O AVC é a principal causa de mortalidade e incapacidade em todo o mundo. Embora a trommólise e a remoção cirúrgica da oclusão vascular cerebral possam ser realizadas em pacientes selecionados, ainda há uma necessidade urgente de terapias eficazes contra o AVC. Aqui, demonstramos uma entrega intra-arterial baseada em cateteres de células-tronco para o hemisfério isquêmico como um regime potencial para a terapia de derrame.
Primeiro, introduzimos como preparar o cateter de injeção e ganchos cirúrgicos. Projetamos dois tipos de cateteres de injeção para injeção intra-arterial. O design um é usado para injeção de uma solução ou suspensão que não exija descarga do tubo.
O design dois permite a injeção de células-tronco neurais, seguido por uma descarga do volume morto para entregar o volume total. Para construir um conjunto de cateteres de injeção, você precisará de 26 agulhas de calibre e 20, um comprimento de 10 a 15 centímetros de cateter MRE 25 e três centímetros de comprimento de cateter MRE 50 e MRE 10. Corte as duas pontas da agulha e polir a extremidade metálica na lixa para reabrir o tubo e suavizar as bordas e, em seguida, lavar com água destilada para limpar o furo e lavar os detritos.
A figura mostra uma extremidade fechada de uma agulha calibre 20 depois de cortar a ponta da agulha, que é reaberta com um furo liso após o polimento. Sob um microscópio, insira a agulha de calibre 20 na extremidade da tubulação MRE 50. Dobre a agulha de calibre 26 e, em seguida, penetre o tubo abaixo do final da ponta da agulha de calibre 20.
Fixar a agulha de calibre 26 com super cola. Em seguida, incorpore os dois cubos de agulha e o tubo e epóxi para construir um bloco sólido para aumentar a força. Você também precisará de três ganchos cirúrgicos para manter o tecido em posição para melhor exposição dos locais cirúrgicos.
Corte um eixo de agulha de um centímetro e meio a dois centímetros de comprimento de uma agulha calibre 27 e polir ambas as extremidades em lixa até ficar maçante. Use um pequeno grampo hemostático para dobrar o eixo em um gancho em uma extremidade e um anel em forma de anel na outra extremidade. Insira um cateter MRE 25 de 10 a 15 centímetros de comprimento através do anel e fixe com fita cirúrgica clara.
Faça mais dois ganchos usando o mesmo método. Os ganchos e o sistema de cateter devem ser encharcados durante a noite em 70% de etanol para esterilização. Todos os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Kentucky.
Usamos o cérebro de camundongo embrionário ent para cultivar GFP, células-tronco neurais positivas. Os embriões positivos GFP podem ser facilmente visualizados no canal FITC em um microscópio fluorescente. Enquanto embriões do tipo selvagem não mostram fluorescência usando a mesma exposição.
A autofluorescência de embriões do tipo selvagem só é visível quando o tempo de exposição é aumentado 100 vezes. O córtex embrionário é coletado e usado para estabelecer culturas de células-tronco neurais seguindo o protocolo do fabricante. Essas células-tronco neurais podem formar neurosferas e podem ser passagem ao longo de 10 gerações e podem se diferenciar em glia são neurônios.
Painel de marcadores de células-tronco embrionárias como nanog, SSEA1, Oct4 e Sox3 pode ser usado para identificar as propriedades das células-tronco enquanto estão nas neurosferas. As neurosferas foram cultivadas na mídia, seguindo o protocolo do fabricante e o uso entre as passagens três e cinco para a entrega de células-tronco neurais. O derrame isquêmico foi induzido no hemisfério esquerdo para camundongos e ratos, usando um filamento à base de oclusão da artéria cerebral média, MCAO com algumas modificações dependendo da espécie.
Em camundongos, o filamento é inserido através da artéria carótida comum, CCA e avançado na artéria carótida interna, ICA. Enquanto em ratos, o filamento é introduzido através da artéria carótida externa, ECA no ICA por causa do maior espaço de trabalho. Aqui demonstramos a cirurgia do rato.
Depois de fazer uma incisão midline ao longo do pescoço, separe os tecidos subjacentes usando dissecção contundente. Use os três ganchos microcirúrgicos feitos de eixos de agulha de calibre 27 para obter um campo visual melhor. O quadrado preto indica a área cirúrgica para o próximo passo.
A camada muscular acima da CCA esquerda está cuidadosamente aberta para expor a CCA esquerda e o nervo vago. Siga a CCA até chegar e identificar a bifurcação. Deve-se ter cuidado para não esticar, deslocar ou espremer este nervo CCA ou vagus.
Abra cuidadosamente o tecido conjuntivo claro, cobrindo o nervo CCA e vagus. Liberte o espaço por baixo desta CCA com uma ponta dos fórceps e isole a haste CCA o máximo possível. Enfie uma sutura cirúrgica de nylon trançada de seis fios duplos sob a CCA.
Corte o ponto do meio para deixar para suturas subjacentes à CCA. Coloque outra sutura de nylon sob a CCA. Amarre um slipknot na sutura superior, mantendo-o solto.
Separe as duas suturas inferiores. Amarre um nó de deslizamento com a sutura do meio, mantendo-o solto por enquanto. Amarre o nó de um cirurgião com uma sutura inferior e mova-o para a extremidade proximal o mais longe possível.
