Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (AI079442 e AI091918) concedidos a SEFD

1. Preparação de meios de agar selectivas (BHI / L + L) para inibir a microbiota intestinal <ol><li> Pesar 26 g Cérebro Heart Infusion Agar (Difco), 7,5 g LiCl e 5,0 g de glicina e coloque em um frasco de 1 litro. Adicionar 500 ml de água desionizada. </li><li> Aquecer em um agitador magnético até que as bolhas de agar, agitando continuamente. Pegue o frasco fora do fogo, deixe que as bolhas resolver brevemente e, em seguida, trazer de volta a ferver novamente. </li><li> . Autoclave durante 30 minutos a 121 ° C sob 16-19 psi num ciclo de líquidos Nota: deixar a barra de agitação no frasco. </li><li> Equilibrar a mídia para 55 ° C num banho de água ou de deixar arrefecer à temperatura ambiente. Não permitir que a solução para se mais frio do que 55 ° C ou irá formar cristais no agar. Os cristais não inibem L. crescimento monocytogenes ou afetar as propriedades seletivas da mídia. No entanto, os cristais será semelhante em aparência a pequenas colônias e vai dificultar a contagem de UFC de bactérias. </li><li> Misture delicadamente oagar, durante 1 minuto, utilizando um agitador magnético. Evitar a formação de bolhas de ar. Deite o ágar em placas de Petri (~ 25 ml / placa). Nota: Esta mídia não suporta o crescimento de todos L. cepas monocytogenes. Por exemplo, L. monocytogenes EGDE cresce bem neste agar, com colónias visíveis dentro de 36-48 horas, mas 10403s não cresce nessa mídia. </li></ol> 2. Preparação do inoculo <ol><li> Corte o pão branco fatiado (Kroger) em pequenas (2-3 mm) cubos com uma tesoura estéril, ora lâmina de bisturi estéril. Não use as crostas. Armazenar peças individuais em tubos de microcentrífuga a -20 ° C até ao dia da infecção. </li><li> Usando um bisturi estéril, cortar pequenos (0,5-1 cm), pedaços de manteiga com sal (Kroger) e coloque cada um em um tubo de microcentrífuga estéril. Cada tubo irá conter manteiga suficiente para preparar 50 - 60 partes do pão. Armazenar a -20 ° C até ser necessário. </li><li> Crescer L. monocytogenes em caldo BHI sacudindo a 30 edeg; C até a cultura atingir uma DO600 de ~ 0,8-1,0. Preparar 500 mL alíquotas em tubos de microcentrífuga, tendo o cuidado de vórtice da amostra com frequência para todos os tubos contêm o mesmo número de bactérias. Armazenar a -80 ° C. </li><li> Titule a aliquotas bacterianas, descongelar um tubo em gelo e, em seguida adicionar 500 ul de 9,5 ml de caldo BHI. Incubar por 1,5 horas, ficar a 30 ° C. Placa de diluições em série em agar BHI. Esperar um tulo de ~ 1-5 x 10 8 UFC / ml Nota:. Se aliquotas homogéneos são preparados, pode esperar que cada um dos tubos para se obter este título, quando preparado de um modo semelhante com uma variação de 2 a 4 vezes. </li><li> Para infectar camundongos, prepare uma alíquota de L. Listeria, conforme descrito no passo 2.4. Cerca de 20 min antes do L. cultura monocytogenes está pronto, descongelar os pedaços de pão na RT. Derrete-se uma alíquota de manteiga a 55 ° C e pré-aquecer um pequeno volume de PBS a 55 ° C. Prepare pedaços de pão suficiente para que haja pelo menos um por ratinhoa ser infectados e pelo menos uma peça adicional para a determinação do título do inoculo real. </li><li> Com base no título predeterminado da alíquota bacteriana, calcular o volume total de L. Listeria cultura necessário para preparar o inoculo para o número necessário de partes do pão. Agregar as bactérias por centrifugação a 14.000 xg durante 10 min Aspirar todo o caldo BHI e voltar a suspender as bactérias em um pequeno volume de PBS pré-aquecido (2 ul / pedaço de pão). </li><li> Vortex a manteiga derretida, adicione a bactérias (usando um volume total igual a 3 mL / pedaço de pão) e misture bem Nota:. Não tente preparar mais de 10-15 pedaços de pão ao mesmo tempo ou a manteiga solidificar. </li><li> Trabalhando de forma rápida, uma pipeta de 5 mL da suspensão bacteriana sobre um único pedaço de pão num tubo de microcentrífuga. A solução deve ser completamente absorvida pelo pedaço de pão. </li><li> Para determinar o título real do inoculo, adicionar 1 ml de PBS estéril a uma das piec pãoes. Vortex vigorosamente durante 1 min. Preparar diluições em série e placa tanto BHI e BHI / L + G agar. </li><li> Procedimento alternativo para