A pesquisa aqui relatada foi apoiada em parte pelo Instituto Nacional de Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio nº. R33 CA217702 e o programa Iniciativa de Maximização do Desenvolvimento Estudantil (IMSD). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a visão oficial dos Institutos Nacionais de Saúde.

Os espécimes de soro humano foram obtidos de voluntários consentidos sob aprovação do IRB e de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinque. Os espécimes foram codificados e desidentifilados antes da transferência para o laboratório analítico.
1. Preparação da amostra
<ol><li>Lises celulares HepG2
	<ol>
<li>Semente cerca de 10 x 106 células HepG2 por frasco em 16 frascos T75 com 14 mL de mídia EMEM complementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) e células de cultivo por 2 dias.</li>
		<li>Prepare o buffer RIPA: em um tubo de 50 mL, adicione 1,5 mL de 5 M NaCl, 2,5 mL de 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL de reagente NP-40 e, em seguida, leve o volume final para 50 mL com água DI.</li>
		<li>Prepare o tampão de lise: alíquota de 20 mL de tampão RIPA em um tubo de 50 mL e adicione 200 μL de uma solução inibidora de protease de 100x para inibir a degradação da proteína e lipídica. Armazenar a 4 °C. NOTA: O tampão de lise é compatível com reagentes TBARS e não interfere com a absorvência a 532 nm. Se o planejamento de usar um tampão de lise diferente ou adicionar ingredientes adicionais ao tampão de lise, estudos preliminares de validação precisam ser feitos para verificar se os componentes do buffer de lise são compatíveis com o ensaio TBARS.</li>
		<li>Remova a mídia contendo 10% de FBS e lave as células 2x com 5 mL de PBS frio e estéril.</li>
		<li>Adicione 1 mL de tampão de lise aos frascos T75 contendo as células e incuba-as por 10 minutos à temperatura ambiente (RT) com redemoinho constante para garantir que o buffer esteja bem distribuído.</li>
		<li>Colete lysates em tubos de polipropileno de 2 mL e incubar no gelo por 10 minutos.</li>
		<li>Gire os lises a 5.000 x g por 10 min no RT para coletar detritos celulares e aspire supernantes em um único tubo de 15 mL.</li>
		<li>Concentre-se em células supernasas de células 4 vezes usando um Vac de velocidade a 50 °C e 3 mbar e faça alíquotas de 94 μL cada em tubos de polipropileno de 2 mL. Armazene amostras a -80 °C até que sejam usadas para oxidação in vitro e/ou ensaio TBARS. NOTA: Para evitar concentrar o supernanato celular, as células também podem ser destacadas usando 3 mL de trippsina 1x, neutralizadas com 6 mL de mídia, e lavadas 2x com 5 mL de PBS frio. As pelotas celulares podem então ser reconstituídas em 250 μL de tampão de lise, e as etapas 1.1.6 e 1.1.7 podem então ser realizadas.</li>
		<li>Prepare uma solução de estoque cucl2 de 35 mM em ácido acético (pH = 4).<ol>
<li>Preparar solução de ácido acético (pH = 4): Diluir 1 μL de ácido acético glacial em 100 mL de água DI (pH deve ser aproximadamente 4, mas confirme isso com um medidor de pH). Adicione mais água ou ácido acético para ajustar o pH a 4.</li>
			<li>Peso cerca de 0,1936 g de cloreto de cobre II e dissolver-se em 10 mL da solução de ácido acético (pH = 4) para fazer um estoque de CuCl2 de 144 mM. Aliquot 490 μL desta solução e adicionar a 1.510 μL de ácido acético (pH = 4) para fazer uma solução cucl2 de 35 mM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquot 6 μL da solução de estoque CuCl2 de 35 mM e adicioná-lo a seis amostras contendo 94 μL de lisato celular para fazer uma concentração final de CuCl2 de cerca de 2 mM. Adicione 6 μL de uma solução de ácido acético (pH = 4) que não tenha CuCl2 a seis amostras contendo 94 μL de lisatos celulares para usar como controles. O volume final de lise celular deve ser de 100 μL, que é o que será usado para o ensaio TBARS. NOTA: Fazer a solução de estoque cucl2 de 35 mM em ácido acético (pH = 4) é necessário para evitar a precipitação de hidróxido de cobre.</li>
		<li>Incubar amostras em um forno a 37 °C por 24 h e realizar um ensaio TBARS em cada amostra contendo um volume final de 100 μL.</li>
		<li>Repita as etapas 1.1.9 e 1.1.11 2x em dias separados para verificar a reprodutibilidade do ensaio TBARS para as células HepG2.</li>
	</ol></li>
	<li>Lipoproteínas de baixa densidade NOTA: Normalmente, a lipoproteína de baixa densidade pré-purificada (LDL) contém alguma quantidade de EDTA. As amostras de LDL aqui utilizadas contêm 0,01% de EDTA. EDTA pode inibir a oxidação in vitro cu(II) mediada de LDL. Portanto, pode ser necessário remover EDTA de amostras de LDL antes de experimentos ou análises. As etapas 1.2.1-1.2.5 descrevem esse processo. ATENÇÃO: Hidróxido de sódio é corrosivo e causa irritação na pele e nos olhos. Use equipamentos de proteção individual adequados.<ol>
<li>Aliquot 24 μL de um estoque LDL de 5,51 mg/mL (concentração de proteína determinada pelo método Lowry modificado usando BSA como padrão) em tubos de polipropileno de 1 mL apropriadamente rotulados. Faça quantas alíquotas forem necessárias e armazene a 4 °C até usar em ensaio de oxidação e/ou TBARS.</li>
		<li>Prepare um buffer HEPES de 10 mM em 0,15 M NaCl ajustado ao pH = 7 com contas NaOH: dissolva 4,39 g de NaCl em 0,49 L de água e adicione 1,19 g de HEPES. Dissolva bem com uma barra de mexida. Adicione contas de hidróxido de sódio até que o pH seja 7. Diluir para 0,5 L com água. Armazene o buffer a 4 °C e use dentro de 3 meses.</li>
