O apoio financeiro da dell&#39;Istruzione Ministero, della Ricerca dell&#39;Universita (PRIN-2009K3RH7N_002) e Marie Curie Fellowship intra-europeu (CYCLOGUO-298555), bem como o patrocínio da Acção COST CM0603 em &quot;Radicais Livres em Biologia Química e Acção COST CM1201 em &quot;Química Biomimetic Radical&quot; Agradecemos imensamente.

1. Síntese de Mono-trans de ésteres de colesterilo <ol><li> Dissolver os ésteres de colesterilo (linoleato de colesterilo ou araquidonato éster) em 2-propanol (15 mM). Para uma melhor solubilização, as amostras foram sonicadas durante 15 min sob atmosfera de árgon. </li><li> Transferir a solução para um reactor de quartzo fotoquímica, adicionar 2-mercaptoetanol em 2-propanol (a concentração atingir 7 mM, a partir de uma solução-mãe 2 M de tiol). Lavar a mistura de reacção com árgon, durante 20 min, a fim de eliminar a presença de oxigénio na solução. </li><li> Irradiar a mistura reaccional através de luz UV usando uma lâmpada de mercúrio de baixa pressão de 5,5 W a 22 ± 2 ° C durante 4 min. Monitor analítico Ag-TLC (cromatografia de prata fina camada) a evidência da formação de ésteres de colesterilo mono-trans (veja a Figura 1 para as fórmulas químicas). A coloração de TLC é levada a cabo, vertendo a placa na solução de molibdato de amónio e cério (CAM), e as manchas aparecem no aquecimentoa placa. Extingue-se a reacção numa fase inicial, a fim de recuperar o material de partida, que pode ser reutilizado para executar outras rondas de isomerização, a obtenção de um aumento do rendimento global. </li><li> Recolher a mistura reaccional num balão de fundo redondo, lavando o aparelho com alguns ml de 2-propanol. Remover o solvente e purifica-se os isómeros trans de mono-ésteres de colesterilo por TLC-Ag, como descrito na literatura. 5 Utilização de hexano-éter dietílico (9:1 v / v) como eluente para mono-trans linoleato de colesterilo isómeros, ao passo que o uso de hexano -dietil éter-ácido acético (9:1:0,1 v / v) para mono-trans de colesterilo do ácido araquidônico. </li></ol> 2. Isolamento da fracção éster de colesterol a partir de soro humano <ol><li> Diluir 1 ml de soro humano (obtido por centrifugação do sangue) com 1 ml de salmoura e verter a solução para um funil de separação e sob uma corrente de árgon, a fim de evitar artefactos (por exemplo, aductos de oxidação). Adicionar 10 ml de clorofórmio-metanol (2: 1 v / v) três vezes. Agitar o funil de separação muito lentamente, a fim de limitar a formação da emulsão devido à presença de albumina. </li><li> Lavar as camadas orgânicas uma vez com salmoura (10 ml), em seguida, recolher em um balão de Erlenmeyer sob um fluxo de árgon, seca-se sobre sulfato de sódio anidro. Remover os voláteis por evaporação rotativa para proporcionar um óleo amarelo (fracção de lípido total de plasma). </li><li> Tome-se o produto em bruto com 1 mL de clorofórmio-metanol (2:1 v / v), para uma carga de TLC preparativa sob uma corrente de árgon, e utilização de uma mistura de hexano-éter dietílico (9:1 v / v) como eluente . Raspar a porção de sílica que contém a fracção de ésteres de colesterilo e despeje em um frasco. Em seguida, extrair de sílica (3 × 5 ml) com clorofórmio-metanol (2:1 v / v), as camadas orgânicas recolher e remover o solvente para se obter, após a evaporação da fracção pura de ésteres de colesterilo (normalmente a ~ 1,5 mg). </li><li> Mantenha ésteres de colesterol num frasco escuro coberto por folha de alumínio sob atmosfera de árgon e armazenar a -20 ° C. Colesterol esters são sensíveis à luz e ao oxigênio. </li></ol> 3. Caracterização de Mono-trans ésteres de colesterilo por Espectroscopia Raman <ol><li> Extrair ésteres de colesterol a partir do soro humano (≥ 0,7 mg), tal como descrito na secção 2, dissolve-se numa pequena quantidade de tetracloreto de carbono (≤ ul 10) e colocar num frasco. CCl 4 é seleccionado como solvente porque o seu sinal de Raman não se sobrepõe com a região de interesse de análise de ésteres de colesterilo. </li><li> Transferir a solução para o porta-amostras por meio de uma pipeta de vidro descartável, em seguida, cuidadosamente remover o solvente por meio de uma corrente lenta de árgon. Uma vez que um filme uniforme oleosa é formada na parede interna do recipiente de amostra, colocar este último dentro do instrumento de medição. </li><li> Transformada de Fourier do espectro de Raman de ésteres de colesterilo é obtido directamente sobre os extractos de lípidos, sem qualquer reacção de derivatização. A potência do laser sobre a amostra for &lt;100 mW, para evitar danos amostra. O número total de verificaçõespara cada espectro é ≥ 800 para minimizar o ruído de fundo. </li><li> A gama de 1,700-1,630 centímetros -1 do espectro Raman é analisado uma vez que reflecte a contribuição dos C = C ligações duplas presentes na molécula (C = C que se estende de modo). A análise da curva de ajuste é realizado nesta região, permitindo assim a distinção das contribuições sobrepostas de cis e trans de ligações duplas na cadeia de alquilo gordo e dupla ligação no anel B de colesterol (ver a Figura 2). </li><li> Para ajustar corretamente as bandas vibracionais, alguns parâmetros devem ser fixados ou constrangido dentro de limites