Os autores gostariam de agradecer a NSERC (Ciências Naturais e Conselho de Engenharia do Canadá) para financiamento, Catherine Pagiatikis por sua ajuda em corridas iniciais, Sura Abu-Mallouh e Frederick Fahim para testar o protocolo, Richard Prevost de LaVision, Inc para o suporte técnico, e Guy Cloutier, da Universidade de Montréal para o empréstimo da câmera de alta velocidade Dalsa.

1. Microchip Fabrication O primeiro passo é criar ou comprar o seu microcanais. Há muitas opções de material de microchip. Um dos materiais mais comuns escolhidos é o poli (dimetilsiloxano) (PDMS). Existem muitas publicações sobre as indicações para PDMS fabricação através de litografia suave 16,17,18. Uma vez que o canal de PDMS é fabricado, há vários tratamentos de superfície disponível para inverter a sua hidrofobicidade natural. Tratamento com plasma oxigenado é uma opção comum. Zhou, Ellis, e Voelcker (2009) dar uma revisão de tratamentos de superfície e como eles afetam PDMS. Estes resultados são no entanto para a água, e o sangue tem propriedades diferentes. Um estudo sobre o que significa que o tratamento de superfície para o sangue foi feito através de Pitts et al. (2012a). Para que os resultados aqui apresentados, as superfícies microchip e as lâminas de vidro que eramligado a ambos foram expostas ao plasma oxigenada durante 45 segundos e, em seguida, pressionado firmemente em conjunto, resultando numa ligação permanente. 2. Preparação de Sangue <ol><li> Coletar amostras de sangue de uma unidade credenciada. Por exemplo, o sangue de suíno pode ser utilizado com o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) como anticoagulante. Adicionar 1 g de EDTA, com 4 ml de água, e, em seguida, adicionar a solução a 1 litro de sangue completo, misturando suavemente 10x. </li></ol> Ao escolher-se amostras de sangue, eles permitem a arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. As amostras de sangue devem ser frescos e, de preferência usado no dia em que são recolhidas para conservar as propriedades reológicas do sangue. As amostras podem ser conservadas sob refrigeração à temperatura ambiente, uma vez, no entanto sangue total sem anticoagulante será inutilizado após refrigeração. Dependendo do anticoagulante, GVs pode ser mantido refrigerado durante até 42 dias, e de sangue total pode ser mantido refrigerado durante 35 dias, mas seria possível contaminação de uma forma não-mfacilidade edical 21. Além disso, tenha cuidado com o método de coleta de amostras de bovinos ou suínos, e evitar a contaminação pela medula óssea. <ol start="2"><li> Centrifugar as amostras de sangue de 3x a 3.000 rpm durante 10 min de cada vez. Depois da primeira centrifugação, remover o plasma e crosta inflamatória, descarte. Geralmente, é mais fácil de remover o plasma em primeiro lugar, e, em seguida, descartar ou guardar para uso futuro, em seguida, para remover a cobertura amarelada sozinho. </li></ol> Introduzir a pipeta lentamente, de modo a não misturar o creme leucocitário volta para a corrente sanguínea. Após a remoção da cobertura amarelada, adicionar cerca de 20 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e misturar suavemente, recentrifuge. Repita o último passo. Após a terceira centrifugação, remover a crosta inflamatória PBS e restante, descarte. Também é possível utilizar o plasma nativo em vez de PBS se deseja manter as propriedades de agregação do sangue. Certifique-se de não misturar qualquer buffy coat ou brancocélulas do sangue para o plasma. <ol start="3"><li> Aqui as células vermelhas do sangue (RBC limpos) e suspender em PBS ou plasma em concentrações desejadas (hematócrito). Verificar com hematócritos numa microcentrífuga (CritSpin FisherSci, EUA). </li></ol> Sangue em 10 a 20% de hematócrito deve ser mais fácil de visualizar do que 40 ou 50% (hematócrito fisiológica). Na microcirculação, o sangue é geralmente metade do hematócrito da circulação