		<li>Adicione 476 μL do buffer HEPES de 10 mM em 0,15 M NaCl (pH = 7) às amostras de LDL aliquoted para trazer volume final para 500 μL. Adicione a amostra diluída de LDL a um dispositivo de filtro de giro centrífugo de 0,5 mL com um corte de peso molecular de 100K.</li>
		<li>Gire amostras a 14.000 x g por 10 min na RT, deixando um volume final de retentato de cerca de 30 μL. Reconstituir amostras em 480 μL do buffer HEPES de 10 mM em 0,15 M NaCl (pH = 7) e girar novamente a 14.000 x g por 10 min na RT. Execute esta etapa 2x para um total de quatro spin-throughs.</li>
		<li>Coloque o dispositivo do filtro de cabeça para baixo em um novo tubo de polipropileno de 2 mL e centrífugas a 1000 x g por 2 minutos para coletar amostra de LDL (volume final = cerca de 30 μL).</li>
		<li>Amostra de alíquota em tubo de 1 mL devidamente rotulado e adicionar 20 μL de água a cada amostra para alcançar um volume final de 50 μL.</li>
		<li>Preparação de 200 μM CuCl2 solução de estoque em ácido acético (pH = 4)<ol>
<li>Prepare a solução de ácido acético (pH = 4): veja o passo 1.1.9.1.</li>
			<li>Prepare uma solução de estoque CuCl2 de 144 mM (ver passo 1.1.9.2), depois aliquot 5,5 μL do estoque cucl2 de 144 mM e dissolva em um volume final de 4 mL de ácido acético (pH = 4) para fazer a solução de 200 μM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aliquot 2,7 μL da solução de estoque CuCl2 de 200 μM e adicioná-la a seis amostras contendo 50 μL de LDL para obter uma concentração final de CuCl2 de ~10 μM. Adicione 2,7 μL de uma solução de ácido acético (pH = 4) que não contenha CuCl2 a seis amostras contendo 50 μL de LDL a serem utilizadas para os controles.</li>
		<li>Incubar amostras de LDL por 2 h em forno a 37 °C. Após 2h, leve o volume final para 100 μL para cada amostra com 10 mM de tampão HEPES em 0,15 M NaCl (pH = 7). Realize imediatamente um ensaio TBARS.</li>
		<li>Repetir as etapas 1.2.3-1.2.9 2x em dois dias diferentes para testar a reprodutividade do ensaio TBARS.</li>
	</ol></li>
	<li>Soro humano
	<ol>
<li>A partir de uma amostra de soro humano, faça alíquotas de 94 μL cada em tubos de polipropileno de 2 mL e armazene amostras a -80 °C.</li>
		<li>Prepare uma solução de estoque cucl2 de 35 mM em ácido acético (pH = 4): veja o passo 1.1.9.</li>
		<li>Aliquot 6 μL da solução de estoque CuCl2 e adicioná-lo a seis amostras contendo 94 μL de soro humano para fazer uma concentração final de CuCl2 de cerca de 2 mM. Adicione 6 μL de uma solução de ácido acético (pH = 4) que não tenha CuCl2 a seis amostras contendo 94 μL de soro humano para usar como controles.</li>
		<li>Incubar amostras de soro humano por 24 h em forno a 37 °C e determinar níveis de oxidação com ensaio TBARS (seção 4).</li>
		<li>Repetir as etapas 1.3.2-1.3.4 2x em dois dias separados para determinar a reprodutibilidade do ensaio TBARS.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação do reagente
ATENÇÃO: O ácido thiobarbitúrico causa irritação na pele e nos olhos e talvez prejudicial por inalação ou absorção da pele. O ácido acético pode danificar órgãos internos se inalado. Prepare todas as soluções ácidas em um capô de fumaça.
<ol><li>Preparação de solução de 8,1% (c/v) dodecylsulfate de sódio (SDS)<ol>
<li>Peso 32,4 g de SDS e dissolva em 350 mL de água DI em um béquer. Use uma barra de agitação magnética para dissolver suavemente os SDS e evitar fazer bolhas. Leve o volume final para 400 mL com água DI e armazene a solução SDS na RT. NOTA: Aqui, o excesso de 8,1% de solução SDS é preparado; no entanto, para 96 amostras, são necessários apenas cerca de 20 mL da solução SDS de 8,1%. Prepare esta solução de acordo com o número de amostras que estão sendo analisadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de tampão de acetato de sódio de 3,5 M (pH = 4)<ol>
<li>Diluir 100 mL de ácido acético glacial em 350 mL de água DI em um béquer. Use uma barra de agitação magnética para dissolvê-la suavemente.</li>
		<li>Prepare uma solução NaOH de 6,5 M usando contas de hidróxido de sódio na água. Dissolva 13 g de contas NaOH em 40 mL de água DI e leve a um volume final de 50 mL com água DI.</li>
		<li>Adicione lentamente cerca de 46 mL da solução NaOH de 6,5 M à solução de ácido acético enquanto se mistura com a barra de agitação (isso deve elevar o pH para 4, mas confirmar adicionando lentamente a solução NaOH enquanto mede usando um medidor de pH).</li>
		<li>Leve o volume final para 500 mL com água DI e armazene o tampão de acetato de sódio na RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de solução aquosa de 0,8% de ácido tiobarbitúrico (ajustado ao pH = 4) NOTA: Nesta etapa, a preparação do ácido tiobarbitúrico é otimizada para grandes volumes, uma vez que um grande número de amostras será analisada (108 amostras, sem incluir as normas). Prepare esta solução dependendo do número de amostras planejadas para análise.<ol>
<li>Prepare uma solução de hidróxido de sódio de 5 M usando contas de hidróxido de sódio e água: dissolva 4 g de contas de hidróxido de sódio em um volume final de 20 mL de água. Guarde em um recipiente de plástico. Esta solução deve ser preparada recentemente para cada lote.</li>
