A força extensora do joelho é um desfecho funcional comum avaliado em pesquisas clínicas. No entanto, os métodos para avaliar repetidamente o músculo extensor do joelho, particularmente a força do quadríceps, em estudos de roedores têm sido relativamente limitados. Este protocolo não invasivo pode ser usado para medir o pico isométrico de torque tetanic de extensores de joelho em camundongos, e pode ser repetido longitudinalmente.
Nossos métodos apoiam o desenvolvimento de modelos pré-clínicos para melhorar a recuperação após as lesões ou em pacientes com osteoartrite. Dada a amplitude dos modelos de roedores desenvolvidos para estudar desfechos musculoesqueléticos após lesão no joelho ou osteoartrite, existe a necessidade da avaliação não invasiva da força do quadríceps. A demonstração visual é fundamental para a integridade dos dados, pois demonstraremos como colocar os eletrodos de forma ideal para estimular ao máximo os extensores do joelho.
Antes de iniciar o experimento, verifique se todas as máquinas estão conectadas de acordo com as especificações do fabricante. Conecte o motor da alavanca muscular de dupla carga com o aparelho de extensão do joelho à plataforma animal e ligue a bomba de água a 37 graus Celsius, depois ligue o computador, o Estimulador bi-fase de alta potência e o sistema de alavanca de modo dual de 2 canais, e adicione isoflurane ao vaporizador à linha de enchimento máxima. Para otimizar a colocação da sonda, no software de instrumento, selecione Preparar experimento e configurar o Instant Stim, e definir a Frequência de Pulso para 125 Hertz, a Largura de Pulso para 0,2 metros por segundo, o Número de Pulsos para um, a Frequência de Trem para 0,5 Hertz e o Tempo de Execução para 120 segundos.
Em seguida, selecione Arquivo e abra o Live Data Monitor. Para realizar experimentos de frequência de contração e torque, selecione um estudo previamente programa que inclui os experimentos apropriados de frequência de torque de contração e extensão do joelho. Selecione o mouse experimental apropriado ou Add New Animal e forneça as informações correspondentes do mouse a serem armazenadas com os dados de torque.
Em seguida, selecione Next Experiment ou Previous Experiment para transição do protocolo de contração para a sequência de frequência de força. Após a anestesia, confirme a sedação por falta de resposta ao reflexo do pedal e coloque o mouse na posição supina em uma plataforma aquecida com a cabeça e um cone de nariz. Use cortadores elétricos para raspar o cabelo do membro traseiro direito.
Depois de limpar o cabelo do mouse e da plataforma, aperte firmemente o membro traseiro superior posterior ao joelho. Após a fixação, coloque o membro inferior traseiro no aparelho de extensão do joelho com a tíbia anterior tocando levemente a peça de plástico ajustável e enrole a fita cirúrgica ao redor da parte inferior da peça de plástico ajustável para fixar a perna ao aparelho, em seguida, ajuste os botões na plataforma até que o joelho esteja dobrado em um ângulo de 60 graus, e coloque um pedaço de fita sobre o torso do mouse para evitar movimento compensatório com extensão máxima do joelho. Coloque o eletrodo subcutâneamente de dois a quatro milímetros proximal ao joelho diretamente acima dos músculos quadríceps e extensores do joelho aproximadamente de um a dois milímetros de distância.
Para determinar a colocação ideal do eletrodo, no software, selecione O Monitor de Estimulação Instantânea e Dados Ao Vivo e defina a corrente para 50 miliamperes para repetidas contrações para confirmar a extensão conforme indicado por uma curva de contração negativa. Para obter o torque máximo de proteção da extensão do joelho, ajuste as sondas enquanto revisa a resposta na janela Live Data Monitor. Ao mesmo tempo em que oferece repetidas contrações com estimulação instantânea, palpa os músculos flexores do joelho do rato com o dedo indicador para confirmar que não há ativação dos músculos antagonistas.
Para a estimulação máxima do extensor do joelho, reposicione as sondas conforme necessário. Quando a colocação ideal da sonda tiver sido determinada, defina a corrente em 50 miliamperes e selecione Executar experimento para produzir um único contração. Selecione Analisar resultados para exibir a saída de torque e registrar o torque de contração exibido em Max Force com a linha de base subtraída.
Repita o experimento até que o torque do contração seja em patamares ou comece a diminuir. Aumentando a corrente para 10 a 20 miliamperes e registrando o torque de contração para cada experimento. Registre a menor corrente em que o maior torque de contração é alcançado.
Esta corrente será usada para o experimento de frequência de força. Para determinar o efeito de torque isométrico máximo, selecione o experimento de frequência de torque pré-programa para extensão do joelho e defina a duração do estímulo para 0,35 segundos, as sequências de frequência para 10, 40, 120, 150, 180 e 200 Hertz e o período de descanso entre os pulsos e contrações para 120 segundos. Em seguida, clique em Executar experimentos e analisar resultados, e registrar manualmente o torque em cada frequência, certificando-se de que o canal Force seja invertido, pois a contração do extensor do joelho produzirá um torque negativo.
Observe o maior valor máximo de força como o pico de torque tetanico isométrico. No final do experimento de frequência de torque, realize uma contração de seguimento e compare o movimento de seguimento com o pico inicial de contração na mesma corrente para avaliar danos ou fadiga. Quando todas as medidas de torque tiverem sido adquiridas, remova suavemente as sondas de eletrodo e o grampo do joelho e coloque o mouse em uma gaiola de recuperação em uma almofada de calor com monitoramento até a recumbência total.
Nesta análise representativa, três interruptores isolados foram introduzidos em uma estimulação inicial de corrente de 10 Hertz. A fusão parcial do contração foi observada em 40 Hertz e a potência máxima do torque tetanic foi alcançada em 120 a 180 Hertz. Neste experimento, foram obtidas curvas de frequência de torque de extensão do joelho para três camundongos no momento zero e duas semanas após a avaliação inicial.
Como observado, os valores de torque bruto e os valores de torque bruto normalizados ao peso corporal do rato foram estatisticamente semelhantes em ambos os pontos de tempo confirmando a reprodutibilidade da análise. Conforme ilustrado nesta área sob a análise da curva utilizando dados de torque isométrico normalizados para experimentos completos de frequência de torque para quatro camundongos separados, um torque total semelhante foi obtido após análises repetidas com os mesmos animais. O pico de potência de torque tetanic também demonstrou variabilidade mínima dentro de cada animal.
O protocolo de torque tetanic de pico do extensor do joelho é uma ferramenta útil para detectar diferenças de resistência em vários modelos de mouse. Por exemplo, nesta análise, pode-se observar um forte contraste entre a força extensora do joelho e um rato selvagem não ferido e um modelo de rato transgênico de hipertrofia suprafisiológica. Além disso, observou-se queda de quase 50% no torque máximo em animais do tipo selvagem sete dias após a transeção cirúrgica do ligamento cruzado anterior.
A colocação ideal do eletrodo é essencial para alcançar resultados significativos e repetíveis. A fadiga muscular extensora do joelho é um importante indicador da função física, incluindo repetidas contrações submaximais e avaliações futuras adicionariam mais relevância translacional a este método em modelos pré-clínicos. Estudos que investigam os mecanismos de adaptação muscular, muitas vezes utilizam modelos de camundongos devido à simplicidade da modificação genética.
Esta técnica oferece um método não invasivo para medir repetidamente a função extensor do joelho in vivo nesses modelos pré-clínicos.