razoáveis. Os perfis de pico de componentes são descritos como uma combinação linear de Lorentz e funções gaussianas, enquanto que as larguras de banda de meia altura são melhor determinado pela rotina de optimização computador. O número e a posição dos picos de componentes são obtidos utilizando o espectro de quarto derivado, que permitem a detecção de componentes também algumas bandas fracas. Uma vez que o sinala taxa de ruído que se deteriora na diferenciação do sinal pode impedir a utilização do derivado de quarto, alisou quarto derivados com um 13-point função Savitsky-Golay, são de vantagem, portanto, um certo compromisso entre a resolução e relação sinal-ruído é obtida . Encaixe melhor curva são obtidos em menores possíveis c dois valores. </li><li> A presença de isómeros trans é revelado pelo componente em 1671 ± 1 cm-1, para além de, pelo menos, os dois componentes, ligeiramente deslocado para frequências mais baixas, devido à cadeia de ácido gordo e de colesterol C = C ligações duplas. Espectro de Raman representativo do éster de colesterilo no plasma é mostrado na Figura 9. Na inserção da comparação de uma região específica de colesterol linoleato e mono-trans isómeros ácido linoleico colesteril é mostrado. </li></ol> 4. A derivatização de ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME) e análise por cromatografia gasosa acoplada <ol><li> Dissolverésteres de colesterilo (~ 1,5 mg) com 0,5 ml de uma solução 1 M de hidróxido de sódio em benzeno-metanol (2:3 v / v) e colocar num frasco escuro coberto por folha de alumínio sob atmosfera de árgon. </li><li> Deixar a mistura em agitação à temperatura ambiente e do monitor por TLC utilizando uma mistura de hexano-éter dietílico (9:1 v / v) como eluente. O tempo de reacção é geralmente de 30 minutos, mas um controlo cuidadoso da reacção é necessária. De facto, uma vez que os ésteres metílicos correspondentes são formados, a reacção deve ser arrefecida, a fim de evitar a formação de produtos de degradação e de lado. A TLC mostrou que a formação quantitativa dos ésteres metílicos. </li><li> Extingue-se a mistura de reacção por adição de 1 ml de salmoura e extrai-se os ésteres metílicos com n-hexano (3 x 2 ml). Recolher as camadas orgânicas para um frasco e remover o solvente por evaporação rotativa para dar a fracção de éster de metilo, que é então utilizado para a análise de GC sem purificação adicional. </li><li> Dissolver os ésteres de metilo em uma quantidade mínima de n-hexano (normalmente 1 mg em 50 ul) e injectar no GC equipado com uma altura de 60 m × 0,25 mm × 0,25 ^ m (50%-cianopropil)-metilpolissiloxano de coluna. Utilizar um detector de ionização de chama (FID) com o programa de forno seguintes: temperatura inicial de 165 ° C, parado durante 3 min, seguido por um aumento de 1 ° C / min até 195 ° C, manter durante 40 min, seguido por um segundo um aumento de 10 ° C / min até 240 ° C, e manter durante 10 min. Um modo de pressão constante (29 psi) é escolhido. Hélio ou o hidrogénio, pode ser utilizado como gás de transporte. Os ésteres metílicos são identificados por comparação com os tempos de retenção de amostras autênticas. Figura 10 mostra uma análise representativa de GC FAME obtidos a partir de ésteres de colesterilo no plasma. </li></ol> 5. Síntese de (5&#39;R) - e (5&#39;S) -5 &#39;, 8-ciclo-2&#39;-desoxiadenosina <ol><li> Dissolver 33 mg de 8-bromo-2&#39;-desoxiadenosina (8-Br-dado) em acetonitrilo (100 ml), a fim de chegar a uma concentração de mM. Regular o fluxo de gás (Ar ou N2) na fotorreator e encher o appaRatus com a solução de 8-Br-Dado. </li><li> Preparar um septo com o tamanho apropriado para a entrada fotorreator e passar uma agulha ligada à linha de gás inerte através do centro do mesmo. Fechar o sistema com o septo. Lave o gás inerte durante 30 min. </li><li> Irradiar com luz UV utilizando uma lâmpada de mercúrio de média pressão de 125 W a 22 ± 2 ° C durante 15 minutos, recolher a solução para um balão de 250 ml de fundo redondo. Lava-se a foto-reactor, com 10 ml de acetonitrilo e recolher líquido de lavagem no mesmo balão. </li><li> Extingue-se a mistura reaccional em bruto com 1 M de solução de NH OH 4 e evapora-se o solvente no evaporador rotativo. </li><li> Executar alto desempenho de análise de cromatografia líquida (CLAE-UV) com coluna analítica (ver secção instrumentação), sob condições conhecidas, e comparar o perfil com compostos de referência. </li><li> Executar alto desempenho análise por cromatografia líquida (HPLC-UV) com uma coluna analítica (ver secção instrumentação) usando o seguinte solrespiradouros e gradientes: 2 mM de formiato de amónio como solvente A e acetonitrilo como solvente B. Definir a taxa de fluxo de 1 ml / min e o gradiente de 0% de solvente B a 0,3% do solvente B a ser alcançado em 2,2 min. Então B 0,8% em solvente em 4,0 min, em seguida, 1% de solvente B em 4,8 min. Permanecem em 1% de solvente B durante 9 min e, em seguida, passar a 8% de solvente B em 6 min. Depois de passar para 10% do solvente B em 4 min e a 30% de solvente B em 5 min e manter a 30% de solvente b para 5 min outro. Recolher os picos cromatográficos correspondem aos dois produtos diastereoméricos em dois frascos diferentes. </li><li> Medir