		<li>Peso 4 g de ácido tiobarbitúrico e adicione 450 mL de água DI. Use uma barra de agitação magnética para dissolvê-la suavemente. NOTA: Esta solução será eventualmente levada a um volume total de 500 mL.</li>
		<li>Ao dissolver o ácido tiobarbitúrico com uma barra de mexida, adicione (lentamente e de forma dropwise) cerca de 3 mL da solução 5 M NaOH em incrementos de 100 μL. Depois de adicionar a solução NaOH, as partículas de ácido thibarbitúrico começarão a se dissolver.</li>
		<li>Se as partículas de ácido thibarbitúrico ainda não tiverem totalmente dissolvido, adicione mais da solução 5 M NaOH em incrementos de 100 μL até que todas as partículas de ácido thiobarbitúrico sejam totalmente dissolvidas. Para este volume específico de solução, um total de 4 mL da solução 5 M NaOH é adicionado para dissolver totalmente as partículas de ácido thiobarbitúrico. NOTA: Nesta concentração, o ácido tiobarbitúrico não se dissolverá totalmente a menos que o pH seja de quase 4.</li>
		<li>Pare de adicionar NaOH depois de tudo o ácido tiobarbitúrico ter se dissolvido completamente. Evite exceder um pH de 4. O pH final pode ser verificado tomando 1 μL da solução de ácido thiobarbitúrico de mistura e colocando-o em papel pH.</li>
		<li>Leve o volume final para 500 mL com água DI e armazene solução aquosa de ácido thiobarbitúrico de 0,8% na RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparação padrão da amostra padrão malondialdeído bis (dimethyl acetal)
NOTA: O malondialdeído (MDA) é instável e não está disponível comercialmente. No entanto, existem diferentes formas químicas de MDA que estão disponíveis comercialmente, como o sal de tetrabutylammonium MDA, MDA bis (acetal de dimetila) e MDA bis (acetal de dietilo). Dessas três formas químicas, o MDA bis (acetal de dimetila) é usado aqui, pois a maioria dos estudos usa esse mesmo padrão21,22. Se optar por usar as outras duas formas químicas de MDA, deve ser realizada validação prévia de sua adequação.
<ol><li>Prepare uma solução de estoque de 550 μM MDA bis (dimethyl acetal) diluindo 92 μL de mda bis puro (acetal de dimetila) em 1 L de água DI. Use uma barra de mexiça magnética para misturar bem a solução por 10 minutos. Armazene a solução a 4 °C e use dentro de 1 mês.</li>
	<li>Prepare um bi de 200 μM MDA bis (acetal de dimetila) diluindo 726 μL do estoque de 550 μM MDA bis (acetal de dimetila) em 1274 μL de água DI. Esta solução de 200 μM MDA bis (acetal de dimetila) deve ser preparada fresca toda vez que um ensaio TBARS é realizado.</li>
	<li>Preparação padrão da curva: pegue oito tubos de polipropileno de tampa de snap-cap de 2 mL e rotule-os com letras A através de H. Adicione MDA bis (acetal de dimetila) do estoque de 200 μM e diluir na água conforme descrito na Tabela 1.</li>
	<li>Pegue oito tubos de vidro (13 mm x 100 mm) e rotule-os A-H, em seguida, adicione 100 μL de padrão aos tubos correspondentes. Execute seis réplicas para o padrão em branco (amostra A) para calcular os limites de detecção do ensaio TBARS. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui por não mais do que 1 h.</li>
</ol>4. Ensaio TBARS
NOTA: Uma vez iniciado o ensaio TBARS, ele deve ser terminado sem parar.
<ol><li>Pegue o máximo de tubos de vidro necessários para que o número de amostras seja analisado e rotule-os com os nomes das amostras. Em seguida, adicione 100 μL de cada amostra preparada (conforme descrito acima) a cada tubo de vidro.</li>
	<li>Adicione 200 μL de 8,1% SDS a cada amostra e padrões e gire suavemente o tubo de vidro em um movimento circular para misturar a amostra.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL do tampão de acetato de sódio de 3,5 M (pH = 4) a cada amostra e padrão.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL da solução aquosa de ácido thiobarbitúrico de 0,8% (pH = 4) a cada amostra e padrão.</li>
	<li>Leve o volume final para 4 mL para cada amostra e padrão adicionando 700 μL de água DI.</li>
	<li>Tampa firmemente cada tubo de vidro e incuba em um bloco de aquecimento definido a 95 °C por 1 h. Cubra os tubos de vidro com papel alumínio para evitar a condensação nos topos dos tubos.</li>
	<li>Remova os tubos de vidro do bloco de aquecimento e incubar no gelo por 30 minutos.</li>
	<li>Centrifugar amostras e padrões a 1500 x g por 10 min a 4 °C. Após a centrifugação, mantenha os tubos de vidro contendo as amostras e padrões na RT. NOTA: Manter as amostras no gelo ou a 4 °C fará com que toda a amostra ou padrão precipitar.</li>
	<li>Imediatamente após a centrifugação, aliquot 150 μL de supernante de cada tubo e coloque em um poço separado de uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Remova todas as bolhas de cada poço usando uma ponta de pipeta. NOTA: A presença de bolhas produzirá leituras de absorção inconsistentes, levando a uma alta imprecisão do ensaio.</li>
	<li>Leia absorventes a 532 nm. Subtraia a leitura média de absorvência das amostras em branco de todas as outras leituras de absorvência.</li>
	<li>Crie uma curva padrão plotando as leituras de absorvância subtraídas em branco a 532 nm vs. a concentração conhecida de cada padrão. Encaixe os pontos de dados usando regressão linear. Calcular concentrações amostrais desconhecidas usando a equação da linha de regressão linear obtida da curva padrão.</li>
</ol>

