distal ao posto fixo. Levante o banho de tecido para submergir o músculo em tampão de Ringer. Ajustar a tensão de repouso de 1,0 g utilizando o estágio de translação dupla grossa / fina e permitir que o músculo se equilibrar durante pelo menos 10 min. </li></ol> 1,3 medir as propriedades contráteis e passiva do músculo EDL Use a Tabela 2 para configurar os parâmetros no software DMC para cada uma das medidas a seguir. Analisar os dados usando a análise muscular dinâmica (DMA) de software. 1.3.1 A medição das propriedades contráteis do músculo EDL <ol><li> Estimular o músculo EDL três vezes a 150 Hz com 60 seg para além de estabilizar a musculatura 8. </li><li> Estimular o músculo EDL com diferentes tensões de repouso para determinar o comprimento óptimo (Lo). O comprimento ideal é o comprimento no qual o músculo desenvolve tensão contração máxima. Permitir que o músculorelaxar durante 2 minutos. </li><li> Ajuste a tensão de repouso para Lo. Medir a força muscular em contração estimulação única. Determinar a força de contracção absoluta (Pt), tempo para o pico de tensão (TPT) e tempo de semi-relaxamento (½ RT) do Pt. Permitir que o músculo para relaxar durante 2 minutos. </li><li> Ajuste a tensão de repouso para Lo. Medir a força muscular tetânica gerado em diferentes frequências de estimulação (50, 80, 100, 120, 150 e 200 Hz). Determine a força muscular absoluta tetânica máxima (Po), onde a força muscular atinge o máximo. Meça a TPT e ½ RT do Pó 9. </li><li> Permitir a relaxar o músculo durante 5 min. Ajuste a tensão de repouso para Lo. Aplicar 10 ciclos de contrações excêntricas com 2 min de repouso entre os ciclos. Calcular a perda de força relativa do Po após cada ciclo de contração excêntrica. </li><li> Separe o músculo EDL do aparelho e cortar os tendões no local da sutura. Determinar o peso do músculo molhado e calcular a área transversal muscular seccional (CSA)6,10. </li></ol> 1.3.2 A medição das propriedades passivas do músculo EDL <ol><li> Dissecar o músculo contralateral EDL e anexá-lo ao aparelho, como descrito na Seção 1.2, as etapas de 2 a 7. </li><li> Submeter o músculo EDL com um protocolo de seis passos de alongamento em que o músculo é esticado em 160% Lo com um incremento de 10% Lo. Analisar o perfil 6 tensão-deformação. </li><li> Avaliar a propriedade viscoso do músculo EDL através da medição da taxa de relaxação de tensão (SRR) nos seguintes intervalos de tempo após o alongamento e segurando o músculo em Lo de 10%: de pico-a-pico de 0,1 s de pós-(pp), de 0,1 a 0,2 s pp, de 0,2 a 0,5 s pp, de 0,5 a 1s pp e de 1 a 1,5 s pp </li><li> No final do estudo, a eutanásia por deslocamento cervical do rato e / ou a decapitação, enquanto o rato é ainda sob anestesia. Separe o músculo EDL do aparelho e cortar os tendões no local da sutura. Determinar o peso do músculo molhado e calcular o músculo cruz sectional área (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. Avaliação das Propriedades contrátil do músculo TA in situ As propriedades contráteis do músculo TA são mensurados usando a Scientific Aurora no sistema músculo situ teste. Consulte a Tabela 1 para materiais e equipamentos. 2.1 Preparação de Equipamento <ol><li> Aquece-se a fase de termo-controlado dos animais a 37 ° C usando a água circulante banho. </li><li> Ligue os instrumentos (estimulador, de modo duplo sistema de alavanca, e interface de sinal). Carregue o software DMC de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 2.2 Preparação do músculo TA na medição de força situ <ol><li> Anestesiar o rato, fazer a barba do membro posterior e expor o músculo TA, como descrito nos passos 1 a 3 na Seção 1.2. </li><li> Dê um nó duplo quadrado ao redor da patela ligamento using de uma sutura de seda de pão. Dê um nó duplo quadrado seguido por um nó do laço no MTJ do músculo TA distal (Figura 2), amarrar outro nó duplo quadrado deixando um laço ~ 10 mm a partir do nó distal TA tendão utilizando a mesma linha de sutura. Coloque o nó duplo segundo quadrado no lado do circuito. </li><li> Remova os pinos do membro posterior e posicionar o animal de bruços. Expor o músculo bíceps femoral. Faça uma incisão na linha média para revelar o nervo ciático. Dê um nó duplo quadrado ao redor da extremidade proximal do nervo ciático. Aparar um dos lados das linhas de sutura e cortar o nervo superior ao nó. Delicadamente, puxe o nervo ciático em direção ao joelho usando a linha de sutura e limpar o tecido conectivo a livre ~ 5 mm do seu comprimento. Não esticar o nervo durante este procedimento e constantemente superfuse o nervo com tampão de campainha. </li><li> Prepare o músculo TA contralateral como descrito nos passos 1 a 3. Cobrir um do membro posterior exposta com um pedaço de Ringer tampão de algodão embebido. Constantemente superfuse ambos os membros posteriores com pré-aquecido (37 ° C) de tampão de Ringer. Remover o excesso de tampão por meio de uma linha de vácuo. </li><li> Posicione o animal propenso na plataforma animal. Instale o suporte de fixação do joelho para a plataforma animal e proteger os joelhos para o pino de metal com o dobro nós quadrados usando as linhas de sutura do ligamento patelar. Pin os dois pés sobre o bloco Sylgard usando pinos costureira. Fixe a plataforma de animais no palco termo-controlada. Posicionar a lâmpada de aquecimento para manter a temperatura corporal central de animais, a 37 ° C. </li><li> Fixar o suporte de eléctrodo para a plataforma de animais e colocar o nervo ciático no eléctrodo utilizando a linha de sutura. Manter o eléctrodo de distância dos músculos dos membros posteriores. Cortar o tendão TA distal do membro posterior descoberta no local da sutura MTJ. Fixe a distal TA laço de sutura do tendão ao gancho do braço de alavanca. Cubra o músculo do membro exposto posterior com um algodão Ringer quente de tampão encharcado. </li></ol><ol><li> Use a Tabela 2 para definir os parâmetros no software DMC. Siga o mesmo protocolo descrito na Seção 1.3.1 para determinar as propriedades contráteis do músculo TA. Analisar os dados usando o software DMA. </li><li> Após a medição propriedade contrátil, retire a distal TA laço de sutura do tendão do gancho braço nivelador. Retire o músculo TA. Determinar o peso do músculo molhado e calcular o CSA 10. </li><li> Medir as propriedades contrácteis do músculo TA contralateral acordo com os passos 1-3 descritos acima. Eutanásia do rato de acordo com directrizes institucionais, no final do estudo. </li></ol>