macro, para H = 20 é adequada 15. <ol start="4"><li> Adicionar partículas traçadores fluorescentes para a concentração desejada para as amostras de sangue. A regra geral é que 10 partículas em uma janela de correlação, que podem ser calculados antes da hora. </li></ol> Por exemplo, 30 ul de partículas são adicionados a 1 ml de solução de sangue para a configuração descrita no vídeo. Alternativamente, as próprias GVs podem ser marcadas por fluorescência. <ol start="5"><li> Além disso, faça uma solução de calibração com água e gripeorescing partículas. É necessário calibrar o sistema, com uma solução newtoniano. </li></ol> Por exemplo, quando se utiliza uma objectiva 10X com um canal na escala de 100 mm, uma concentração adequada é de 300 ul de partículas misturadas com 15 ml de água destilada. Uma outra opção é utilizar o glicerol diluída com água destilada para uma viscosidade de 3CP, que está mais próxima à viscosidade do sangue macro. 3. μPIV Medidas <ol><li> De segurança do laser: Verifique a temperatura e umidade. Use óculos de segurança apropriados a laser. Feche a cortina do laser ou ligar o sinal de laser na porta do laboratório para evitar que pessoas que não estão protegidas de serem expostos. </li><li> Processo de software de Davis é mostrado no vídeo. Para mais detalhes, consulte o manual do usuário de um sistema específico. </li><li> Antes de levar os dados, a escala de câmera precisa ser calibrado utilizando um micrômetro. </li><li> Para reduzir a conformidade do sistema, use o mais curto espaço de uma tubulaçãod a seringa mais pequena possível rígida, tal como uma pi Hamilton Gastight seringa de 15 ou 50. Para reduzir a perda de sangue ou de admissão de ar para o sistema, para selar o tubo da seringa e para o chip. Isto pode ser feito com a cola, ou vaselina PDMS (sendo cuidadoso para não contaminar o sangue). </li></ol> Para preencher o micro-seringa com água misturada com partículas de usar o método de traçador de refluxo visto que o volume da micro-seringa é geralmente muito mais pequeno do que o volume a preencher. O método consiste refluxo para encher a seringa e micro-canal em conjunto através da saída do canal, utilizando uma seringa de plástico secundário. Para isso, em primeiro lugar remover o micro-êmbolo de seringa, em seguida, apertar o líquido utilizando a seringa clássica ligado à saída do canal, que o fluxo de líquido para fora da micro-seringa até que todas as microbolhas estão fora da micro-seringa ou tubagem chips, finalmente, colocar o êmbolo para trás, e desconecte a seringa de plástico. A presença or ausência de microbolhas pode ser verificado com um microscópio. <ol start="5"><li> Nivelar a bomba de seringa para atingir tubagem horizontal. Programar a bomba de seringa a taxa de fluxo desejada. </li></ol> Estar ciente dos possíveis efeitos transitórios, como o &quot;efeito gargalo&quot;, para o sistema rígido ou a conformidade do sistema que modifique o fluxo real. Tempos característicos de um sistema pode ser estimado como função dos materiais e as dimensões do sistema. (Capítulo 2, pp 77-81, Tabeling, 2005) <ol start="6"><li> Coloque microchip no palco microscópio e ligar a bomba. Utilizar a água com partículas para calibrar o sistema para o perfil de velocidade média e calibrar o dT (o tempo entre as imagens pulsadas). </li></ol> As partículas devem mover-se entre 5 e 10 pixels entre os quadros para uma boa correlação 11. Ao calibrar, ter o cuidado de medir no meio do canal. O plano de foco no meio tem a maiorvelocidade 8. Se estiver usando um canal de volta, tome cuidado com os efeitos de sombreamento. Uma imagem da amostra é mostrado na Figura 2, usando uma câmara de impulsos, enquanto que a parte superior da imagem é o primeiro impulso e a imagem de fundo é o segundo impulso. Pode ser visto na figura, que os pontos brilhantes (partículas fluorescentes) são os mais em foco. <ol start="7"><li> OPCIONAL: Tomando