<ol>
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W., Hessler, J. R., Chisolm, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+density+lipoprotein+cytotoxicity+induced+by+free+radical+peroxidation+of+lipid.">Low density lipoprotein cytotoxicity induced by free radical peroxidation of lipid.</a> Journal of Lipid Research. 24 (8), 1070-1076 (1983).</li><li>Guzm&#225;n-Chozas, M., Vicario-Romero, I. 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New Evidence for a Multistep Mechanism.</a> Inorganic Chemistry. 36 (18), 4115-4120 (1997).</li><li>Jeffs, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delta-S-Cys-Albumin:+A+Lab+Test+that+Quantifies+Cumulative+Exposure+of+Archived+Human+Blood+Plasma+and+Serum+Samples+to+Thawed+Conditions.">Delta-S-Cys-Albumin: A Lab Test that Quantifies Cumulative Exposure of Archived Human Blood Plasma and Serum Samples to Thawed Conditions.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 18 (10), 2121-2137 (2019).</li><li>Yagi, K., Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Assay+for+the+Level+of+Total+Lipid+Peroxides+in+Serum+or+Plasma.">Simple Assay for the Level of Total Lipid Peroxides in Serum or Plasma.</a> Free Radical and Antioxidant Protocols. Methods in Molecular Biology. , 101-106 (1998).</li><li>Bernheim, F., Bernheim, M. L. C., Wilbur, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+between+thiobarbituric+acid+and+the+oxidation+products+of+certain+lipides.">The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides.</a> Journal of Biological Chemistry. 174 (1), 257-264 (1948).</li><li>Wilbur, K. M., Bernheim, F., Shapiro, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thiobarbituric+acid+reagent+as+a+test+for+the+oxidation+of+unsaturated+fatty+acids+by+various+agents.">The thiobarbituric acid reagent as a test for the oxidation of unsaturated fatty acids by various agents.</a> Archives of Biochemistry. 24 (2), 305-313 (1949).</li><li>Kwon, T. W., Watts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+malonaldehyde+by+ultraviolet+spectrophotometry.">Determination of malonaldehyde by ultraviolet spectrophotometry.</a> Journal of Food Science. 28 (6), 627-630 (1963).</li><li>Esterbauer, H., Schaur, F. J., Zollner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biochemistry+of+4-hydroxynonenal,+malonaldehyde+and+related+aldehydes.">Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 11 (1), 81-128 (1991).</li><li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease.">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clinical Chemistry. 52 (4), 601-623 (2006).</li><li>Jentzsch, A. M., Bachmann, H., F&#252;rst, P., Biesalski, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+analysis+of+malondialdehyde+in+human+body+fluids.">Improved analysis of malondialdehyde in human body fluids.</a> Free Radical Biology and Medicine. 20 (2), 251-256 (1996).</li><li>Jo, C., Ahn, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorometric+Analysis+of+2-Thiobarbituric+Acid+Reactive+Substances+in+Turkey.">Fluorometric Analysis of 2-Thiobarbituric Acid Reactive Substances in Turkey.</a> Poultry Science. 77 (3), 475-480 (1998).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development,+validation+and+biomedical+applications+of+stable-isotope+dilution+GC-MS+and+GC-MS/MS+techniques+for+circulating+malondialdehyde+(MDA)+after+pentafluorobenzyl+bromide+derivatization:+MDA+as+a+biomarker+of+oxidative+stress+and+its+relation+to+15(S)-8-iso-prostaglandin+F2&#945;+and+nitric+oxide+(NO).">Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2&#945; and nitric oxide (NO).</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1019, 95-111 (2016).</li><li>Barden, A. E., Mas, E., Croft, K. D., Phillips, M., Mori, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+artifactual+elevation+of+lipid+peroxidation+products+(F+2-isoprostanes)+in+plasma+during+collection+and+storage.">Minimizing artifactual elevation of lipid peroxidation products (F 2-isoprostanes) in plasma during collection and storage.</a> Analytical Biochemistry. 449 (1), 129-131 (2014).</li><li>Jeffs, J. W., Ferdosi, S., Yassine, H. N., Borges, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+instability+of+glycated+albumin:+A+role+for+autoxidative+glycation.">Ex vivo instability of glycated albumin: A role for autoxidative glycation.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 629, 36-42 (2017).</li><li>Lee, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malondialdehyde+in+Stored+Plasma.">Malondialdehyde in Stored Plasma.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 95 (4), 1663-1672 (1980).</li><li>Tsikas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+GC-MS/MS+measurement+of+malondialdehyde+and+4-hydroxy-2-nonenal+in+human+plasma:+Effects+of+long-term+L-arginine+administration.">Simultaneous GC-MS/MS measurement of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in human plasma: Effects of long-term L-arginine administration.</a> Analytical Biochemistry. 524, 31-44 (2017).</li></ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse para divulgar.