as absorvâncias das duas fracções recolhidas no espectrofotómetro de UV e calcula a concentração exacta com base na lei de Beer-Lamber (A εlC =, em que A é a absorvância, ε o coeficiente de extinção e l o comprimento da célula). Use a ε coeficiente de extinção da 2&#39;-desoxiadenosina (Dado) (15.400 M -1 cm -1 a 260 nm). </li></ol> 6. Síntese de (5&#39;R) - umd (5&#39;S) -5 &#39;, 8-ciclo-2&#39;-desoxiguanosina <ol><li> Dissolver 35 mg de 8-bromo-2&#39;-desoxiguanosina (8-Br-dGuo) e 30 mg de iodeto de sódio (NaI), em água destilada (100 ml) de modo a atingir a concentração 1 mM e 2 mM, respectivamente. Regular o fluxo de gás inerte (Ar ou N2) conectado ao fotorreator e encher o fotorreator com a solução de reacção. </li><li> Degass da mistura de reacção como descrito no procedimento 5 (etapa b). </li><li> Irradiar com luz UV utilizando uma lâmpada de mercúrio de média pressão de 125 W a 22 ± 2 ° C durante 30 minutos, recolher a solução para um balão de 250 ml de fundo redondo. Lava-se a foto-reactor, com 10 ml de água e recolher líquido de lavagem no mesmo balão. </li><li> Extingue-se a mistura reaccional em bruto com 1 M de solução de NH OH 4 e evapora-se o solvente sob vácuo. </li><li> Realizar análise conforme descrito no Procedimento 5 (passos E a G). Use a ε coeficiente de extinção da 2&#39;-desoxiguanosina (dGuo) (11.700 M -1 cm -1 a 260 nm). </li></ol> 7. Síntese de purina Labeled isotópica (5&#39;R) - e (5&#39;S) -5 &#39;,8-cyclonucleosides <ol><li> Preparar 2 ml de 1 mM de solução aquosa (água destilada) dos 15 N isotópica nucleósidos de purina marcados ([15N 5] Dado ou [15N 5] dGuo) num frasco de vidro (4 ml), com uma tampa de septo. </li><li> Ligue o frasco com a tampa de septo e conectar-se a linha de gás (N 2 O para a saturação da solução) através de uma agulha no septo que atinge o fundo do frasco. Outra pequena agulha no septo tampa funciona como a saída de gás. </li><li> Lavar a solução com N 2 O durante 30 min. O caudal de gás é regulado para ser muito baixa. </li><li> A agulha de saída é primeiro retirada e depois de 1 &#39;a um tempo decorre, a fim de ter uma pequena pressão no interior do frasco. </li><li> Colocar a solução no aparelho da radiólise gama de 8 horas (com base no cálculo de uma taxa de dose de ca. 4,5 Gy / min). </li><li> Depois de temperar a reacção em bruto com 1 M de NH 4 </sub&gt; OH solução. </li><li> Executar alto desempenho análise por cromatografia líquida (HPLC-UV), sob condições conhecidas, 6 e comparar o cromatograma com as referências padrão. </li></ol> 8. Radiólise gama de soluções de DNA aquosas <ol><li> Prepare 1 ml de 0,5 mg / ml de solução (água destilada) de ADN de timo de vitelo e colocado em um frasco de vidro (2 ml), com uma tampa de septo. </li><li> Degass a reacção conforme descrito no Procedimento 7 (passos bd). </li><li> Colocar a solução no aparelho da radiólise gama de 30 min (com base no cálculo de dose / taxa de ca. 4,5 Gy / min). </li></ol> 9. Digestão enzimática de DNA <ol><li> Para um tubo de Eppendorf contendo 80 ug de ADN, adicionar 8 U de nuclease P1, 0,01 U de fosfodiesterase II, 20 nmol de EHNA em 20 ul de acetato de sódio 300 mM (pH 5,6) e 10 mM de cloreto de zinco. Incubar a mistura a 37 ° C durante 48 horas. </li><li> De seguida, adicionar uma mistura de 8 U de fosfatase alcalina, 0,02 U de phosphodiesterase I, em 40 ul de 0,5 M de tampão Tris-HCl (pH 8,9) para a digestão mistura. A amostra é incubada a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> A mistura é neutralizada pela adição de 10% de ácido fórmico. </li><li> Transferir a amostra para um Ultra-0.5 Amicon dispositivo centrífugo de filtro (corte de 3 kDa), adiciona-se 200 ul de H 2 O. tridistilled Coloque a Ultra-filtro para o rotor de centrífuga a 14.000 xg durante 15 min. Em seguida, separar o dispositivo Ultra filtro do tubo de microcentrífuga. Liofilizar a solução de enzima livre no tubo de microcentrífuga. </li></ol> 10. Dessalinização DNA da amostra antes da análise <ol><li> Executar alto desempenho de análise de cromatografia líquida (CLAE-UV) com coluna analítica (ver secção instrumentação), seguindo as condições conhecidas. 6 </li><li> Dissolve-se o DNA digerido liofilizado em 20 ul de H2O e injectar no HPLC-UV. </li><li> Coletar a amostra em um frasco após a eluição de sal (primeiros minutos) e à direita antes do tim eluiçãoe do nucleósido primeiro (5&#39;R-cdGuo), até ao final do programa cromatográfica. </li><li> A amostra é liofilizada e ressolubilizado em 20 ul de água. </li></ol> 11. Análise Quantitativa LC-MS/MS <ol><li> Preparar os HPLC-MS/MS (quadrupolo triplo) antes de iniciar a análise, carregando o método analítico e do método para o detector de MS (ESI) 6. </li><li> Adicionar 1 ul da mistura isotópica de compostos marcados na amostra preparada no Procedimento 7. </li><li> Injectar 20 ul da solução de DNA digerido com cravos em água destilada. </li><li> Os dados cromatográficos obtidos são elaboradas a partir de calibração com compostos de referência anterior. A HPLC representativo executar contendo adenosina e guanosina 2 &#39;-desoxiribonucleósidos e seus derivados oxidativos e cyclo é mostrado na Figura 11. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