os dados a diferentes alturas de um perfil de velocidade em 3D pode ser reconstituída por adição dos diferentes vectores para uma única imagem. O vídeo apresenta uma rotina que foi desenvolvido para a automatização do processo. </li><li> Quando a tomada de dados com o sangue, encher a seringa com a quantidade desejada de sangue com o mesmo método como a água. Programar a bomba de seringa para a taxa de fluxo desejada, e levar os dados desejados. Um exemplo de imagens em bruto obtidos são apresentadas na Figura 2. Tenha cuidado com RBC sedimentação bem. Recarregando a seringa cada corrida ou a cadaoutro prazo, irá reduzir a resolução da RBC. </li><li> Após a obtenção de imagens, a correlação cruzada é executada nos pares de imagem para obter campos vector de velocidade entre as imagens. É importante ter boas imagens para ter uma boa correlação. Antes de correlacionar, pré-processamento pode ser feito para eliminar o ruído de fundo. </li></ol> Correlação cruzada é feito entre as janelas nas imagens adjacentes, que podem ser variadas em tamanho e forma a afectar a correlação. Depois de correlação cruzada, pós-processamento de imagem pode ser feito para eliminar vetores errôneos ou outliers. Uma descrição detalhada das diversas opções disponíveis e os seus precisões podem ser encontrados em Pitts et al. (2012b), onde o melhor tratamento para o sangue foi considerado o método de &quot;imagem de sobreposição&quot; com janelas estendido em comprimento e alinhada com o fluxo . Estas operações podem ser feitas manualmente em um programa como o MATLAB, ou dentro do pacote de software com seu sistema. O<html> software não é importante, a matemática por trás das operações é mais importante e cada operação pode afectar a precisão do perfil final velocidade. Os vectores resultantes podem ser calculadas no espaço entre o canal para obter perfis de velocidade instantânea e, em seguida, novamente a média no tempo para obter, de um perfil de velocidade média representativa. Kloosterman et ai. (2011) dão uma explicação do erro nas medições μPIV onde a profundidade de campo é grande. As discussões sobre o erro de processamento de dados aqui apresentado pode ser encontrada na Pitts et al. (2012b) para as medições pulsadas e Chayer et al. (2012) para as medições de alta velocidade. Exemplos de perfis de velocidade são apresentados nas Figuras 3 e 4. Figura 3 apresenta-se um único perfil de velocidade para a linha central de uma 10 ul / h de fluxo de RBC em H = 10 em um canal de largura de 140 um. tenda &quot;&gt; O perfil único é alcançada pela média dos vectores correlacionados através do canal para obter um perfil de velocidade, e então a média no tempo para obter uma medida representativa. Neste caso, 100 pares foram, em média, o tempo em todo o campo de vista. Um exemplo do perfil de reconstrução 3D feita por um fluxo de água de calibração num canal 100 um quadrado, com uma taxa de fluxo programado, de 30 uL / hr é encontrado na Figura 4. Na Figura 4, os perfis são medidos em intervalos de 1 uM. <ol start="10"><li> OPCIONAL: Nas imagens de alta velocidade descritos set-up podem ser tomadas nas mesmas condições por câmeras de comutação (e sistemas de aquisição de dados). Isto pode ser útil para a visualização da camada livre de células no canal, e para quantificar a agregação. A análise dos dados é ligeiramente diferente (Chayer et ai., 2012). </li></ol> Exemplos de imagens de luz branca com e sem agregação de RBC são presented na Figura 5 em H = 20. As imagens superiores mostram H = 20 em PBS, que remove a capacidade do agregado para o RBC, a 1 mL / hr. A imagem de fundo é H = 20 em plasma nativa em 0,5 mL / hr. Na imagem inferior, a agregação é visível. <ol start="11"><li> Desligue o sistema de uma forma segura, quando as medições foram concluídos. Use procedimentos adequados de segurança do laser até fonte de energia do laser é completamente desligado. </li></ol>