Apesar de suas limitações1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 e falta de adequação para comparação entre laboratórios, o ensaio do TBARS é um dos <sup...

A peroxidação lipídica é um processo no qual radicais livres, como espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio, atacam ligações duplas carbono-carbono em lipídios, um processo que envolve a abstração de um hidrogênio a partir de um carbono e inserção de uma molécula de oxigênio. Esse processo leva a uma mistura de produtos complexos, incluindo, radicais lipídicos e hidroperóxidos como produtos primários, bem como malondialdeído (MDA) e 4-hidroxynonenal como produtos secundários predominantes1.
O MDA tem sido amplamente utilizado em pesquisas biomédicas como um marcador de peroxidação lipídica devido à sua reação fácil com ácido tiobarbitúrico (TBA). A reação leva à formação do MDA-TBA2, um conjugado que absorve no espectro visível a 532 nm e produz uma cor vermelho-rosa2. Outras moléculas derivadas da peroxidação lipídica além do MDA também podem reagir com TBA e absorver luz a 532 nm, contribuindo para o sinal de absorção global que é medido. Da mesma forma, o MDA pode reagir com a maioria das outras classes principais de biomoléculas, potencialmente limitando sua acessibilidade para reação com TBA3,4. Como tal, este ensaio tradicional é simplesmente considerado para medir "substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico" ou TBARS5.
Quando corretamente aplicado e interpretado, o ensaio TBARS é geralmente considerado um bom indicador dos níveis globais de estresse oxidativo em uma amostra biológica6. Infelizmente, como documentado por Khoubnasabjafari e outros, o ensaio TBARS é frequentemente conduzido e interpretado de maneiras que facilitam conclusões duvidosas3,4,7,8,9,10,11. As causas para isso estão enraizadas principalmente em variáveis pré-analíticas relacionadas à amostra e na falta de robustez de ensaios que proíbe variações aparentemente menores no protocolo de ensaio sem alterações substanciais nos resultados do ensaio1,7,12,13.
Variáveis pré-analíticas relacionadas ao manuseio e armazenamento de bioespecímen (por exemplo, o plasma de sangue mantido temporariamente a -20 °C)14,15 podem ter um grande impacto nos resultados do ensaio TBARS16,17; tanto que os resultados do ensaio TBARS não devem ser comparados em diferentes laboratórios, a menos que seja justificado por dados explícitos de validação analítica interlaboratória. Esta recomendação é semelhante à forma como as manchas ocidentais são comumente usadas e interpretadas. Comparações de densidades de banda são válidas para estudos dentro da mancha e talvez dentro de laboratório, mas comparar densidades de banda entre laboratórios é geralmente considerado uma prática inválida.
Alguns pesquisadores sugeriram que o MDA medido pelo ensaio TBARS simplesmente não atende aos critérios analíticos ou clínicos exigidos de um biomarcador aceitável3,9,10,18,19. De fato, se o ensaio não tivesse sido desenvolvido há mais de 50 anos, provavelmente não teria ganho o uso generalizado e a aceitabilidade tácita que tem hoje. Embora existam outros ensaios com maior sensibilidade analítica, especificidade e robustez utilizadas para determinar o estresse oxidativo, o ensaio TBARS baseado na absorção a 532 nm permanece de longe um dos ensaios mais utilizados para a determinação da peroxidação lipídica20, e assim a avaliação do estresse oxidativo.
O ensaio TBARS só pode ser encontrado como um kit caro (mais de 400 dólares americanos), no qual as instruções não fornecem informações detalhadas sobre a maioria das concentrações dos reagentes utilizados. Além disso, os reagentes fornecidos só podem ser usados para um experimento, pois apenas uma curva padrão colorimétrica pode ser feita por kit. Isso pode ser problemático para pesquisadores que pretendem determinar níveis de oxidação dentro de algumas amostras em diferentes pontos de tempo, porque a mesma curva padrão não pode ser usada em vários momentos. Portanto, vários kits precisam ser comprados para vários experimentos. Atualmente, a menos que um kit caro seja comprado, não há um protocolo detalhado disponível para como realizar um ensaio TBARS. Alguns pesquisadores no passado descreveram vagamente como realizar um ensaio TBARS21,22, mas nem um protocolo totalmente detalhado ou um vídeo abrangente sobre como conduzir o ensaio TBARS sem um kit caro está disponível na literatura.
Aqui relatamos uma metodologia detalhada e analiticamente validada para fins sobre como realizar um ensaio TBARS de forma simples, reprodutível e barata. Alterações na peroxidação lipídica do soro humano, lisatos hepG2 e lipoproteínas de baixa densidade após o tratamento com íons cu(II) são demonstradas como aplicações ilustrativas para o ensaio TBARS. Os resultados demonstram que este ensaio TBARS é consistente e reproduzível no dia-a-dia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Sterile PBS pH 7.4 1 L</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>101642--262</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL self-standing centrifuge tube</td>
			<td>Corning, NY</td>
			<td>CLS430897</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate, Non-Treated, clear, with lid, Non-sterile</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA</td>
			<td>280895</td>
			<td>To measure absorbance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 100 kD centrifugal spin filter device</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>UFC510024</td>
			<td>LDL purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for glass tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, MA</td>
			<td>14-930-15D</td>
			<td>for TBARS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper II Chloride</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>222011-250G</td>
			<td>to induce oxidation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture tubes, Disposable, with Screw-Cap Finish, Borosilicate Glass (13 x 100 mm)</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>53283-800</td>
			<td>for TBARS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle&#39;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td>
			<td>ATCC, VA</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>HepG2 cell media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>eppendorf, NY</td>
			<td>22363204</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL</td>
			<td>Genesee Sceitific, CA</td>
			<td>22363352</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum US Source</td>
			<td>Omega Scientific, CA</td>
			<td>FB-11</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>27225-1L-R</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>87786</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td>LDL solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 Cells</td>
			<td>ATCC, VA</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Biological matrix prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>A144-212</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legend Micro 17 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>75002431</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Density Lipoprotein, Human Plasma</td>
			<td>Athens Research &#38; Technology, GA</td>
			<td>12-16-120412</td>
			<td>Biological matrix prototype</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bars, Octagon 6-Assortment</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>58948-025</td>
			<td>General material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malondialdehyde bis (dimethyl acetal)</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>8207560250</td>
			<td>TBARS Standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan Go Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Fisher Scientific, NH</td>
			<td>51119200</td>
			<td>To measure absorbance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40</td>
			<td>EMD Millipore Corp, MA</td>
			<td>492016-100ML</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>436143-100G</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>367176-2.5KG</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific, MA</td>
			<td>SC250EXP</td>
			<td>For concentrating cell lysates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Flask, Tissue Culture Treated, 250 mL, w/filter cap</td>
			<td>USA Scientific, FL</td>
			<td>658175</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiobarbituric Acid</td>
			<td>SIGMA, MO</td>
			<td>T5500-100G</td>
			<td>TBARS Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS base</td>
			<td>Fluka, GA</td>
			<td>93362</td>
			<td>cell lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1x)</td>
			<td>VWR, PA</td>
			<td>16777-166</td>
			<td>To detach HepG2 cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of oxidative stress in biological samples using the thiobarbituric acid reactive substances assay