A conversão de ocorrência natural de ácidos gordos insaturados cis para trans isómeros geométricos é uma transformação relacionada com a produção de stress radical no ambiente biológico. Lipidos da membrana celular, que contêm os ácidos gordos, é um alvo relevante para o stress biológico e radical que primeiro estudou a endógeno isomerização cis-trans fosfolípidos em culturas de células, animais e seres humanos que avaliam protocolos analíticos em cada caso. 8-10 Foi demonstrado que esta transformação pode ocorrer através de uma variedade de compostos contendo S, incluindo tióis, tioéteres e dissulfetos, que, sob diferentes condições de stress radicais são capazes de gerar radicais thiyl, ou seja, o agente de isomerização (Figura 3). O exemplo mostrado no artigo centra-se na classe de ésteres de colesterilo, que representam uma fracção muito conhecido de lípidos no plasma, estritamente envolvido no metabolismo das lipoproteínas. A ligação éster entre os ácidos gordos e chorol é biossintetizado pela transferência de ácidos gordos a partir da posição 2 da porção de glicerol de fosfatidil de colesterol, um passo catalisado pela enzima acil lecitina colesterol transferase (LCAT). Por isso, os ésteres de colesterol no plasma são estritamente relacionado com o volume de negócios lipídica da membrana, e contêm proporções relativamente elevadas dos ácidos gordos poli-insaturados (PUFA), tipicamente presentes em fosfatidilcolinas, isto é, linoleico e os ácidos araquidónico. Formação de lipoproteínas está envolvido em doenças cardiovasculares e metabólicas. A reactividade de ésteres de colesterilo naturais com os radicais livres podem ocorrer nas ligações duplas de linoleato e resíduos de ácido araquidônico, que podem ser transformados nos correspondentes isómeros geométricos trans (ver Figura 1 para as estruturas). Caracterização do teor de éster de colesterilo trans em amostras biológicas é interessante para o desenvolvimento de biomarcadores. Uma metodologia indirecta consiste na transformação de cholesteryésteres de l, isolada de plasma para os correspondentes ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME) e separação por protocolos cromatográficos de gás. Neste caso, a calibração das referências normalizadas de cis e trans de ésteres metílicos de ácidos gordos é executada, a fim de permitir a quantificação do teor de trans nas amostras. Com base nos estudos analíticos realizados sobre a biblioteca de éster de colesterilo, propôs-se aplicar também um método baseado na espectroscopia de Raman, que pode ser realizada directamente sobre a fracção de ésteres de colesterilo, isolada de plasma, sem derivatização após a FAME correspondente (ver Figuras 2 e 9). É interessante notar que até agora não existem métodos de sucesso são descritos para cis separado e isômeros trans de ácidos graxos contendo lipídios por HPLC, em vez como descrito por hidroperóxidos de éster de colesterol. Até agora, o método de cromatografia de gás indireta ainda é o melhor método disponível até agora. Por este método o primeiro quantitativa avação do conteúdo mono-trans a partir de ésteres de colesterol derivado isolado a partir de plasma de indivíduos saudáveis ​​foram fornecidas. Usando Detector de Ionização de Chama (FID) do limite de detectabilidade é satisfatório (ppb) e as quantidades nanomolares dos compostos foram detectados. 5. Com sistemas de detecção de diferentes este limite pode ser ainda reduzido. O efeito da radiação ionizante em ésteres de colesterol é matéria de estudos adicionais, se uma resposta linear é obtido em relação à dose aplicada. Como um segundo exemplo, escolhemos nucleósidos modificados que podem ser produzidos por radicais livres danos de DNA. Os radicais hidroxilo (HO •) são conhecidos por serem os mais prejudiciais Espécies reactivas de oxigénio (ROS) para a sua capacidade para causar modificações químicas de DNA. Lesões simples ou múltiplas podem ocorrer no DNA, que, em células eucarióticas está localizado no núcleo e as mitocôndrias. Identificação e medição das principais classes de oxidativos danos gerados ao DNA requerem o adequado doiate bibliotecas moleculares, a fim de definir os protocolos analíticos. Focamos nosso interesse sobre as lesões mais pequenas em tandem, os quais são purinas 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-desoxiribonucleósidos, tendo uma ligação covalente adicional entre a base e as porções de açúcar criadas pelo ataque de radicais livres. Os compostos são 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-desoxiadenosina e 5 &#39;, 8-ciclo-2&#39;-desoxiguanosina existente nos 5&#39;R e 5&#39;S formas diastereoméricas (Figura 5). O seu potencial para se tornar marcador de stress de radicais livres é a matéria de investigação fundamental. 2 Com efeito, quando o DNA é exposto a HO • abstração radical hidrogénio a partir da posição C5 &#39;do açúcar é um dos possíveis eventos que conduzem à formação destas lesões em tandem. Purina 5 &#39;,8-cyclonucleosides pode ser medido como a soma de diastereómeros por HPLC-MS/MS enzimaticamente digeridas em amostras irradiadas γ ADN variando 1-12 lesões / 10 6 nucleósidos / Gy indo ausência forma de oxigénio ao nível fisiológico de oxigénio Eutecidos n, a proporção diastereomérica 5&#39;R / 5&#39;S sendo ~ ~ 4 e 3 para 5 &#39;,8-cdAdo e 5&#39; ,8-cdGuo, respectivamente (Figura 11). 11 É interessante notar que a relação entre a dose de radiação e 5 &#39;,8-cdAdo e 5&#39; ,8-cdAdo lesões detectadas no ADN celular está longe de serem compreendidos. O experimento único baseado irradiação 2kGy relatado na experimental não podem ser considerados conclusivos. 11 Outras experiências deste tipo e quantificação do método dos quatro lesões são necessários para definir tais relações. A detecção destas lesões e as transformações oxidativas mais populares (tais como 8-oxo-2 &#39;-desoxiguanosina, 8-oxodGuo) são assunto de investigações intensas, evidenciando a importância de ambas as lesões durante o metabolismo oxidativo. 6,13 O uso de HPLC -MS/MS (quadrupolo triplo) tem um limite de detecção de cerca de 30fmol para todos os quatro lesões. Melhorias últimos são requeridas para alcançar limites de detecção dos níveis attomol pela produ instrumentoRCEs. Com base na literatura recente, 6 procedimentos analíticos têm de incluir a limpeza adequada da amostra e o enriquecimento, a fim de satisfazer os limites de detecção da MS / MS / MS (armadilha de iões) ou da MS / MS (quadrupolo triplo) usado no nosso caso. Bio-inspirados procedimentos de síntese de compostos 1-4 foram desenvolvidas a partir da 8-bromopurina derivados segundo ou fotólise. 7,12 Estes procedimentos envolvem a reacção em cascata radical que imita o mecanismo de dano do ADN de formação de 5 &#39;,8-cdAdo e 5&#39; ,8-cdGuo lesões. A partir de perspectivas biológicas, verificou-se que estas lesões se acumulam com o envelhecimento de um modo específico do tecido (fígado&gt; rim cérebro&gt;), fornecendo a evidência de que os mecanismos de reparação de ADN são inadequadas para preservar o material genético a partir de tais lesões. 13 Com efeito, a reparação de excisão de nucleótidos (NER) é o único caminho actualmente identificados para a reparação das lesões. 2 A classe doises de compostos mostrados nas Figuras 1 e 5 não estão comercialmente disponíveis no momento, no entanto, por as estratégias de síntese descritos na literatura, não seria difícil de preparar estes compostos para uso comercial. A abordagem multidisciplinar fornecida por estudos de biologia química não só tem um enorme valor para a identificação de novos mecanismos que ocorrem no ambiente biológico, mas também dá um contributo fundamental para a descoberta de biomarcadores e diagnóstico, em última análise, trazendo novidade em cuidados de saúde e estratégias de prevenção. 14 A contribuição química é necessária para um bom desenvolvimento da medicina molecular, criando plataformas integradas e painéis para perfis metabólicos, que se prevê venham a permitir uma óptima racionalização do desenho da intervenção, quer terapêutica e nutricional, reduzir as incertezas e falhas quando podem ser previsíveis.