<ol>
	<li>Santiago, J. G., Wereley, S. T., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+particle+image+velocimetry+system+for+microfluidics.">A particle image velocimetry system for microfluidics.</a> Experiments in Fluids. 25, 316-319 (1998).</li><li>Sugii, Y., Okamoto, K., Nishio, S., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Velocity+Measurement+in+Micro+Tube+by+Highly+Accurate+PIV+Technique.">Evaluation of Velocity Measurement in Micro Tube by Highly Accurate PIV Technique.</a> , 1-5 (2001).</li><li>Park, J. S., Choi, C. K., Kihm, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optically+sliced+micro-PIV+using+confocal+laser+scanning+microscopy+(CLSM).">Optically sliced micro-PIV using confocal laser scanning microscopy (CLSM).</a> Exp. Fluids. 37 (1), 105-119 (2004).</li><li>King, M. R., Bansal, D., Kim, M. B., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hematocrit+and+leukocyte+adherence+on+flow+direction+in+the+microcirculation.">The effect of hematocrit and leukocyte adherence on flow direction in the microcirculation.</a> Ann. of Biomed. Eng. 32 (6), 803-814 (2004).</li><li>Lima, R., Wada, S., Tsubota, K., Yamaguchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+micro-PIV+measurements+of+three-dimensional+profiles+of+cell+suspension+flow+in+a+square+microchannel.">Confocal micro-PIV measurements of three-dimensional profiles of cell suspension flow in a square microchannel.</a> Meas. Sci. Tech. 17 (4), 797-808 (2006).</li><li>Wereley, S. T., Santiago, J. G., Chiu, R., Meinhart, C. D., Adrian, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-resolution+particle+image+velocimetry.">Micro-resolution particle image velocimetry.</a> Micro- and Nanofabricated Structures and Devices for Biomedical Environmental Applications. 3258, 122-133 (1998).</li><li>Meinhart, C. D., Wereley, S. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+applications+on+microfluidic+velocimetry.">Advances and applications on microfluidic velocimetry.</a> Microfluid. Nanofluid. 8 (6), 709-726 (2010).</li><li>Chiu, J. J., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+disturbed+flow+on+vascular+endothelium:+Pathophysiological+basis+and+clinical+perspectives.">Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives.</a> Physiol. Rev. 91 (1), 327-387 (2011).</li><li>Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microcirculation:+Physiology+at+the+mesoscale.">The microcirculation: Physiology at the mesoscale.</a> J. Physiol. 589 (5), 1047-1052 (2011).</li><li>Popel, A. S., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+and+hemorheology.">Microcirculation and hemorheology.</a> Annual Review of Fluid Mechancis. 37, 43-69 (2005).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 37, 551-577 (1998).</li><li>Whitesides, G. M., Stroock, A. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+PDMS+surface+modifications+for+microfluidic+devices.">Recent developments in PDMS surface modifications for microfluidic devices.</a> Electrophoresis. 31, 2-16 (2009).</li><li>Pitts, K. L., Abu-Mallouh, S., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+angle+study+of+blood+dilutions+on+common+microchip+materials.">Contact angle study of blood dilutions on common microchip materials.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. , (2012).</li><li>Hovav, T., Yedgar, S., Manny, N., Barshtein, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+red+blood+cell+aggregability+and+shape+during+blood+storage.">Alteration of red blood cell aggregability and shape during blood storage.</a> Transfusion. 39, 277-281 (1999).</li><li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow:+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods.">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Measurement Science and Technology. 23, 105302 (2012).</li><li>Kloosterman, A., Poelma, C., Westerweel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+rate+estimation+in+large+depth-of-field+micro-PIV.">Flow rate estimation in large depth-of-field micro-PIV.</a> Exp. Fluids. 50 (6), 1587-1599 (2011).</li><li>Goldsmith, H. L., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics.">Hemodynamics.</a> Annual Review of Fluid Mechanics. 7, 213-247 (1975).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Usando μPIV para medições de fluxo de sangue na escala da microcirculação pode dar insights sobre um grande número de processos de engenharia biomédica, mecânica e química relevantes. Alguns dos principais fatores para contabilizar são a densidade da RBC-se, a agregação e deformabilidade do RBC, agregação ou movimento das micro partículas fluorescentes, ea fixação da RBC nos canais. Todos estes podem ser explicados se as orientações gerais estabelecidas acima forem seguidas. Há uma lista de verifica?...