Apesar de sua limitada especificidade analítica e robustez, o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS) tem sido amplamente utilizado como uma métrica genérica de peroxidação lipídica em fluidos biológicos. É frequentemente considerado um bom indicador dos níveis de estresse oxidativo dentro de uma amostra biológica, desde que a amostra tenha sido adequadamente manuseada e armazenada. O ensaio envolve a reação de produtos lipídicos de peroxidação, principalmente malondialdeído (MDA), com ácido tiobarbitúrico (TBA), o que leva à formação de adutos MDA-TBA2 chamados TBARS. O TBARS produz uma cor vermelho-rosa que pode ser medida espectrofotometricamente a 532 nm. O ensaio TBARS é realizado em condições ácidas (pH = 4) e a 95 °C. O MDA puro é instável, mas essas condições permitem a liberação de MDA de MDA bis (acetal de dimetila), que é usado como padrão analítico neste método. O ensaio TBARS é um método simples que pode ser concluído em cerca de 2 h. A preparação dos reagentes de ensaios são descritas em detalhes aqui. Pesquisadores conscientes do orçamento podem usar esses reagentes para experimentos múltiplos a um custo baixo em vez de comprar um kit de ensaio TBARS caro que só permite a construção de uma única curva padrão (e, portanto, só pode ser usado para um experimento). A aplicabilidade deste ensaio TBARS é mostrada em soro humano, lipoproteínas de baixa densidade e lises celulares. O ensaio é consistente e reprodutível, e os limites de detecção de 1,1 μM podem ser alcançados. Recomendações para o uso e interpretação do ensaio espectrofotométrico TBARS são fornecidas.

Em condições ácidas (pH = 4) e a 95 °C, o malondialdeído (MDA) bis (acetal de dimetila) produz MDA23. Os congêneres químicos relacionados com mDA e intimamente relacionados reagem com duas moléculas de ácido tiobarbitúrico (TBA) para produzir compostos chamados substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico (TBARS), que dão uma cor vermelho-rosa e têm uma absorção λmax a 532 nm (Figura 1, Figura 2). Utilizando-s...