<ol>
	<li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite:+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb.">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li><li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle.">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li><li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin:+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus.">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li><li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction.">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li><li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age.">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li><li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice.">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li><li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro.">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li><li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress.">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li><li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle.">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li><li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy.">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo, que ilustramos ensaios fisiológicos para medir as propriedades contráteis e passiva músculo EDL e as propriedades contráteis do músculo TA. Uma grande preocupação em estudos de fisiologia do músculo é a oxigenação do músculo alvo. Para grandes músculos (tais como o músculo TA), o na abordagem in situ é a preferida porque a difusão de oxigénio a partir de tampão de Ringer não pode atingir o centro do músculo em um ensaio in vitro. Na abordagem situ não perturbe suprimento de sangue normal e hipóxia associada efeitos artificiais são evitados. O músculo EDL é um dos músculos mais comumente utilizado no estudo da fisiologia. Oxigenação adequada do músculo inteiro pode ser conseguida em um sistema in vitro devido à pequena dimensão do músculo. Além disso, o sistema in vitro fornece um ambiente fechado para manipular a concentração de iões (Ca 2 +, Na + e K +) e chemicals (ATP e glicose), que são necessárias para a produção óptima força muscular. Isto oferece uma grande oportunidade para estudar o efeito dessas variáveis ​​na produção de força. Uma medição precisa das propriedades contrácteis e passiva do músculo do membro é crítica para estudar a função do músculo esquelético. Alterações características dessas propriedades são muitas vezes consideradas como as características de várias doenças musculares. As mudanças nestes parâmetros também são indicadores importantes para determinar se uma terapia experimental é eficaz ou não.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material </td><td> Fabricante </td><td></td><td> Especificações e comentários </td></tr><tr><td> Tecido do órgão-banho </td><td> Radnoti LLC, CA, EUA </td><td></td><td> De jaqueta de água banho de tecido (Cat # 158351-LL), tubo de oxigênio dispersor (Cat # 160192), válvula Luer (Cat # 120722) </td></tr><tr><td> Circulando banho de água </td><td> Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mistura de gases </td><td> Airgas Nacional, Charlotte, NC, EUA </td><td></td><td> 95% O 2 e 5% CO 2 </td></tr><tr><td> In vitro aparelho de ensaio da função muscular </td><td> Aurora Científica, Aurora, ON, Canadá </td><td></td><td> O sistema consiste de um estimulador (Modelo # 701A), um sistema de alavanca de modo duplo (Modelo # 300C ou 305C), uma interface de sinal (Modelo # 604B) e um teste aplhos (Modelo # 800A) para montar verticalmente banho de órgãos de tecidos </td></tr><tr><td> No ensaio in vitro de software da função muscular </td><td></td><td></td><td> Dinâmica muscular controle de software (DMC) e dinâmica muscular controle de análise de dados (DMA), software </td></tr><tr><td> Cocktail rato anestesia misturados em NaCl a 0,9% </td><td> Consulte as diretrizes institucionais </td><td></td><td> De cetamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / ml) e acepromazina (0,5 mg / ml). Durante todo o procedimento cirúrgico, um suplemento de 10% da dose inicial pode ser necessário para manter animais sob anestesia. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Instrumento de precisão mundo </td><td> Cat # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> A custom-made bordo dissecção Plexiglas </td><td> Na casa projetada </td><td></td><td> Consulte a Figura 1 </td></tr><tr><td> Lâmpada de aquecimento </td><td> Tensor Companhia Luz,Boston, MA, EUA </td><td></td><td> 15 Watt lâmpada para manter o aquecimento do mouse durante a dissecção </td></tr><tr><td> Tampão de Ringer </td><td> Os produtos químicos são adquiridos de Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA </td><td></td><td> Composição em mM: 1,2 NaH 2 PO 4 (Cat # S369), 1 MgSO4 (Cat # M63), 4,83 KCl (Cat # P217), 137 NaCl (Cat # 217), 24 NaHCO 3 (Cat # S233), 2 CaCl 2 (Cat # C79) e 10 de glucose (Cat # D16). Dissolver e misturar os produtos químicos individualmente na ordem listada acima. Armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecação estéreo </td><td> Nikon, Melville, NY, EUA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Instrumentos de dissecação </td><td> Belas Ferramentas ciência, Foster City, CA, EUA </td><td></td><td> Fórceps, tesoura grosseiros grosseiros, pinças finas (reto e ângulo de 45 °) </td></tr><tr><td> Trançado fio de seda # 4-0 </td><td> SofSilk USSC Suturas, Norwalk, CT, EUA </td><td> Cat # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> A custom-made gancho de aço inoxidável </td><td> Peças pequenas, Inc. </td><td></td><td> 2&#39;&#39; de comprimento S / S 304V (0,18&#39;&#39; de diâmetro) para transdutor de força 305C ou 2,5&#39;&#39; de comprimento S / S 304V (0,012&#39;&#39; de diâmetro) para o transdutor 300C (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> No sistema de ensaio in situ da função muscular </td><td> Aurora Científica, Aurora, ON, Canadá </td><td></td><td> O sistema (809B, num aparelho de rato in situ) são constituídos de um estimulador (modelo # 701B), um sistema de alavanca de modo duplo (Modelo # 305C), uma interface de sinal (Modelo # 604A) e um aparelho de termo-platina controlada (Modelo # 809A ) </td></tr><tr><td> No ensaio in vitro de software da função muscular </td><td> Aurora Científica, Aurora, ON, Canadá </td><td></td><td> Dinâmica muscular controle de software (DMC) e dinâmica muscular controle de análise de dados (DMA), software </td></tr><tr><td> A custom-made TA plataforma de animais de ensaio </td><td> Na casa projetada </td><td></td><td> Consulte a Figura 2 </td></tr><tr><td> A custom-made gancho de aço inoxidável </td><td> Peças pequenas, Inc. </td><td> Cat # ASTM A313 </td><td> 0,5&#39;&#39; de comprimento S / S 304V (0,18&#39;&#39; de diâmetro) </td></tr><tr><td> Custom-made 25G eletrodos de platina </td><td> Chalgren Enterprises, Gilroy, CA </td><td></td><td> Solda dois 0,016&#39;&#39; grossos fios de platina para dois 24G fios elétricos </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Materiais e equipamento.

evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice

Os movimentos do corpo são fornecidos principalmente por função mecânica do músculo esquelético. O músculo esquelético é composta de feixes de numerosos miofibras que são revestidos por tecidos conjuntivos intramusculares. Cada fibra muscular contém muitas miofibrilas que correm longitudinalmente ao longo do comprimento da fibra muscular. Miofibrilas são o aparato contrátil do músculo e que são compostos de unidades repetidas contrácteis conhecidos como sarcômeros. Uma unidade sarcômero contém filamentos de actina e miosina que estão espaçados pelos discos Z e proteína titina. A função mecânica do músculo esquelético é definido pelas propriedades contrácteis e passiva do músculo. As propriedades contrácteis são utilizadas para caracterizar a quantidade de força gerada durante a contracção do músculo, o tempo de geração de força e do tempo de relaxamento muscular. Qualquer fator que afeta a contração muscular (como a interação entre filamentos de actina e miosina, homeostase do cálcio, ATP / ADP relação, etc) influencia a prope contrátilrties. As propriedades passivas referem-se às propriedades elásticas e viscosas (rigidez e viscosidade) do músculo, na ausência de contracção. Estas propriedades são determinadas pela extracelular e os componentes estruturais intracelulares (tais como titina) e tecido conjuntivo (principalmente colagénio) 1-2. As propriedades contráteis e passiva são dois aspectos inseparáveis ​​da função muscular. Por exemplo, a flexão do cotovelo é conseguida pela contracção dos músculos do compartimento anterior do braço superior e estiramento passivo dos músculos no compartimento posterior da parte superior do braço. Para compreender verdadeiramente a função muscular, ambas as propriedades contráteis e passiva deve ser estudado. As propriedades contráteis e / ou passiva mecânicas do músculo são muitas vezes comprometida em doenças musculares. Um bom exemplo é distrofia muscular de Duchenne (DMD), um músculo desperdiçando grave doença causada por deficiência de distrofina 3. Distrofina é uma prote cytoskeletalna medida em que estabiliza a membrana celular do músculo (sarcolema) durante 4 contracção muscular. Na ausência de distrofina, o sarcolema é danificado pela força de corte geradas durante a transmissão da força. Esta membrana rasgando inicia uma reacção em cadeia que leva à morte da célula muscular e perda de maquinaria contráctil. Como consequência, a força muscular é reduzida e miofibras mortas são substituídos pelos tecidos fibróticos 5. Esta alteração posterior aumenta rigidez muscular 6. A medição precisa destas mudanças fornece guia importante para avaliar a progressão da doença e para determinar a eficácia terapêutica do novo gene / célula / intervenções farmacológicas. Aqui, apresentamos dois métodos para avaliar as propriedades contráteis e passiva mecânicas do extensor longo dos dedos (EDL) muscular e as propriedades contráteis do músculo tibial anterior (TA).