O corpo humano contém numerosos vasos com diâmetro inferior a 50 um, que são o principal local de permuta entre o sangue e tecidos. O estudo do fluxo de sangue nesses vasos representa um desafio considerável, devido tanto à escala das medições e as propriedades dos fluidos de sangue. Estas medições, incluindo o gradiente de pressão, o corte na parede e perfis de velocidade nas arteríolas e vénulas, são factores principais relacionados com as respostas fisiológicas. Há agora oportunidades sem precedentes para resolver esses desafios de medição, graças às novas técnicas experimentais no micro escala para estudar a microcirculação e resolver este problema multiescala. Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é uma técnica de visualização de fluxo baseado em partículas, que é utilizado para avaliar perfis de velocidade de fluxo sanguíneo em microcanais por meio de correlação cruzada. μPIV, desenvolvido pela primeira vez por Santiago et al., tem sido utilizado com hemorreologiaestudos desde Sugii et al., em 2001, utilizou a técnica para medir o fluxo de sangue em 100 mM tubos de vidro redondo 1,2. Diferentes abordagens para existir μPIV. Câmaras de alta velocidade pode ser utilizado para relacionar o movimento das células vermelhas do sangue (RBC), e as imagens por impulsos pode ser utilizado para relacionar o movimento das partículas de marcadores. Qualquer destas opções podem ser acoplados com um microscópio vertical ou invertida, dependendo da aplicação. Em ambos os casos, o resultado é um perfil de velocidade 2D. Outra abordagem é a utilização de um microscópio confocal para atingir perfis 2D e 3D. Este método tem sido aplicado para o sangue 3,4,5. Micro escala PIV tem várias complicações, quando comparado com macro PIV. Em macro PIV os dados podem ser limitados a um único plano de luz através das folhas, mas a iluminação de volume micro escala é necessário. Volume de iluminação é um problema maior para a imagiologia de micro fluxos sanguíneos, como os próprios GVs são grandes em comparação com o channels, e utilizando os glóbulos vermelhos como os marcadores partículas conduz a uma profundidade de correlação (DOC), o que pode diminuir significativamente o rigor dos resultados de correlação cruzada de 6,7,8. Após Wereley et ai. (1998), o DOC para um canal de altura com 40 um RBC como marcadores é de 8,8 mM, enquanto que com um traçador de partícula de 1 um a DOC é de 6,7 mM. Esta diferença torna-se mais pronunciado quando se muda a altura do canal e ampliação. Além disso, os glóbulos vermelhos são opacas, e aumentando a densidade dos GVs no fluxo provoca dificuldades de imagem. Traçadores fluorescentes partículas, utilizadas pela primeira vez por Santiago et al. (1998), têm sido defendidos como uma ferramenta para diminuir a influência de partículas fora do foco, quando usando as partículas mais pequenas possíveis. Utilização de 1 um de diâmetro micropartículas fluorescência acoplado com um laser é uma abordagem que pode diminuir a profundidade de foco no problema de micro imagiologia fluxo sanguíneo 10. Existem várias opiniões atuais do estado de μPIV technology, cada um dos quais destaca a importância da μPIV para estudos de fluxo de sangue 11,12. Várias considerações importantes devem ser tidas em conta quando se utiliza μPIV de sangue. No nível micro, a escala da microcirculação, o sangue não pode ser considerado como um fluido homogéneo, uma vez que é uma suspensão de células flexíveis vermelhas do sangue (eritrócitos), as grandes células brancas do sangue, plaquetas e outras proteínas suspensas num fluido newtoniano (plasma) . Os perfis de velocidade medidos aqui pode ser utilizado para medir certas características das micro-circulações sanguíneas. Os factores importantes na microhemorheology são a taxa de fluxo do sangue, a forma do perfil de velocidade, e a tensão de cisalhamento na parede do recipiente. Esta informação tem implicações clínicas, tal como a microcirculação é o local para a troca de nutrientes no corpo, e esta troca é dependente do cisalhamento. Existem vários estudos de revisão atuais sobre o estado da investigação na microcirculação, bem 13,14,15. Apresentado aqui é um protocolo para medições μPIV dos fluxos sanguíneos em polidimetilsiloxano (PDMS) microcanais. Canais de PDMS foram fabricados em casa seguindo as fontes na seção 1 do protocolo. Amostras de sangue de suínos foram obtidos a partir de um matadouro credenciado e limpos seguindo seção 2 do protocolo. Todos os dados foram obtidos usando o sistema MITAS μPIV LaVision, conforme descrito na seção 3 do protocolo. A montagem é composto por um laser Nd: YAG (New Wave Research, EUA) e câmara CCD (imagem intensa, Lavision), controlada por uma unidade programável de disparo, um microscópio de fluorescência acoplado a um estágio movendo-se em três eixos, e um computador, para além de uma câmara de alta velocidade (Dalsa 1M150, Holanda) foi adicionado para a visualização dos próprios eritrócitos. Ambas as câmeras são conectadas a uma caixa de ótica 2 portas (Custom por Zeiss, Alemanha). Em típico medidas in vivo do fluxo de sangue, um microscópio vertical é usado para rastrear as hemácias domselves, enquanto que, na típica aplicações in vitro um microscópio invertido é usado para controlar as partículas de marcadores. Neste única dupla set-up, a caixa de óptica permite que ambos os traçadores de ser fotografada usando um microscópio invertido. O sangue foi introduzido nos microchips através de uma bomba de seringa de alta precisão (Nexus3000, Chemyx Inc., EUA). Um diagrama do sistema é mostrada na Figura 1, onde a parte de cima da figura representa a 140 mM por 40 mM canais rectangulares fabricadas de PDMS, e a porção inferior representa todo o sistema, incluindo ambas as câmaras, o laser, a bomba de seringa e do microscópio. ΜPIV atual set-ups disponíveis, geralmente com software proprietário, incluem TSI, Dantec Dynamics, e LaVision. Algoritmos de correlação cruzada standard pode ser conseguido através de numerosas opções de software, incluindo o MATLAB. O software não é a chave, a compreensão de que as caixas de diálogo correspondem matematicamente servirá o usor muito melhor. Neste protocolo Davis, software proprietário da LaVision ou MATLAB são utilizados. O protocolo não é um software específico, mas as opções do menu pode estar em lugares diferentes, em diferentes pacotes de software.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184</td>
			<td>Dow-Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E9884-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poshpate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368-10PAK</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescing micro particles</td>
			<td>Microgenics/FisherSci</td>
			<td>R900</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol (OPTIONAL)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G6279-500 ml</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge, i.e. CritSpin</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>22-269-291</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe, i.e. 50 &mu;l Gastight</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80965</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera, i.e. Imager Intense, high speed</td>
			<td>LaVision, Dalsa</td>
			<td>Imager Intense</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope, i.e. MITAS</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>MITAS</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YAG laser</td>
			<td>New Wave Research</td>
			<td>Solo-II</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe pump, i.e. Nexus3000</td>
			<td>Chemyx, Inc.</td>
			<td>Nexus-3000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible tubing, i.e. Tygon</td>
			<td>FisherSci</td>
			<td>14-169-1A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data processing software, i.e. DaVis</td>
			<td>LaVision</td>
			<td>DaVis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>004260F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows

Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é usado para visualizar imagens pareadas de micro partículas semeadas nos fluxos sanguíneos. As imagens são interligado para dar um perfil de velocidade precisa. Um protocolo é apresentada para medições μPIV dos fluxos sanguíneos em microcanais. Na escala da microcirculação, o sangue não pode ser considerado como um fluido homogéneo, uma vez que é uma suspensão de partículas flexíveis suspensas no plasma, um fluido newtoniano. Taxa de cisalhamento, a velocidade máxima, a forma do perfil de velocidade e taxa de fluxo pode ser obtida a partir destas medições. Vários parâmetros de chave, tais como a profundidade de foco, a concentração de partículas, e a compatibilidade do sistema, são apresentados a fim de assegurar, dados úteis precisos, juntamente com exemplos e resultados representativos para vários hematócritos e as condições de escoamento.

Em todas as figuras, o fluxo é da esquerda para a direita nas imagens em bruto, de baixo para cima e de perfis de velocidade calculados. Um exemplo dos dados em bruto obtidos com sangue de hematócrito H = 10, com um caudal de 10 ml / h é mostrado na Figura 2. Os dados brutos podem ser interligado, sem qualquer processamento de dados para obter perfis de velocidade. O impacto dos métodos de pré-tratamento e de processamento de dados é discutida por Pitts et al., (2012b). Um exemplo de um p...

