Este novo protocolo permite ao investigador monitorar múltiplos parâmetros metabólicos, incluindo oxigenação citosolica e mitocondrial, bem como o estado de redox citosolico. Ao medir simultaneamente as medidas tradicionais da função miocárdio. A principal vantagem dessa técnica é um simples monitoramento dinâmico não destrutivo de elementos importantes do metabolismo mitocondrial no coração perfumado que evita os artefatos associados à espectroscopia de reflexão.
Os novos nesta técnica podem ter dificuldade em inserir o cateter sem danificar a válvula e evitar contaminação da luz do quarto. O cateter deve ser inserido e ajustado cuidadosamente. A fibra de coleta também deve ser posicionada adequadamente para maximizar a luz transmitida através da parede livre ventricular esquerda, o que pode ser difícil.
Para começar corte um pequeno pedaço do apêndice atrial esquerdo e insira um cateter de fibra óptica no ventrículo esquerdo através da válvula mitral. Em seguida, gire-o para alcançar uma parede livre de ventrículo esquerdo iluminado. Conecte a outra extremidade da fibra de captação a um espectrômetro de varredura rápida.
Posicione a fibra óptica em frente à região de iluminação máxima do ventrículo esquerdo a cerca de um centímetro do coração. As fontes de luz do quarto devem ser zero. A rotação do cateter e o posicionamento da fibra óptica de captação devem ser ajustados para obter luz adequada sem saturação do detector.
Desligue as luzes na área experimental para obter a escuridão completa. Inicie o programa personalizado que incorpora drivers de espectrômetros para realizar a aquisição de dados e análise em tempo real da luz transmitida. Navegue por todas as opções de seleção de prompts para o modo de aquisição de espectroscopia cardíaca perfumada.
Na próxima página indicam se a coleta de dados auxiliares está ocorrendo. Finalmente digite parâmetros de aquisição, incluindo a localização de espectros de referência cromoforo e dados a serem salvos. Agora digite uma largura de banda de 490 a 630 nanômetros.
Digite uma taxa de amostragem de dois hertz. Colete uma corrente escura ou espectro de luz zero para corrigir os níveis de sinal de fundo desligando a fonte de luz. Clique para selecionar as referências de cromoforeiro desejadas a serem usadas na rotina de montagem.
Na página de dados de aquisição ajuste a posição do cateter e da fibra de captação para maximizar a luz transmitida exibida no software com atenção específica à amplitude do sinal na região de 500 nanômetros onde devem ser observadas as absorvâncias de mioglobina oxigenadas. Certifique-se de que a luz transmitida não está saturando o detector na região de 600 nanômetros. Certifique-se de que nenhuma fonte de luz externa contribua para o espectro coletado desligando a iluminação do cateter e confirmando que nenhuma luz é detectada agora.
Inicie a coleta de dados clicando no botão Salvar espectros. Clique em Definir como Controle para visualizar o espectro de absorção de diferença de espectros futuros em relação ao espectro de controle atual. Neste ponto, realize qualquer perturbação fisiológica como desejado.
Por exemplo, para determinar os efeitos da cyanidina no desempenho cardíaco e na absorção do cromoforo, pare a recirculação do perfusato para evitar a reciclagem de cianeto. Use uma bomba de seringa para injetar cianeto em diferentes taxas no perfusato pouco antes da cânula aórtica para alcançar as concentrações desejadas de cianeto no perfusato que flui para o coração. Monitore simultaneamente a função cardíaca e as propriedades ópticas.
Pare a bomba de seringa de cianeto quando os efeitos do fluxo coronário e da frequência cardíaca, juntamente com a transmissão óptica através da parede cardíaca estão em estado estável. Cinco minutos depois de parar a infusão de cianeto, troque o gás borbulhante de 100% de oxigênio para 100% nitrogênio para remover oxigênio do sistema. Após cerca de 10 minutos pare o fluxo para simular uma condição isquêmica e hipoxica total.
Para análise de dados espectrais, execute o programa no modo de análise cardíaca perfundido. Selecione o programa de análise apropriado. Digite o caminho do arquivo de dados e o arquivo spectra de referência.
Selecione a fonte de luz do cateter que carrega o espectro pré-salvo da fonte de luz do cateter. Selecione Ler dados de lixo. Em seguida, selecione Definir comprimento de onda mínimo e máximo.
Digite a largura de banda para a análise de dados como 490 a 630 nanômetros. Selecione Retornar ao menu principal e, em seguida, selecione Ler referências. Confirme o espectro de referência para uso na análise.
Selecione Retornar ao Menu Principal e, em seguida, selecione Pontos de Tempo no menu principal. Agora selecione um ponto de tempo zero como o controle e defina o intervalo para 100 pontos. Selecione também um ponto de tempo como o período experimental em uma faixa de 100 pontos.
Observe o espectro de diferença bruta na guia Spectrum de absorção média. Selecione Calcular coeficientes de ajuste e, em seguida, clique na guia Coeficientes de ajuste para observar o curso de tempo do ajuste retrospectivo. Retorne ao menu principal e selecione Calcular absorção de diferença.
Selecione o tempo zero e a diferença entre o tempo zero e o tempo um em todas as posições. Observe o espectro instalado na janela de espectro diferente e os elementos de montagem na janela de peso de referência. Repita este procedimento para comparar outros pontos de tempo no experimento.
Volte para o menu principal. Salve dados e análises em um relatório de planilha digitando em um nome desejado e selecionando Salvar dados para análise suplementar com outros programas. Mostrado aqui é o espectro do cateter e o espectro bruto da luz transmitida da parede livre do coração do coelho.
Esses dados revelam uma atenuação muito grande da luz na região azul do espectro. No entanto, as faixas de absorção da mioglobina e dos citocromos mitocondriais podem ser observadas diretamente entre 490 e 580 nanômetros na inserção. O espectro de diferença do controle e do coração tratado com cianeto é mostrado aqui.
O espectro fit é calculado a partir do espectro de referência. O espectro residual é a subtração do ajuste dos dados brutos. Mostrado aqui estão amplitudes de espectro do espectro de referência.
Fortes aumentos na absorção da maioria dos citocromos são observados à medida que o fluxo de elétrons pela cadeia citocromome foi bloqueado por cianeto no estado estável. Além disso, a absorção da mioglobina oxigenada aumentou à medida que o consumo de oxigênio foi eliminado por cianeto. O espectro de diferença da lavagem de cianeto versus injeção de cianeto revela uma reversão parcial do efeito cianeto.
Mostrado aqui é o espectro de diferença do estado de isquemia sem fluxo versus controle. Este espectro representa o estado totalmente desoxigenado e reduzido das mitocôndrias citosolentes verus a condição de controle. Estamos estudando os efeitos do óxido nítrico no metabolismo cardíaco.
Além dos cromóforos acima mencionados, também podemos rastrear outras espécies opticamente detectáveis, incluindo metmyoglobina gerada por óxido nítrico. Além disso, o cateter pode ser conectado a um laser para estudar o metabolismo lipídico usando espectroscopia raman. O metabolismo cardíaco de cálcio também pode ser estudado pela absorção de sondas de cálcio incorporadas exógenos ou geneticamente.