Os resultados seguintes são uma representação dos seus relatórios anteriores 6,9. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média. A Tabela 3 mostra as propriedades morfométricas do músculo EDL em BL10 normais e deficientes em distrofina (mdx) ratos em 4 a 6 meses de idade. Figura 4 mostra representativos propriedades contrácteis e passiva do músculo EDL de BL10 e mdx ratos. As propriedades contrácteis do músculo EDL são descritos pelos termos seguintes, incluindo o (força absoluta dividida pela CSA) específico força twitch (Figura 4A), a força tetânica específica máxima (Figura 4B), TPT e ½ RT da força máxima absoluta tetânica (Figura 4C e D). O TPT e ½ RT também pode ser calcular a força de contração absoluta. O perfil de tensão-deformação (Figura 4E) e SRR (Figura 4F) umre utilizado para descrever as propriedades passivas do músculo EDL. Ausência de distrofina tem um impacto significativo sobre as propriedades contráteis e passiva do músculo EDL 6,9. Twitch específico e as forças tetânica são reduzidos significativamente no músculo EDL mdx. O TPT é significativamente mais rápido, enquanto o ½ RT é significativamente mais lenta no músculo EDL mdx. O perfil de tensão-deformação sugere que a rigidez é aumentada significativamente no músculo EDL mdx. O mdx músculo EDL também produz uma força de resistência significativamente muito maior (stress passiva) antes de chegar ao pico de tensão, enquanto as tensões pós-pico declinar muito mais rápido. Além disso, o SRR foi significativamente mais elevada no músculo EDL mdx em comparação com a do músculo EDL BL10. A análise estatística Significância estatística entre os dois grupos é analisada pelo teste t de Student. Para ssignificado tatistical entre vários grupos, de uma forma ou de duas vias análise de variância, seguido de análise post hoc Bonferroni é recomendada a utilização do software SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). Diferença é considerado significativo quando p &lt;0,05. Tabela 1. Materiais e equipamento. <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> Experiência </td><td class="jove_content_small"> A tensão de repouso (grama) </td><td class="jove_content_small"> Pulso de freqüência (Hz) </td><td class="jove_content_small"> Largura de pulso (ms) </td><td class="jove_content_small"> Duração da estimulação (ms) </td><td class="jove_content_small"> Comprimento trecho </td><td class="jove_content_small"> Estiramento duração (ms) </td><td class="jove_content_small"> Taxa de alongamento </td><td class="jove_content_small"> Comentários </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. A avaliação das propriedades contráteis e passiva do músculo EDL vivo ex </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 A medição das propriedades contráteis do músculo EDL </td></tr><tr><td> 1. Aqueça-se </td><td> 1,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Descansar o músculo por 60 segundos entre cada estímulo. Essas contrações tetânicas preliminares estabilizar o músculo para medições posteriores. </td></tr><tr><td> 2. Comprimento muscular ótimo (Lo) </td><td> 0,5, 1,0, 1,5 e 2,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Permitir que o músculo a relaxar por 30 segundos entre cada estímulo. Meça o comprimento muscular ótimo utilizando um paquímetro digital. </td></tr><tr><td> 3. Twi únicotch vigor (Pt) </td><td> Ajuste a tensão de repouso para Lo </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. Força muscular tetânica </td><td> Ajuste a tensão de repouso para Lo </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 e 200 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Permitir que o músculo a relaxar por 1 min entre cada estímulo. Determinar a freqüência que geram a máxima absoluta força tetânica (Po). </td></tr><tr><td> 5. Contração excêntrica </td><td> Ajuste a tensão de repouso para Lo </td><td> Use a freqüência que gera a força tetânica máxima (Po) </td><td> 0,2 </td><td> 700 </td><td> Lo 10% </td><td> últimos 200 ms da duração estimulação </td><td> 0,5 Lo / seg </td><td> Repita a contração excêntrica por 10 ciclos com 2 min de repouso entre os ciclos. </td></tr><tr><td> 6. CSA do músculo EDL </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (massa muscular (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g / cm 3 de densidade é o músculo e 0,44 é o comprimento da fibra muscular EDL em Lo ratio. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 A medição das propriedades passivas do músculo EDL </td></tr><tr><td> 1. Seis passo protocolo de alongamento </td><td> Ajuste a tensão de repouso para Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> Lo 10% </td><td></td><td> 2 cm / seg </td><td> Repita o protocolo de alongamento com um incremento de 10% até 160 Lo Lo% é atingido. Alow 1,5 segundos entre os ciclos de alongamento. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> Ajuste a tensão de repouso para Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> Lo 10% </td><td></td><td> 2 cm / seg </td><td> SSR é calculado dividindo-se a diferença de o stress com o time decorrido entre dois momentos em um espaço de tempo. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2,3 medição das propriedades contráteis do músculo TA </td></tr><tr><td> 1. Aqueça-se </td><td> 4,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Descansar o músculo por 60 segundos entre cada estímulo. </td></tr><tr><td> 2. Comprimento muscular ótimo (Lo) </td><td> 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 e 7.0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Permitir que o músculo a relaxar por 30 segundos entre cada estímulo. Meça o comprimento muscular ótimo utilizando um paquímetro digital. </td></tr><tr><td> 3. CSA do músculo TA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (massa muscular (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 é o comprimento da fibra muscular TA para Lo ratio. </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Parâmetros para a avaliação das propriedades mecânicas dos músculos EDL e TA. <table border="1"><tbody><tr><td> Tensão </td><td> Idade (meses) </td><td> Peso corporal (g) </td><td> EDL peso (mg) </td><td> EDL Lo (mm) </td><td> EDL CSA (mm 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32,03 ± 0,57 </td><td> 13,90 ± 0,77 </td><td> 14,09 ± 0,04 </td><td> 2,12 ± 0,12 </td></tr><tr><td> mdx </td><td> 6 </td><td> 35,44 ± 0,42 * </td><td> 16,73 ± 0,42 * </td><td> 13,93 ± 0,05 * </td><td> 2,57 ± 0,07 * </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Propriedades morfométricas do músculo EDL. *, O valor em mdratinhos x é significativamente diferente do da mesma idade BL10 ratos. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> Figura 1. Um diagrama esquemático da placa de dissecção custom-made mouse. Dissecção A placa é feita de um acrílico ½ polegada de espessura e foi fabricado na loja institucional. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figura 2. Uma série de imagens digitais que mostram os passos de atar um nó duplo quadrada seguido por um nó laço na MTJ. Asterisk, oMúsculo EDL; Arrow, do tendão distai do músculo EDL. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; Figura 3. Um diagrama esquemático da plataforma feito por medida para ensaio in situ da função muscular TA. A plataforma animais plexiglass e do titular do joelho de aço inoxidável foram concebidos para a montagem sobre o aparelho 809B de rato in situ. *, Haste de aço inoxidável (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR); #, porta-eletrodo Universal (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR) §, haste de fixação do eletrodo (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); ** Sylgard bloco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Figura 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figura 4. Os resultados representativos para as propriedades contráteis e passiva do músculo EDL. Contráteis do músculo EDL caracterizam-se por a força de contração específica (A), a força tetânica específica (B), o tempo para o pico de tensão (C) e o tempo de relaxação da metade (D). As propriedades passivas do músculo EDL são avaliados pelo perfil de tensão de esforço (E) e o SSR. *, Camundongos mdx são significativamente diferentes de mesma idade BL10 ratos.