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Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é utilizado para visualizar as imagens de micro partículas emparelhadas semeadas nos fluxos de sangue que são interligado para dar um perfil da velocidade precisa. Taxa de cisalhamento, a velocidade máxima, a forma do perfil de velocidade e taxa de fluxo, cada uma das quais tem aplicações clínicas, podem ser derivadas a partir destas medições.

Micro-partículas Velocimetry Imagem para a velocidade Medidas de fluxos de sangue Micro Perfil

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

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17.1K visualizações.  University of Ottawa. Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é utilizado para visualizar as imagens de micro partículas emparelhadas semeadas nos fluxos de sangue que são interligado para dar um perfil da velocidade precisa. Taxa de cisalhamento, a velocidade máxima, a forma do perfil de velocidade e taxa de fluxo, cada uma das quais tem aplicações clínicas, podem ser derivadas a partir destas medições.

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Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as oceanography, ecology, biology, and fluid mechanics. Field measurements introduce practical challenges such as environmental conditions, animal availability, and the need for field-compatible measurement techniques. To avoid these challenges, scientists typically use controlled laboratory environments to study animal-fluid interactions. However, it is reasonable to question whether one can extrapolate natural behavior (i.e., that which occurs in the field) from laboratory measurements. Therefore, in situ quantitative flow measurements are needed to accurately describe animal swimming in their natural environment.
We designed a self-contained, portable device that operates independent of any connection to the surface, and can provide quantitative measurements of the flow field surrounding an animal. This apparatus, a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), can be operated by a single scuba diver in depths up to 40 m. Due to the added complexity inherent of field conditions, additional considerations and preparation are required when compared to laboratory measurements. These considerations include, but are not limited to, operator motion, predicting position of swimming targets, available natural suspended particulate, and orientation of SCUVA relative to the flow of interest. The following protocol is intended to address these common field challenges and to maximize measurement success.

Quantitatively Measuring In situ Flows using a Self-Contained Underwater Velocimetry Apparatus SCUVA

This protocol provides instructions on how to use a self-contained underwater velocimetry apparatus (SCUVA), which is designed for quantification of in situ animal-generated flows. In addition, this protocol addresses challenges posed by field conditions, and includes operator motion, predicting position of animals, and orientation of SCUVA.

Medir quantitativamente In situ Fluxos usando um Aparelho Autônomo de Velocimetria Underwater (SCUVA)

The ability to directly measure velocity fields in a fluid environment is necessary to provide empirical data for studies in fields as diverse as ...

Bioengenharia

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Impressão de planar e tridimensional de tintas condutoras

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

A plataforma automatizada versátil para experiências de estimulação Micro escala celulares

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Melhoria da Metodologia para a Elaboração de um baseado em celular, Contact Modelo Humano da barreira hemato-encefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &amp;#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

Híbrido de imagem μCT-FMT e análise de imagem

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic properties, enable bio imaging and control cell phenotype. A critical yet inadequately addressed issue is the significant number of particles that remain unbound after cell labeling which cannot be readily removed by conventional centrifugation. This leads to an increase in bio imaging background noise and can impart transformative effects onto neighboring non-target cells. In this protocol, we present an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy termed as Dean Flow Fractionation (DFF) to efficiently separate labeled cells from free NPs in a high throughput manner. The developed spiral microdevice facilitates continuous collection (&#62;90% cell recovery) of purified cells (THP-1 and MSCs) suspended in new buffer solution, while achieving &#62;95% depletion of unbound fluorescent dye or dye-loaded NPs (silica or PLGA). This single-step, size-based cell purification strategy enables high cell processing throughput (106 cells/min) and is highly useful for large-volume cell purification of micro/nanoparticle engineered cells to achieve interference-free clinical application.

This protocol describes the use of an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy to purify micro/nanoparticle engineered cells with efficient depletion of unbound particles.