o título elevado (&gt; 10 9 CFU) inóculos. Se o sedimento bacteriano é muito grande, pode ser difícil de suspender num volume tão pequeno, e o material resultante é muito viscosa, como uma pasta, e algum do inoculo podem colar-se os lados do tubo de microcentrífuga. Neste caso, é melhor para inocular o pão num prato esterilizado de 60 mm de cultura, e para oferecer toda a cápsula (sem tampa) do rato (ver em baixo). Qualquer excesso de inoculo que não é absorvida pelo pão pode então ser comido directamente pelo rato. Em geral, leva mais tempo para que os ratos comem todos do pão e lamber o prato limpo do que o protocolo padrão descrito abaixo, de modo que este é apenas o método preferido quando se trata de muito alta inóculos título. </li></ol> 3. Infecção de Ratos <ol><li> Compra fêmea BALB / c / por / J (stock # 0010026) e C57BL/6/J (estoque# 000644) do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME) e usar em 6-9 semanas de idade. </li><li> Rápida dos ratos de um dia (24 horas) antes da infecção por remoção de alimentos e colocando-as em ratinhos (1 polegada) de revestimento de arame levantada (malha # 3; Allentown) para evitar a coprofagia. Deixe apenas roupa de cama suficiente na gaiola para absorver a urina, mas não o suficiente para elevar as fezes derramado. Permitir acesso irrestrito à água. </li><li> Infect os ratos no início do ciclo de escuro, a trabalhar numa câmara de fluxo laminar, equipado com uma lâmpada vermelha. Transferir um único rato a um (sem cama) gaiola vazia. Utilizando um fórceps estéril, transferir o pedaço de pão contaminado para o fundo da gaiola vazio. Normalmente, o rato vai pegar o pedaço de pão e consumi-lo inteiramente dentro de 2-10 min. Se o rato não come o pão de imediato, retornar a gaiola para quebrar e deixar o mouse em repouso por 20-30 min. A maioria dos animais vão comer o pão dentro deste prazo, no entanto, os ratos pode ser deixada intacta, sem acesso a otsua comida ou água por até 2 horas. </li><li> Após a infecção, o retorno do mouse para sua gaiola original e repor o mouse comida. Continuar a alojar os ratinhos num pavimento de fio levantado para a duração da experiência. </li></ol> 4. Monitorar o nível de bactérias eliminadas nas fezes <ol><li> Rótulos e pré-pesar os tubos de microcentrífuga para ser utilizado para a recolha de fezes. </li><li> Trabalhando rapidamente depois de recuperar de uma gaiola de ratos, coloque cada rato em um copo de plástico de 500 ml. Normalmente, os ratos vão expulsar 1-4 pelotas de fezes dentro de 5 min. </li><li> É um fórceps estéril para transferir as fezes para tubos adequadamente etiquetados. </li><li> Pesar cada tubo e calcular o peso das fezes, através da subtracção do peso do tubo vazio. Pesos típicos para pastilhas fecais variar 10-30 mg. </li><li> Adicionar PBS em cada tubo (200 mg μl/30 fezes) e use um palito estéril para esmagar as pelotas fecais. </li><li> Vortex cada tubo por 30 segundos, em seguida, preparar diluições seriadas e placa em BHI / L+ G ágar. Contar o número de colônias e calcular UFC / mg fezes. </li></ol> 5. Processamento de tecidos intestinais infectados <ol><li> Eutanásia dos ratos, colher assepticamente o estômago e os intestinos de cada rato como um único tecido e recolher em vazios milímetros pratos de Petri 100. </li><li> Separe o intestino delgado, ceco e cólon e coloque em pratos separados 60 milímetros armazenados no gelo. O intestino delgado pode ser ainda dividido pelo comprimento em três partes iguais de aproximação do duodeno, jejuno e íleo, para facilitar a remoção do conteúdo luminal. Os terços do tecido pode, então, ser processadas em conjunto (por CFU por todo intestino delgado) ou separadamente. Tecidos molhados com ~ 0,5 ml PBS estéril para manter flexível e evitar as lágrimas durante o manuseio. </li><li> Encha uma seringa de 10 ml com 8 ml PBS estéril e anexar uma agulha de 25 g. Use uma pinça estéreis para espremer o conteúdo luminal em um copo de resíduos (ou um tubo estéril de 50 ml, se recolher as bactérias luminais). Gripesh 4 ml de PBS através de uma das extremidades do tecido, o uso da pinça para espremer o conteúdo, e depois virar o tecido e repetir na outra extremidade. </li><li> Para quantificar o número de Listeria no conteúdo luminal, centrifugar os rubores reunidos durante 