O modelo ex vivo é um método útil para avaliar o impacto de várias intervenções fisiológicas e compostos farmacológicos e captação de glicose muscular. Esta técnica permite a avaliação precisa da absorção de glicose no músculo esquelético do camundongo isolado na ausência de fatores de confusão que possam interferir em um modelo animal intacto. Antes de iniciar um experimento, ligue o sistema de biografia de tira muscular integrada e aqueça as câmaras a 30 graus celsius.
Abra o software de coleta de dados e calibra os transdutores forçados para garantir a comparabilidade entre conjuntos de dados. Adicione quatro mililitros de meio de incubação basal de 30 graus celsius pré-aquecidos a cada câmara de incubação e certifique-se de que o meio esteja continuamente oxigenado com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Coloque o mouse na posição propensa em uma bandeja de dissecção e confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal.
Em seguida, fixar uma única pata dianteira com uma agulha. Use uma tesoura para remover a pele da perna inferior até que o tendão de aquiles e a articulação do joelho estejam visíveis. Para dissecção do músculo soleus, conecte um único laço de sutura de 0,4 centímetros de diâmetro preparado a partir de uma peça de nylon cirúrgica não absorvível de 16 centímetros ao tendão de aquiles e fixar fórceps de peen no tendão de aquiles distally ao laço.
Corte para liberar os músculos soleus e gastrocnemius da pata e deslize cuidadosamente as fórceps de peen através do rato para expor o músculo soleus. Fixar os fórceps de peen e colocar um segundo laço de sutura em torno do tendão proximal do músculo soleus. Corte o tendão proximal e disseque o sola, incluindo as duas alças de sutura anexadas livres do músculo gastrocnemius.
Após a coleta, use os laços para fixar rapidamente o músculo soleus aos respectivos ganchos em uma das câmaras de incubação. Use fórceps para remover a fáscia que cobre o músculo tibialis anterior. Os tendões distais dos músculos tibialis anterior ou EDL devem ser brancos claros, visíveis e separados entre si.
Corte o tendão da destilação do músculo tibialis anterior e disseca o músculo. Use fórceps para libertar suavemente o músculo EDL dos tecidos circundantes, deixando o músculo intacto sem cortar os tendões. Coloque laços individuais de sutura ao redor dos tendões destilados e EDL proximal.
Quando os laços tiverem sido colocados, corte os tendões para liberar o músculo EDL com as alças de sutura presas e conecte rapidamente os laços aos ganchos na segunda câmara de incubação. Em seguida, ajuste a tensão de repouso de cada músculo para aproximadamente cinco mililitros e deixe os músculos se equilibrarem no meio por pelo menos 10 minutos antes de iniciar o experimento. Para medir a absorção de glicose estimulada pela insulina, substitua o meio de incubação basal nas câmaras pelo meio de incubação sem insulina, uma concentração de insulina submaximicamente eficaz, ou uma concentração de insulina extremamente eficaz para uma incubação de 20 minutos.
Ao final do período de estimulação, substitua o meio de incubação por meio de incubação de glicose contendo uma concentração idêntica de insulina para uma incubação de 10 minutos. No final da incubação da captação de glicose, remova cuidadosamente os músculos das câmaras de incubação e lave as amostras em meio de incubação basal gelada. Após a lavagem, seque rapidamente os músculos no papel filtro e congele o tecido sem as alças de sutura em nitrogênio líquido.
Em seguida, colete 100 microliters do meio de incubação de glicose de cada câmara para armazenamento de 20 graus celsius e análise de absorção de glicose muscular. Para medir a contração estimulada a absorção de glicose, coloque eletrodos de platina centralmente e em ambos os lados dos músculos dentro das câmaras de incubação, e inicie a contração muscular imediatamente após a substituição do meio de incubação basal por meio de incubação de glicose. Regisso da produção forçada de cada músculo incubado.
Após 10 minutos, colete e congele suavemente os músculos como demonstrado, armazenando 100 alíquotas de microliter do meio de incubação de glicose de cada câmara para análise de absorção de glicose muscular, como demonstrado. Para determinar a sinalização miocelular por análise de manchas ocidentais no mesmo conjunto de amostras musculares, homogeneize cada amostra muscular congelada em 400 microliters de tampão de homogeneização gelada e gire a extremidade da amostra por uma hora a quatro graus celsius. Em seguida, colete o licate por centrifugação e meça a quantidade de proteína de interesse dentro de cada palete amostra de acordo com os protocolos padrão de análise de manchas ocidentais.
Para medir a absorção de glicose em cada amostra, adicione 150 microliters de supernadante de cada amostra e 25 microliters de meio de incubação de glicose das câmaras de incubação correspondentes para separar frascos de contagem de cintilação líquida contendo três mililitros de fluido de cintilação líquida por frasco. Em seguida, carregue os frascos em um contador de cintilação líquida e meça a radioatividade de dois desoxicosglucose e manitol de acordo com as diretrizes do fabricante. Nesta análise representativa, as taxas de absorção de glicose basal foram semelhantes entre os músculos soleus e EDL isolados de camundongos fêmeas.
A absorção de glicose aumentou nos músculos soleus e EDL em resposta às concentrações de insulina submaximicamente e maximamente eficazes. Além disso, tanto a insulina submaximal quanto a insulina máxima estimularam a absorção de glicose foram significativamente maiores no músculo soleus. Em contraste, a absorção induzida pela absorção de glicose foi significativamente maior no EDL em comparação com o músculo soleus.
Aqui, pode-se observar a força muscular máxima produzida nos músculos soleus e EDL durante o período de estimulação de 10 minutos. Como esperado, o músculo EDL gerou mais força durante a parte inicial do período de estimulação, seguido por um declínio rápido mais tarde no período de estimulação. As concentrações submaximal e máxima de insulina induziram um aumento na fosforilação de Akt threonine 308 e TBC1D4 Serina 588, enquanto a contração induziu um aumento na fosforilação de AMPK Alpha threonine 172 e serina ACC 212.
Nem insulina nem contração levaram a uma mudança no teor total de proteínas. Antes de tentar medir a absorção de glicose em músculos isolados do rato, é vital praticar minuciosamente a dissecção dos músculos soleus e EDL. Após a avaliação da absorção de glicose muscular, o restante do teor de proteína muscular pode ser usado para análises bioquímicas adicionais que possam elucidar as alterações observadas nas taxas de absorção de glicose.