Microfluídico troca de tampão para Micro / nanopartículas celular Engenharia sem interferências

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

Posicionamento adequado e a contenção de um membro posterior de ratos para concentrado de alta resolução de imagem de osso usando Microarquitetura na Vivo Microtomografia computadorizada

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

Biological Compatibility Profile on Biomaterials for Bone Regeneration

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such lesions, there are potential complications with their use. Thus, material scientists are developing synthetic, biocompatible biomaterials to overcome these problems. In this study, we present a multidisciplinary platform for evaluating biomaterials for bone repair. We combined expertise from bone biology and immunology to develop a platform including in vitro osteoclast (OC) and osteoblast (OB) assays and in vivo mouse models of bone repair, immunogenicity, and allergenicity. We demonstrate how to perform the experiments, summarize the results, and report on biomaterial biocompatibility. In particular, we tested OB viability, differentiation, and mineralization and OC viability and differentiation in the context of &#946;-tricalcium phosphate (&#946;-TCP) disks. We also tested a &#946;-TCP/Collagen (&#946;-TCP/C) foam which is a commercially available material used clinically for bone repair in a critical-sized calvarial bone defect mouse model to determine the effects on the early phase of bone healing. In parallel experiments, we evaluated immune and allergic responses in mice. Our approach generates a biological compatibility profile of a bone biomaterial with a range of parameters necessary for predicting the biocompatibility of biomaterials used for bone healing and repair in patients.

The number of novel biomaterials engineered for repairing large bone lesions is continuously expanding with the aim to enhance bone healing and overcome the complications associated with bone transplantation. Here, we present a multidisciplinary strategy for pre-clinical biocompatibility testing of biomaterials for bone repair.

Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea

Large non-union bone fractures are a significant challenge in orthopedic surgery. Although auto- and allogeneic bone grafts are excellent for healing such ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows across a large spatiotemporal range. However, its implementation typically requires the use of expensive and specialized instrumentation, which limits its broader utility. Moreover, within the field of bioengineering, in vitro flow visualization studies are also often further limited by the high cost of commercially sourced tissue phantoms that recapitulate desired anatomical structures, particularly for those that span the mesoscale regime (i.e., submillimeter to millimeter length scales). Herein, we present a simplified experimental protocol developed to address these limitations, the key elements of which include 1) a relatively low-cost method for fabricating mesoscale tissue phantoms using 3-D printing and silicone casting, and 2) an open-source image analysis and processing framework that reduces the demand upon the instrumentation for measuring mesoscale flows (i.e., velocities up to tens of millimeters/second). Collectively, this lowers the barrier to entry for nonexperts, by leveraging resources already at the disposal of many bioengineering researchers. We demonstratethe applicability of this protocol within the context of neurovascular flow characterization; however, it is expected to be relevant to a broader range of mesoscale applications in bioengineering and beyond.

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Here we present simplified methods for fabricating transparent neurovascular phantoms and characterizing the flow therein. We highlight several important parameters and demonstrate their relationship to field accuracy.

Meso-escala Particle Image Velocimetry estudos de Neurovascular flui em Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...

Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome absorbance respectively. In addition, numerous aspects of the mitochondrial metabolic status such as membrane potential and substrate entry can also be estimated. To perform cardiac wall transmission optical spectroscopy, a commercially available side-firing optical fiber catheter is placed in the left ventricle of the isolated perfused heart as a light source. Light passing through the heart wall is collected with an external optical fiber to perform optical spectroscopy of the heart in near real- time. The transmission approach avoids numerous surface scattering interference occurring in widely used reflection approaches. Changes in transmural absorbance spectra were deconvolved using a library of chromophore reference spectra, providing quantitative measures of all the known cardiac chromophores simultaneously. This spectral deconvolution approach eliminated intrinsic errors that may result from using common dual wavelength methods applied to overlapping absorbance spectra, as well as provided a quantitative evaluation of the goodness of fit. A custom program was designed for data acquisition and analysis, which permitted the investigator to monitor the metabolic state of the preparation during the experiment. These relatively simple additions to the standard heart perfusion system provide a unique insight into the metabolic state of the heart wall in addition to conventional measures of contraction, perfusion, and substrate/oxygen extraction.

Here we introduce a method for using an intra-ventricle optical catheter in perfused hearts to perform absorbance spectroscopy across the heart wall. The data obtained provides robust information on tissue oxygen tension as well as substrate utilization and membrane potential simultaneously with cardiac performance measures in this ubiquitous preparation.

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

Absorbance spectroscopy of cardiac muscle provides non-destructive assessment of cytosolic and mitochondrial oxygenation via myoglobin and cytochrome ...