A reatividade de radicais livres revelou sua enorme importância para muitos eventos biológicos, incluindo o envelhecimento e inflamação. Hoje em dia, é cada vez mais evidente que a clarificação de cada passo químico envolvido nesta reactividade é necessário, de forma a compreender os mecanismos subjacentes e estratégias prevêem eficazes para o controlo de radicais livres e de reparação dos danos. A contribuição dos estudos químicos é fundamental, mas o estudo direto no ambiente biológico pode ser difícil, uma vez que a sobreposição de diferentes processos complica e perturba a análise dos resultados e as conclusões relacionadas. Assim, a estratégia de modelação reacções de radicais livres em condições biologicamente relacionados tornou-se um passo fundamental na investigação de mecanismos químicos em biologia. Na última década, o nosso grupo desenvolveu modelos de processos do radical livre sob condições biomiméticos. Em particular, PTvisaged transformações biologicamente relevantes de ácidos graxos insaturados, nucleosídeos e enxofre contendo aminoácidos e colocá-los no caminho certo para ser avaliado e validado como biomarcadores do estado de saúde 1-4. Nossa abordagem geral consiste de três módulos: <ul><li> Síntese orgânica, que permite o acesso a biomoléculas modificadas adequadamente. O plano de síntese pode também ser concebido de forma a simular os processos de radicais livres que ocorrem no ambiente biológico, assim, a aplicação de condições capazes de simular o processo biológico de interesse, que é o princípio da química biomimética radical. Em modelos biomiméticos o meio de reacção é água ou um meio heterogéneo devido à coexistência de compartimentos hidrófilos e hidrófobos. A vantagem de trabalhar com modelos biomiméticos é ter um ambiente simplificado de reação com parceiros conhecidos, em que a reatividade e os produtos podem ser examinados com mais detalhes, possivelmente descobrindoquímicos novas vias. A partir deste passo informações mecanicista e cinética podem ser obtidas; </li><li> Análise, purificação e caracterização dos produtos, proporcionando informação estrutural e química das biomoléculas modificadas, a fim de organizar bibliotecas moleculares e facilitar recognition.in o ambiente mais complexo biológico. Os protocolos são estabelecidos tendo em vista também a resolução de misturas complexas de compostos, tais como aqueles derivados a partir de espécimes biológicos; </li><li> Desenvolvimento biomarcador utilizando amostras biológicas derivadas quer por experiências in vitro utilizando culturas de células e em estudos in vivo, a partir de animais e seres humanos. Os protocolos desenvolvidos em modelos biomiméticos são então aplicados à análise de amostras complexas, prever as transformações de radicais livres sob condições diferentes. Bibliotecas moleculares desenvolvidos por síntese são de grande ajuda para as descobertas das ciências da vida. A informação recolhida sobre os radicais livres transformações give a oportunidade de descobrir estratégias de reparação e prevenção. Bases de dados dos resultados pode ser utilizado para uma avaliação cuidadosa por análise multivariada do significado de biomarcadores, bem como possíveis factores associados. </li></ul> Nós escolhemos duas classes de biomarcadores para acreditar nesta abordagem: ésteres de colesterilo e de purinas 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-desoxiribonucleósidos.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>MATERIALS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesteryl linoleate &ge;98%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C0289-100 mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cholesteryl arachidonate&ge;95% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C8753-25mg</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2-mercaptoethanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M6250-100 ml</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2-propanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34965-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Methanol 215 SpS </td>
 <td>Romil</td>
 <td> H409-2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ethanol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>02860-2.5L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Chloroform SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H135 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> n-Hexane 95% SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td> H389 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetonitrile 230 SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H047 2,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Dichloromethane SpS</td>
 <td>Romil</td>
 <td>H2022,5 L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Carbon tetrachloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>107344-1L </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383112-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium hydrogen carbonate</td>
 <td>Carlo Erba</td>
 <td>478536-500 g </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Diethyl ether</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td> 309966-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NaCl</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S7653-5KG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NaOH solid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221465-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> NH4OH sol. 28%-30%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221228-1L-A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Acetic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>320099-500ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>221759-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Ammonium Molybdate tetrahydrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A7302-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sulfuric Acid 95%-98%</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>320501-1L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Silver Nitrate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>209139-25G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium sulfate anhydrous</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>238597-500G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Nuclease P-I from penicillium citrinum</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N8630-1VL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphodiesterase II type I-sa </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P9041-10UN</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E114-25MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphatase alkaline type VII-t from*bov</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P6774-1KU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Phosphodiesterase I type VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P3134-100MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Deoxyribonuclease II type IV from*porcin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D4138-20KU</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Trizma(r) base, biotechnology performanc ce</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T6066-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> EDTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E1644-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Succinic acid bioxtra</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S3674-250G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Calcium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C5670-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Formic acid, 98 %</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>06440-100ML</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>UFC500324</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 8-Bromo-2'-deoxyguanosine</td>
 <td>Berry &amp; Associates</td>
 <td>PR3290-1 g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 8-Bromo-2'-deoxyadenosine</td>
 <td>Berry &amp; Associates</td>
 <td>PR3300-1 g</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium iodide</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383112-100G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Sodium hydrogen carbonate</td>
 <td>Carlo Erba</td>
 <td>478536-500 g </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)</td>
 <td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td>
 <td>CILNLM-3899-CA-0.1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY</td>
 <td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc</td>
 <td>CILNLM-3895-0.1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Nitrous oxide (N2O) </td>
 <td>Air Liquide </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Deoxyribonucleic acid from calf thymus</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>D4522-5MG</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60Co-Gammacell</td>
 <td>AECL- Canada </td>
 <td>220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immersion well reaction medium pressure 125 watts </td>
 <td>Photochemical reactors ltd</td>
 <td>Model 3010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Evaporating flask 250 ml</td>
 <td>Heidolph</td>
 <td>P/N NS 29/32 514-72000-00</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luna 5 &mu;m C18(2) 100 &Aring;, LC Column 250 x 4.6 mm </td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>00A-4252-E0 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 &mu;m</td>
 <td>Grace</td>
 <td>88081</td>
 <td>Semipreparative</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SecurityGuard Kit</td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>KJ0-4282</td>
 <td>Analytical holder kit and accessories</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Holder for 10.0 mm ID cartridges</td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>AJ0-7220</td>
 <td>Semipreparative holder </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10.0 mm ID cartridges </td>
 <td>Phenomenex</td>
 <td>AJ0-7221 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High-performance liquid chromatography (HPLC) </td>
 <td>Agilent</td>
 <td>1100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LC/MS/MS </td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>4000QTRAP System</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tandem mass ESI spectrometer </td>
 <td>(Bruker Daltonics) </td>
 <td>Esquire 3000 plus </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vial 2-4 ml </td>
 <td>SUPELCO </td>
 <td>Cod 27516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vial 4 ml </td>
 <td>SUPELCO </td>
 <td>Cod 27517</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
</table>