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Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

O objetivo do ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico é avaliar o estresse oxidativo em amostras biológicas medindo a produção de produtos de peroxidação lipídica, principalmente malondialdeído, utilizando espectrofotometria de comprimento de onda visível a 532 nm. O método descrito aqui pode ser aplicado ao soro humano, lises celulares e lipoproteínas de baixa densidade.

Avaliação do estresse oxidativo em amostras biológicas usando o ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico

Despite its limited analytical specificity and ruggedness, the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay has been widely used as a generic ...

evaluation-oxidative-stress-biological-samples-using-thiobarbituric

Research

JoVE Journal

Chemistry

27.2K visualizações.  Arizona State University. O objetivo do ensaio de substâncias reativas de ácido tiobarbitúrico é avaliar o estresse oxidativo em amostras biológicas medindo a produção de produtos de peroxidação lipídica, principalmente malondialdeído, utilizando espectrofotometria de comprimento de onda visível a 532 nm. O método descrito aqui pode ser aplicado ao soro humano, lises celulares e lipoproteínas de baixa densidade.

Vídeo: Evaluation of Oxidative Stress in Biological Samples Using the Thiobarbituric Acid Reactive Substances Assay

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Química

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; therefore their preparation should be conducted under an inert atmosphere. Evaluation of the anticancer activity of these complexes can be achieved by the MTT assay.
The MTT assay is a colorimetric viability assay based on enzymatic reduction of the MTT molecule to formazan when it is exposed to viable cells. The outcome of the reduction is a color change of the MTT molecule. Absorbance measurements relative to a control determine the percentage of remaining viable cancer cells following their treatment with varying concentrations of a tested compound, which is translated to the compound anticancer activity and its IC50 values. The MTT assay is widely common in cytotoxicity studies due to its accuracy, rapidity, and relative simplicity.
Herein we present a detailed protocol for the synthesis of air sensitive metal based drugs and cell viability measurements, including preparation of the cell plates, incubation of the compounds with the cells, viability measurements using the MTT assay, and determination of IC50 values.

A method for synthesis of air-sensitive titanium and vanadium anticancer agents is described, along with the evaluation of their cytotoxic activity towards human cancer cell line by the MTT Assay.

Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

Supercritical Nitrogen Processing for the Purification of Reactive Porous Materials

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. Herein, nitrogen is presented as a novel supercritical drying fluid for specialized applications such as in the processing of reactive porous materials, where carbon dioxide and other fluids are not appropriate due to their higher chemical reactivity. Nitrogen exhibits similar physical properties in the near-critical region of its phase diagram as compared to carbon dioxide: a widely tunable density up to ~1 g ml-1, modest critical pressure (3.4 MPa), and small molecular diameter of ~3.6 &#197;. The key to achieving a high solvation power of nitrogen is to apply a processing temperature in the range of 80-150 K, where the density of nitrogen is an order of magnitude higher than at similar pressures near ambient temperature. The detailed solvation properties of nitrogen, and especially its selectivity, across a wide range of common target species of extraction still require further investigation. Herein we describe a protocol for the supercritical nitrogen processing of porous magnesium borohydride.

Nitrogen is an effective supercritical fluid for extraction or drying processes due to its small molecular size, high density in the near-liquid supercritical regime, and chemical inertness. We present a supercritical nitrogen drying protocol for the purification treatment of reactive, porous materials.

Processamento de nitrogênio supercrítico para a purificação de Reativos Porous Materials

Supercritical fluid extraction and drying methods are well established in numerous applications for the synthesis and processing of porous materials. ...

Using Polystyrene-block-poly(acrylic acid)-coated Metal Nanoparticles as Monomers for Their Homo- and Co-polymerization

We present a template-free method for &#8220;polymerizing&#8221; nanoparticles into long chains without side branches. A variety of nanoparticles are encapsulated in polystyrene-block-poly(acrylic acid) (PSPAA) shells and then used as monomers for their self-assembly. Spherical PSPAA micelles upon acid treatment are known to assemble into cylindrical micelles. Exploiting this tendency, the core-shell nanoparticles are induced to aggregate, coalesce, and then transform into long chains. When more than one type of nanoparticles are used, random and block &#8220;copolymers&#8221; of nanoparticles can be obtained. Detailed procedures are reported for the PSPAA encapsulation of nanoparticles, homo- and co-polymerization of the core-shell nanoparticles, separation and purification of the resulting nanoparticle chains. Transformations of single-line chains into double- and triple-line chains are also presented. The synergy between the polymer shell and the embedded nanoparticles leads to an unusual chain-growth polymerization mode, giving long nanoparticle chains that are distinct from the products of the traditional step-growth aggregation process.

Using Polystyrene-block-polyacrylic acid-coated Metal Nanoparticles as Monomers for Their Homo- and Co-polymerization

We report protocols for &#8220;polymerizing&#8221; various types of polymer-encapsulated metal nanoparticles into long chains of &#8220;homo-&#8220; and &#8220;co-polymers&#8221;.

Usando Polystyrene-<em&gt; Bloco</em&gt; -poli (Ácido acrílico) -Revestido metal Nanopartículas como monómeros para a sua homo- e co-polimerização

We present a template-free method for &#8220;polymerizing&#8221; nanoparticles into long chains without side branches. A variety of nanoparticles are ...