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice at JoVE.com

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Mudanças nos membros musculares contráteis e passiva propriedades mecânicas são biomarcadores importantes para doenças musculares. Este manuscrito descreve ensaios fisiológicos para medir estas propriedades no longus murino extensores dos dedos e tibial anterior.

Avaliação da função muscular do músculo extensor longo dos dedos<em&gt; Ex vivo</em&gt; E músculo tibial anterior<em&gt; Em situ</em&gt; Em Ratos

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

evaluation-muscle-function-extensor-digitorum-longus-muscle-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

41.8K visualizações.  University of Missouri. Mudanças nos membros musculares contráteis e passiva propriedades mecânicas são biomarcadores importantes para doenças musculares. Este manuscrito descreve ensaios fisiológicos para medir estas propriedades no longus murino extensores dos dedos e tibial anterior.

Vídeo: Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

Medição in vivo Micro-circulação no músculo esquelético por Intra-vital Microscopia

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Biologia

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Avaliação ex vivo de Fatigabilidade Contratilidade e Alternans em músculos esqueléticos isolados

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Detecção e análise de danos no DNA em Rato Músculo Esquelético<em&gt; In Situ</em&gt; Usando o método TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

A medição da função do músculo liso nas Isolado tecido de banho-aplicativos para Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Lesão por esmagamento aórtico murino: um eficiente<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de proliferação de células musculares lisas e função endotelial

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...