free radicals in chemical biology: from chemical behavior to biomarker development

O envolvimento dos radicais livres em ciências da vida tem aumentado constantemente ao longo do tempo e tem sido ligado a vários processos fisiológicos e patológicos. Este assunto abrange diversas áreas científicas, abrangendo desde a química, física, biológica e bioorganic para a biologia e medicina, com aplicações para a melhoria da qualidade de vida, saúde e envelhecimento. Competências multidisciplinares são necessários para a investigação completa das várias facetas do processo radicais no ambiente biológico e químico conhecimento desempenha um papel crucial em revelar processos básicos e mecanismos. Nós desenvolvemos uma abordagem de biologia química capaz de se conectar a reatividade química de radicais livres com processos biológicos, fornecendo informações sobre as rotas mecanísticas e produtos. O núcleo da presente abordagem é a concepção de modelos biomiméticos para estudar o comportamento de biomoléculas (lípidos, ácidos nucleicos e proteínas) em sistemas aquosos, obtendo insights da reacção das vias, bem como ums construção de bibliotecas moleculares dos produtos livres de reação radical. Neste contexto, pode ser utilizada com sucesso para a descoberta de biomarcadores e exemplos são fornecidos com duas classes de compostos: mono-trans isómeros de ésteres de colesterol, que são sintetizados e utilizados como referência para a detecção em plasma humano, e de purinas 5 &#39;,8-ciclo-2 &#39;-desoxiribonucleósidos, preparados e utilizados como referência no protocolo para a detecção de lesões em amostras de DNA, depois de radiações ionizantes ou obtidos a partir de diferentes condições de saúde.