20 minutos a 12.000 xg, a suspender o sedimento em 0,5 - 1,0 ml de água estéril. </li><li> Para quantificar o número total de quantidade de células associada Listeria, abra cada tecido lavado cortando longitudinalmente com lâmina de bisturi estéril e, em seguida, fazer vários cortes laterais para cortar o tecido em fragmentos menores Nota:. Este passo é essencial para garantir que o tecido intestinal não envolver a lâmina homogeneizador. Transferir as peças intestinais para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 2 ml de água estéril. </li><li> Esterilizar um homogeneizador de tecidos (Fisher Power Gen 1000), colocando a sonda em etanol a 70% a 60% de potência durante 30 segundos. Espere por etanol para ar seco, ou um processo em água estéril durante 10 segundos. Homogeneizar cada tissue por 1 min. Repetir o tratamento com água estéril entre cada uma das amostras, e utilizar etanol a 70% entre os grupos de amostra. </li><li> Preparar diluições em série de cada amostra com água estéril e placa BHI / L + L de agar. </li></ol> 6. Tratamento dos infectados linfonodos mesentéricos <ol><li> Gânglios linfáticos colheita assepticamente, coloque em uma estéril 60 milímetros prato no gelo, e usar uma pinça estéril para remover toda a gordura em anexo. Espere encontrar 3-6 nós por mouse. </li><li> Prepare telas de malha de arame, cortando 1,5-2 polegadas pedaços quadrados de aço inoxidável # 80 mesh. Faça um pequeno corte em cada esquina, e dobre os quatro lados, criando uma cama levantada. Mergulhe em etanol 95% e, em seguida, chama para esterilizar, e coloque em um 60 milímetros placa de Petri contendo 0,75 ml de água estéril. Após cada utilização, as telas podem ser reciclados por imersão em etanol a 70% durante 20 min, esfregando com uma escova para remover tecidos embebidos, ebulição durante 20-30 min em NaOH 2N, e em seguida a lavagem extensiva com água. </li><li> Usar o êmboloa partir de uma estéril seringa de 3 ml para triturar os nós através da tela da malha. Certifique-se de empurrar para baixo na tela para o fundo do prato assim que faz o contato com a água no prato. </li><li> Passe 0,75 ml de água estéril através da tela e, em seguida, pipeta cima e para baixo várias vezes para lavar a tela. Transferência de suspensão de células para um tubo de microcentrífuga. </li><li> Vortex de cada amostra vigorosamente durante 30 segundos para lisar as células. Preparar diluições em série e placa em ambos BHI / L + G agar. </li></ol> 7. Processamento de baço infectado, fígados, e vesícula <ol><li> Segure baço com pinça estéril e libertar, fazendo dois cortes, um em cada extremidade. Colocar num tubo de 15 ml contendo 2,5 ml de água estéril. (Nota: os tubos com fundo redondo pode ser mais fácil de usar com o homogeneizador). </li><li> Localize a vesícula biliar (um amarelo pequeno saco cheio de líquido ligado ao fígado) e recorte cuidadosamente com tesoura esterilizada para separar de fígado sem estourar. Transfer para um tubo de microcentrífuga contendo 1 ml de água estéril. </li><li> Remover assepticamente o fígado, certificando-se para remover todos os lóbulos, e transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 2,5 ml de água estéril. </li><li> Homogeneizar os baços e fígados como descrito acima durante 30 segundos em 60% de energia. Bexigas Forgall, utilizar tesouras estéreis para rasgar no tubo de microcentrífuga, e depois vigorosamente vórtice durante 30 seg. </li><li> Preparar diluições em série e as placas de cada amostra em cada BHI ou BHI / L + L de agar. </li></ol> 8. Processamento de cérebros infectados <ol><li> Trabalhando a partir do lado dorsal do rato, cortar a pele e o tecido de cima do pescoço, e através de ambos os ouvidos com um ângulo de 45 °. Use uma pinça estéril para descolar a tampa em forma de U de pele puxando para o nariz e expor o crânio e ossos faciais. </li><li> Imobilizar o crânio, segurando a crista óssea entre os olhos com uma pinça, e utilize uma tesoura para fazer cortes superficiais através dos bordos laterais do crânio. Sercuidado para cortar apenas o osso e não o tecido cerebral. Em seguida, cortar a crista óssea entre os olhos. Use uma pinça para segurar a parte superior do crânio e puxar para trás (na direcção do pescoço) para expor o cérebro. </li><li> Levante cuidadosamente