Photochemical Oxidative Growth of Iridium Oxide Nanoparticles on CdSe@CdS Nanorods

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide (CdSe@CdS) nanorod photocatalysts. Seeded rods are grown using a colloidal hot-injection method and then moved to an aqueous medium by ligand exchange. CdSe@CdS nanorods, an iridium precursor and other salts are mixed and illuminated. The deposition process is initiated by absorption of photons by the semiconductor particle, which results with formation of charge carriers that are used to promote redox reactions. To insure photochemical oxidative growth we used an electron scavenger. The photogenerated holes oxidize the iridium precursor, apparently in a mediated oxidative pathway. This results in the growth of high quality crystalline iridium oxide particles, ranging from 0.5 nm to about 3 nm, along the surface of the rod. Iridium oxide grown on CdSe@CdS heterostructures was studied by a variety of characterization methods, in order to evaluate its characteristics and quality. We explored means for control over particle size, crystallinity, deposition location on the CdS rod, and composition. Illumination time and excitation wavelength were found to be key parameters for such control. The influence of different growth conditions and the characterization of these heterostructures are described alongside a detailed description of their synthesis. Of significance is the fact that the addition of iridium oxide afforded the rods astounding photochemical stability under prolonged illumination in pure water (alleviating the requirement for hole scavengers).

A protocol for the photochemical oxidative growth of small crystalline iridium oxide nanoparticles on the surface of CdSe@CdS seeded rod nanoparticles is presented.

Fotoquímica Crescimento oxidativo da Iridium nanopartículas de óxido de CdSe @ CdS nanobastões

We demonstrate a procedure for the photochemical oxidative growth of iridium oxide catalysts on the surface of seeded cadmium selenide-cadmium sulfide ...

The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and characterize microbial communities in environmental and biological systems. These measurements are even enabling enhanced analyses of complex soil microbial communities, which are the most complex microbial systems known to date. Multi-omic analyses, however, do have sample preparation challenges, since separate extractions are typically needed for each omic study, thereby greatly amplifying the preparation time and amount of sample required. To address this limitation, a 3-in-1 method for the simultaneous extraction of metabolites, proteins, and lipids (MPLEx) from the same soil sample was created by adapting a solvent-based approach. This MPLEx protocol has proven to be both simple and robust for many sample types, even when utilized for limited quantities of complex soil samples. The MPLEx method also greatly enabled the rapid multi-omic measurements needed to gain a better understanding of the members of each microbial community, while evaluating the changes taking place upon biological and environmental perturbations.

A protocol is presented for simultaneously extracting metabolites, proteins, and lipids from a single soil sample, allowing reduced sample preparation times and enabling multi-omic mass spectrometry analyses of samples with limited quantities.

O protocolo de mplexas para Multi-omic análises de amostras de solo

Mass spectrometry (MS)-based integrated metaproteomic, metabolomic, and lipidomic (multi-omic) studies are transforming our ability to understand and ...

Separation of Aldehydes and Reactive Ketones from Mixtures Using a Bisulfite Extraction Protocol

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer by generating a charged structure provides an opportunity to use extraction as a simple purification technique. By combining the use of a miscible organic solvent with saturated sodium bisulfite, aldehydes and reactive ketones can be successfully transformed into charged bisulfite adducts that can then be separated from other organic components of a mixture by the introduction of an immiscible organic layer. Here, we describe a simple protocol for the removal of aldehydes, including sterically-hindered neopentyl aldehydes and some ketones, from chemical mixtures. Ketones can be separated if they are sterically unhindered cyclic or methyl ketones. For aliphatic aldehydes and ketones, dimethylformamide is used as the miscible solvent to improve removal rates. The bisulfite addition reaction can be reversed by basification of the aqueous layer, allowing for the re-isolation of the reactive carbonyl component of a mixture.

Here, we present a protocol to remove aldehydes and reactive ketones from mixtures by a liquid-liquid extraction protocol directly with saturated sodium bisulfite in a miscible solvent. This combined protocol is rapid and facile to perform. The aldehyde or ketone can be re-isolated by the basification of the aqueous layer.

Separação de aldeídos e cetonas reativas de misturas usando um protocolo de extração de bissulfito

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The resulting devices are an example of self-propelled objects capable of generating motion without external actuation and have potential applications in medicine and environmental sciences for a variety of purposes ranging from micro-stirring, targeted therapeutic delivery, to water remediation (e.g., cleaning oil spills). This method employs reactive inkjet printing to generate well-defined small-scale solid silk structures by converting water soluble regenerated silk fibroin (silk I) to insoluble silk fibroin (silk II). These structures are also selectively doped in specific regions with the enzyme catalase in order to produce motion via bubble generation and detachment. The number of layers printed determines the three-dimensional (3D) structure of the device, and so here the effect of this parameter on the propulsive trajectories is reported. The results demonstrate the ability to tune the motion by varying the dimensions of the printed structures.

This protocol demonstrates the ability to utilize reactive inkjet printing to print self-motile biocompatible and environmentally friendly micro-stirrers for use in biomedical and environmental applications.

Impressão de jato de tinta reativa e análise de propulsão de micro-agitadores autopropulsionados à base de seda

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Síntese e Bioconjugation dos reagentes Thiol-reativa para a criação de Site-seletivamente modificado Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

Preparação de amostras biológicas para especiação em temperatura criogênica usando espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...