O processo de isomerização foi descrito em particular para os ésteres de colesterilo que proporcionem as mono-isómeros trans de ácidos linoleico e araquidónico, mostrados na Figura 1, tal como os primeiros produtos deste ataque, que podem ocorrer em condições de stress de radicais livres no meio biológico. 5 Na Figura 3, o mecanismo de química envolvida na ligação a isomerização cis-trans dupla é mostrado. A fonte radical é indicado de forma genérica para pagar S centradas radicais. Nos protocolos descritos a fonte de radical é a luz UV, que é capaz de quebrar a ligação presente homolitically SH na molécula de tiol RSH. A Figura 4 resume os três passos de protocolo para a síntese da classe de lípidos modificados e sua detecção no plasma humano: a síntese representa um processo livre biomimética radical e também fornece uma entrada de uma panela conveniente para o Geometisómeros rical, sem qualquer contaminação por isómeros posicionais seguido de protocolos de purificação e isolamento. Várias metodologias de análise pode ser aplicado para uma detecção de alta sensibilidade do teor de isómero trans e caracterização da biblioteca de éster mono-trans colesterilo. Em particular, a espectroscopia de Raman pode ser realizada directamente sobre a fracção de éster de colesterol sem derivação (ver Figura 2 e Figura 9). O segundo exemplo refere-purina 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-desoxiribonucleósidos, que são lesões do ADN criadas pelo ataque de radicais livres na posição C5 &#39;da porção açúcar e subsequente formação de uma ligação covalente entre o açúcar e a base porções. Quatro estruturas podem ser produzidas, ou seja, 5 &#39;, 8-ciclo-2&#39;-desoxiadenosina e 5 &#39;, 8-ciclo-2&#39;-desoxiguanosina, ambos existentes nos 5&#39;R e 5&#39;S formas diastereoméricas (Figura 5). Na Figura 6 tele mecanismo de reacção é mostrado, que envolve a fotólise de 8-bromopurina derivados 5 para dar os correspondentes radical C8 6, que abstrai intramolecularmente um átomo de hidrogénio a partir da posição C5 &#39;selectivamente para se obter o 7-2&#39;-5&#39;-deoxyadenosin ilo. 7 radical sofre ciclização com uma velocidade constante no intervalo de 10 5 -10 6 s-1, 2, seguido de oxidação do radical heteroaromático de 8 para dar os produtos finais 9. A reacção dos radicais hidroxilo, gerado por radiólise da água, com 2&#39;-desoxiadenosina 2&#39;-desoxiguanosina e (10) foi encontrada para ocorrer ca. 10% por abstração de hidrogênio a partir da posição C5 &quot;. 7 A nossa abordagem biologia química para as bibliotecas de purina 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-desoxiribonucleósidos (incluindo compostos marcados) é ilustrada na Figura 7, com a identificação dessas lesões nos oligonucleótidos, bem como em amostras de DNA obtidas a partir de various fontes, tais como, por exemplo, tratada sob condições de radiação ionizante, como mímica das condições de stress radicais. Na figura 8 um equipamento fotorreator típico é mostrado. O dispositivo permite a irradiação de compostos dissolvidos no solvente apropriado. É constituída por: i) a câmara de reacção equipado com a entrada para o gás inerte (na parte inferior) e duas entradas para a saída do gás e para a adição de reagentes, ii) uma câmara interna que contém a lâmpada de mercúrio ligado a um adequado sistema de refrigeração e de energia eléctrica, que é inserido para dentro da câmara de reacção através de uma junta de vidro. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig1.jpg" /> Figura 1. Mono-trans de colesterilo e linoleato de araquidonato. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig2.jpg" /> Figura 2. Ésteres de colesterol na análise de soro e humana direta para mono-trans por espectroscopia Raman. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig3.jpg" /> Figura 3. O processo de adição-eliminação, que leva à isomerização cis-trans de ligações duplas por radicais thiyl. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Três passos para o desenvolvimento do protocolo de ésteres mono-trans colesterol como biomarcador de estresse dos radicais livres. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6.5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50379/50379fig5highres.jpg&quot; src = &quot;files/ftp_upload/50379/50379fig5.jpg /&quot; /&gt; Figura 5. A purina quatro 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-desoxiribonucleósidos diastereoisómeros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig6.jpg" /> Figura 6. Geração de C5 &#39;radicais, ou por fotólise de 5 ou de 10 por reacção com os radicais HO •, e o mecanismo de purina 5&#39; ,8-ciclo-2 &#39;formação desoxinbonucleosido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig6large.jpg" target="_blank">para ver figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Protocolo fou a identificação de algumas lesões radical à base de ADN; mtDNA: DNA mitocondrial, nDNA: DNA nuclear. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig8.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Reator fotoquímico. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig9.jpg" alt="Figura 9" /> Figura 9. Espectro de Raman representativo de plasma de ésteres de colesterilo. Na comparação da inserção de uma região específica de colesteril com o linoleato de colesterilo e mono-trans de ácido linoleico. <img src="/files/ftp_upload/50379/50379fig10.jpg" alt="Figura 10" /> Figura 10. Representante análise GC de FAME obtida a partir de ésteres de colesterilo no plasma. <img alt="Figura 11" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50379/50379fig11.jpg" /> &lt;strong&gt; Figura 11. Representante HPLC executar contendo 2&#39;-desoxiadenosina e 2&#39;desoxiguanosina juntamente com a sua oxidativo e purina 5 &#39;,8-ciclo-2&#39;-Deoxyribo nucleosídeos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50379/50379fig11large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Radical baseado em química biomimética tem sido aplicado para a construção de bibliotecas, necessários para o desenvolvimento de biomarcadores.

Radicais Livres em Biologia Química: de comportamento químico para o Desenvolvimento de biomarcadores

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

free-radicals-chemical-biology-from-chemical-behavior-to-biomarker

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Chemistry

Organic Chemistry

Unit 1

Radical Chemistry

Alkene Structure and Reactivity

SCIENTISTS IN ACTION

20.1K visualizações.  Consiglio Nazionale delle Ricerche. Radical baseado em química biomimética tem sido aplicado para a construção de bibliotecas, necessários para o desenvolvimento de biomarcadores.

Vídeo: Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

Isolamento e Caracterização química do lípido A de bactérias Gram-negativas

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Química

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high surface area microporous materials, such as metal-organic frameworks (MOFs), unique challenges present themselves for PECVD treatments. Herein the protocol for development of a MOF that was previously unstable to humid conditions is presented. The protocol describes the synthesis of Cu-BTC (also known as HKUST-1), the treatment of Cu-BTC with PECVD of perfluoroalkanes, the aging of materials under humid conditions, and the subsequent ammonia microbreakthrough experiments on milligram quantities of microporous materials. Cu-BTC has an extremely high surface area (~1,800 m2/g) when compared to most materials or surfaces that have been previously treated by PECVD methods. Parameters such as chamber pressure and treatment time are extremely important to ensure the perfluoroalkane plasma penetrates to and reacts with the inner MOF surfaces. Furthermore, the protocol for ammonia microbreakthrough experiments set forth here can be utilized for a variety of test gases and microporous materials.

Herein the procedures for plasma enhanced chemical vapor deposition of perfluoroalkanes on microporous materials such as metal-organic frameworks to enhance their stability and hydrophobicity are described. Furthermore, breakthrough testing of milligram quantities of samples is described in detail.