o cérebro de sua cavidade usando uma pinça estéril e coloque em um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 1,5 ml de água estéril. </li><li> Homogeneizar durante 20 segundos em 60% de potência como acima descrito. Preparar diluições em série e placa em ambos BHI ou BHI / L + G agar. </li></ol> 9. Procedimento Suplementar: Fracionamento de tecidos intestinais 9.1 Isolamento de bactérias na fração Muco <ol><li> Para cada tecido intestinal, preparar 3 tubos contendo 3 mL de N-acetilcisteína, 6 mM (NAC; Sigma # A-9165). </li><li> Coloque a corada e cortado longitudinalmente do tecido no primeiro tubo para 1-2 min, agitando vigorosamente a cada 20-30 segundos. Utilizando uma pinça estéril, pegar o tecido e aperte suavemente contra a lateral do tubo para remover o excesso de liquid. </li><li> Repetir passo 9.1.2 duas vezes mais, usando os tubos restantes NAC. Remover o tecido intestinal e reserve para posterior processamento. </li><li> Pool de NAC lava (total de 9 mL), e centrifuga-se durante 20 min a 12.000 x g. </li><li> Ressuspender o sedimento em água estéril, vortex durante 30 seg, e preparar diluições em série em placas de BHI / L + G. </li></ol> 9.2 Isolamento de bactérias no celular (CE) Fração epitelial <ol><li> Corte cada tecido em pequenos pedaços com uma tesoura estéreis e colocar num tubo de 50 ml contendo 5 ml de meio RPMI (Invitrogen # 21870) suplementado com 5% de FBS (RP-5), EDTA 5 mM e DTT 1 mM. Incubar com agitação a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Transferir as peças intestinais para um tubo fresco contendo 5 ml RP5/EDTA/DTT e incubar com agitação a 37 ° C durante 20 min. Salvar os meios de comunicação a partir do primeiro tubo e reserve a 37 ° C. Repetir este processo mais uma vez para um total de três incubações de 20 minutos na RP5/EDTA/DTT. Se passar para a lâmina própria isopasso mento, transfira os pedaços restantes intestinais em vazio tubo de 50 ml. </li><li> Combina-se as três lavagens RP5/EDTA/DTT (volume total de 15 ml) e de centrifugação a baixa velocidade (1200 xg) para sedimentar as células. </li><li> Para quantificar as bactérias extracelulares, recolhe-se o sobrenadante e centrifuga-se durante 20 min a 12.000 x g. Ressuspender o sedimento em 0,5 - 1,0 ml de água estéril e diluições em série em placas de BHI / L + L de agar. </li><li> Para enumerar as bactérias intracelulares, ressuspender o sedimento em 5 ml de CE de RP-5, contendo 25 ug / ml de gentamicina. Incubar a única suspensão celular durante 30 min a 37 ° C, mais de 7% de CO 2 para matar qualquer remanescente L. extracelular monocytogenes. Lave as células duas vezes em PBS, suspensão em 0,5 ml de água estéril, e de vórtice durante 30 segundos para lisar as células. Preparar diluições em série em água e um prato de BHI / L + G. Nota: As células recolhidas nesta etapa também conterá células de placas de Peyer subjacente. Se desejar, o Peyer visível éRemendos pode ser removido dos tecidos intestinais antes da lavagem e cortando longitudinalmente. </li></ol> 9.3 Isolamento de bactérias na lâmina própria (LP) Fração <ol><li> Lavar o excesso de DTT / EDTA a partir das peças intestinais pela adição de 25 ml de PBS estéril com o tubo. Agite vigorosamente, transferir para um novo tubo e repetir duas vezes. </li><li> Transferir as peças intestinais para um tubo de 50 ml, contendo 4 ml de solução de digestão consistindo em RP-5 e suplementado com 1 mg / mL de colagenase tipo IV e 40 ug / ml de ADNase I. Incubar agitação a 37 ° C durante 40 min. </li><li> Transferir as peças não digeridas dentro de um tubo fresco contendo 4 ml de solução de digestão e repetir uma vez ou duas vezes até que as peças de tecido são completamente digerido. Conservar a cada uma das soluções de digestão, que contêm as células LP libertadas, a 37 ° C. </li><li> Centrifugar as soluções reunidas de digestão a baixa velocidade (1200 xg) para sedimentar as células. Processa-se o sobrenadante e sedimento de células separado como described acima para enumerar bactérias extracelulares e intracelulares, respectivamente. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Todos os experimentos aqui descritos foram realizados em conformidade com The Office for Laboratory Animal Welfare (OLAW), com a aprovação do ICAUC na Universidade de Kentucky.