Apare as pontas da sutura. Expor ainda mais a CCA além da bifurcação. Empurre o deslizamento solto superior para a bifurcação e aperte-o para evitar o fluxo de sangue.
Coloque a borracha de silício revestida de 70 mcao de nylon ao lado da CCA. Usando micro tesoura, corte uma pequena incisão na CCA, ao lado do nó inferior. Insira a ponta da sutura de MCAO na CCA através desta incisão e avance-a até o nó superior.
Ajuste a posição do nó médio e aperte-o até que possa manter a sutura de MCAO na posição. Não aperte excessivamente o nó. Solte o nó superior, mas faça outro nó de deslizamento solto no mesmo local.
Avance a sutura de MCAO para o ICA. Confirme se a sutura de MCAO passa a bifurcação para o ICA. O caminho da sutura deve ser relativamente reto, entrando mais fundo no tecido à medida que avança.
Verifique o marcador de prata na extremidade da sutura. Certifique-se de que ele atinge a bifurcação. Verifique novamente a direção da sutura MCAO.
Ajuste nós superiores e médios para garantir que não haja vazamento de sangue. Avance ainda mais a sutura de MCAO, aperte os dois nós superiores para fixar a sutura de MCAO no lugar. Comece a gravar o tempo para uma hora de isquemia.
Depois de uma hora de isquemia, anestesiamos o animal e reabrimos a ferida da pele. Exponha a área cirúrgica. Localize os deslizamentos superiores e médios.
Solte suavemente o nó superior. Puxe suavemente a sutura de MCAO até que a parte de borracha de silicone branca atinja o nó médio. Aperte o nó superior para segurar a sutura de MCAO no lugar para evitar sangramento.
Solte suavemente o slipknot do meio. Retire a sutura de MCAO até que sua extremidade passe o nó superior. Aperte o nó superior.
Coloque o slipknot médio logo acima da incisão na CCA. Aperte o slipknot do meio. Remova o nó superior.
Apare as extremidades da sutura do nó médio. Feche a ferida da pele e deixe o animal se recuperar. Com base em nossa experiência, células-tronco neurais injetaram com segurança através desta rota arterial entre um e três dias após o derrame.
Novamente, há pequenas variações entre cirurgias de camundongos e ratos para injeção neural de células-tronco. E aqui demonstramos a cirurgia do rato. No terceiro dia pós-derrame, anestesiar o animal, reabrir a ferida e re-expor a CCA.
Coloque uma sutura cirúrgica de dois fios sob a CCA e corte-a no ponto médio para obter duas suturas. Coloque as duas suturas corretamente. Faça um slipknot com a sutura superior.
Coloque-o logo abaixo da bifurcação. Aperte o slipknot superior. Faça outro slipknot com a sutura do meio.
Corte uma pequena incisão bem acima do nó aparado restante da cirurgia de derrame. Corte a ponta do cateter MRE 10 com um ângulo de aproximadamente 45 graus. Use esta extremidade afiada para entrar na incisão na CCA.
Tenha cuidado para ajustar corretamente o ângulo de entrada e a força usada para inserir o cateter. Caso contrário, o cateter não pode entrar na CCA ou pode perfurá-lo. Insira o cateter e avance até que a ponta atinja o nó superior.
Aperte o slipknot médio para manter o cateter no lugar e certifique-se de que não há ligação sanguínea. Solte o nó superior. Faça um nó de deslizamento com a sutura superior.
Ajuste o ângulo do cateter dentro da CCA e as posições de ambos os nós até que um rápido fluxo de sangue seja visível, indicando uma comunicação bem sucedida entre o cateter e o fluxo CCA. Ligue a bomba de seringa. O sangue no cateter será devolvido ao CCA.
Termine a injeção depois de cinco minutos. Ligate o nó superior. Solte o nó do meio e retire o cateter.
Ligate o nó do meio. Aparar todos os nós. Feche a ferida e deixe o animal se recuperar.
Após a injeção intra-arterial, as células-tronco neurais rotuladas por GFP são encontradas principalmente no hemisfério ipsilateral. Aqui, mostramos a distribuição no giro dento hipocampal dento em um dia após a injeção. No hemisfério ipsilateral, algumas das células-tronco neurais positivas do GFP localizadas no córtex e estriato, expressam cort duplo, um marcador de neurônios imaturos.
Estas são imagens representativas de animais falsos e de derrame com ou sem injeção neural de células-tronco aos sete dias após a injeção. Aos 30 dias após o parto, apenas a fluorescência automática menor pode ser detectada através do canal FITC nos animais que recebem injeção do veículo. Enquanto em células-tronco injetavam animais, células-tronco neurais rotuladas gfp podem ser encontradas no cérebro ferido com expressão de vários marcadores celulares como o marcador gleo GFP ou o marcador neuronal tujuan.
As setas brancas em cada imagem indicam células-tronco neurais expressando marcadores GFP ou tujuan, respectivamente. Em conclusão, a injeção intra-arterial é um método viável para a entrega de células-tronco neurais para terapia de derrame. Células-tronco neurais podem sobreviver e se diferenciar em diferentes tipos de células dentro do cérebro ferido.
E, finalmente, o método de injeção intra-arterial introduzido aqui também pode ser usado para a entrega de soluções e suspensões.