Preparação de hidrofóbicos Metal-Organic Frameworks via Plasma aprimorado Chemical Vapor Deposition de perfluoroalcanos para a remoção de amônia

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

Uma abordagem de análise inversa à caracterização dos Transportes Química em Tintas

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is a major effort to target PPIs in basic research and in the pharmaceutical industry. Protein-protein interfaces are usually large, flat, and often lack pockets, complicating the discovery of small molecules that target such sites. Alternative targeting approaches using antibodies have limitations due to poor oral bioavailability, low cell-permeability, and production inefficiency.
Using peptides to target PPI interfaces has several advantages. Peptides have higher conformational flexibility, increased selectivity, and are generally inexpensive. However, peptides have their own limitations including poor stability and inefficiency crossing cell membranes. To overcome such limitations, peptide cyclization can be performed. Cyclization has been demonstrated to improve peptide selectivity, metabolic stability, and bioavailability. However, predicting the bioactive conformation of a cyclic peptide is not trivial. To overcome this challenge, one attractive approach it to screen a focused library to screen in which all backbone cyclic peptides have the same primary sequence, but differ in parameters that influence their conformation, such as ring size and position.
We describe a detailed protocol for synthesizing a library of backbone cyclic peptides targeting specific parasite PPIs. Using a rational design approach, we developed peptides derived from the scaffold protein Leishmania receptor for activated C-kinase (LACK). We hypothesized that sequences in LACK that are conserved in parasites, but not in the mammalian host homolog, may represent interaction sites for proteins that are critical for the parasites&#39; viability. The cyclic peptides were synthesized using microwave irradiation to reduce reaction times and increase efficiency. Developing a library of backbone cyclic peptides with different ring sizes facilitates a systematic screen for the most biological active conformation. This method provides a general, fast, and facile way to synthesize cyclic peptides.

A simple and general method for the synthesis of cyclic peptides using microwave irradiation is outlined. This procedure enables the synthesis of backbone cyclic peptides with a collection of different conformations while retaining the side chains and the pharmacophoric moieties., and therefore, allows to screen for the bioactive conformation.

Desenvolvimento de um Backbone cíclica Biblioteca de Peptídeos como potencial antiparasitário Therapeutics Usando Microondas Irradiação

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Sequenciamento de parede planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilação) e físico (espectrometria de massa, ressonância magnética nuclear) Técnicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

From Molecules to Materials: Engineering New Ionic Liquid Crystals Through Halogen Bonding

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid crystals (ILCs). Taking advantages of the high specificity of XB for haloperfluorocarbons and the ability of anions to act as XB-acceptors, we obtained supramolecular complexes based on 1-alkyl-3-methylimidazolium iodides and iodoperfluorocarbons, overcoming the well-known immiscibility between hydrocarbons (HCs) and perfluorocarbons (PFCs). The high directionality of the XB combined with the fluorophobic effect, allowed us to obtain enantiotropic liquid crystals where a rigid, non-aromatic, XB supramolecular anion acts as mesogenic core.
X-ray structure analysis of the complex between 1-ethyl-3-methylimidazolium iodide and iodoperfluorooctane showed the presence of a layered structure, which is a manifestation of the well-known tendency to segregation of perfluoroalkyl chains. This is consistent with the observation of smectic mesophases. Moreover, all the reported complexes melt below 100 &#176;C, and most are mesomorphic even at room temperature, despite that the starting materials were non-mesomorphic in nature.
The supramolecular strategy reported here provides new design principles for mesogen design allowing a totally new class of functional materials.

A protocol for the synthesis of a new type of mesogens, based on the halogen-bonded supramolecular anion [CnF2n+1-I&#183;&#183;&#183;I&#183;&#183;&#183;I-CnF2n+1]&#8722;, is reported.

De moléculas a materiais: engenharia de novos cristais líquidos iônicos por meio de ligações de halogênio

Herein, we demonstrate that a bottom-up approach, based on halogen bonding (XB), can be successfully applied for the design of a new type of ionic liquid ...

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is prepared by mixing solutions of glycol chitosan with a synthesized benzaldehyde terminated polymer gelator, and hydrogels are efficiently obtained in several minutes at room temperature. By varying ratios between glycol chitosan, polymer gelator, and water contents, versatile hydrogels with different gelation times and stiffness are obtained. When damaged, the hydrogel can recover its appearances and modulus, due to the reversibility of the dynamic imine bonds as crosslinkages. This self-healable property enables the hydrogel to be injectable since it can be self-healed from squeezed pieces to an integral bulk hydrogel after the injection process. The hydrogel is also multi-responsive to many bio-active stimuli due to different equilibration statuses of the dynamic imine bonds. This hydrogel was confirmed as bio-compatible, and L929 mouse fibroblast cells were embedded following standard procedures and the cell proliferation was easily assessed by a 3D cell cultivation process. The hydrogel can offer an adjustable platform for different research where a physiological mimic of a 3D environment for cells is profited. Along with its multi-responsive, self-healable, and injectable properties, the hydrogels can potentially be applied as multiple carriers for drugs and cells in future bio-medical applications.

Here we describe a facile preparation of chitosan-based injectable hydrogels using dynamic imine chemistry. Methods to adjust the hydrogel&#8217;s mechanical strength and its application in 3D cell culture are presented.

Preparação do hidrogel injetável à base de quitosana e sua aplicação em cultura de células 3D

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

One-pot Microwave-assisted Conversion of Anomeric Nitrate-esters to Trichloroacetimidates

The goal of the following procedure is to provide a demonstration of the one-pot conversion of a 2-azido-1-nitrate-ester to a trichloroacetimidate glycosyl donor. Following azido-nitration of a glycal, the product 2-azido-1-nitrate ester can be hydrolyzed under microwave-assisted irradiation. This transformation is usually achieved using strongly nucleophilic reagents and extended reaction times. Microwave irradiation induces hydrolysis, in the absence of reagents, with short reaction times. Following denitration, the intermediate anomeric alcohol is converted, in the same pot, to the corresponding 2-azido-1-trichloroacetimidate.

A 2-azido-1-nitrate-ester can be converted to the corresponding 2-azido-1-trichloroacetimidate in a one-pot procedure. The goal of the manuscript is to demonstrate utility of the microwave reactor in carbohydrate synthesis.

Um pot-assistida por microondas conversão de nitrato anomérico-ésteres de Trichloroacetimidates

The goal of the following procedure is to provide a demonstration of the one-pot conversion of a 2-azido-1-nitrate-ester to a trichloroacetimidate ...

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Construindo Tioéter/sulfeto de vinil-amarrados induzida por peptídeos helicoidais Via foto Thiol-ene/ino Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-baseado sem célula de síntese de proteínas: protocolos para uma tecnologia de plataforma robusta, flexível e acessível

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...