Camundongos isogênicos não são uniformemente receptivo a alimentação em todos os momentos do dia, e sua vontade de comer o pão contaminado vai depender tanto da cepa e da idade dos camundongos 17. Em nossa experiência, 6-9 semanas de idade camundongos B6 são receptivos a alimentar a qualquer hora do dia, mas camundongos BALB não vai comer de forma consistente o pedaço de pão a menos que seja oferecido durante o seu ciclo de escuro. O ciclo de luz da sala utilizada para abrigar os animais podem ser ...

Listeria monocytogenes são facultativos patógenos intracelulares que causam infecções de origem alimentar em humanos. As bactérias são resistentes a muitos dos processos utilizados para proteger a fonte de alimento, tais como a secagem, a salga, ou 1,2 refrigeração e infecções são normalmente ligados a transformados, &quot;pronto-a-comer&quot; alimentos que não são aquecidos antes de serem consumidos . Em vários surtos anteriores, a fonte de L. Listeria alimentos contaminados foi identificado, e o grupo restrito de indivíduos expostos foi cuidadosamente monitorizados 3-6. Nesses exemplos, a doença clínica em indivíduos saudáveis ​​variou de um leve, auto-limitante gastroenterite a infecções intestinais e sistêmicas mais graves que necessitaram de internação hospitalar. L. infecções monocytogenes em indivíduos imunes comprometidos, incluindo os recém-nascidos e pessoas idosas, têm sido associadas com uma elevada taxa de mortalidade (25-30%), mesmo com o tratamento antibiótico <sse&gt; 7,8. Pouco se sabe sobre a dose infecciosa para L. monocytogenes, ou os fatores do hospedeiro que determinam a susceptibilidade à infecção após a transmissão oral, principalmente devido à falta de um modelo animal de pequeno porte que recapitula esta vasta gama de resultados de infecção. O modelo mais largamente utilizado é de listeriose a inoculação intravenosa (iv) de ratinhos. O modelo IV é altamente reprodutível, e tem sido extremamente útil para estudar as respostas de células T tanto naive e de memória durante a infecção 9,10. A desvantagem do modelo IV é que contorna completamente a fase de infecção intestinal. Depois de comida transmissão transmitidas, na mucosa intestinal proporciona uma barreira que, presumivelmente, retarda e limita o número de bactérias que podem disseminar continuamente para os tecidos periféricos. Em contraste, a totalidade do inoculo podem ser encontrados no baço e no fígado dentro de minutos após a administração iv, e este grande bolus de organismos podem sobrecarregar d imune inataefenses nestes tecidos. A infecção oral de ratos por gavagem é menos usada, uma vez que grandes doses (10 9 -10 11 CFU) são normalmente necessários para alcançar colonização intestinal 10. Além disso, a inoculação intragástrica (IG) com uma agulha de alimentação não gera um período reprodutível de infecção gastrointestinal antes da disseminação sistémica. Alguns laboratórios relataram que L. monocytogenes atingir o baço e fígado dentro de 4-12 horas após a infecção (hpi), enquanto outros não mostraram disseminação sistêmica até 48 hpi 11-15. Esta variação de laboratório para laboratório pode ser uma consequência da natureza invasiva da ig inoculação, o que pode resultar em menor trauma para o revestimento do esófago, e promover a circulação sanguínea invasão directa das bactérias. Recentemente, desenvolveu um novo modelo de mouse oral, L. infecção por Listeria que imita de perto todas as fases da doença humana 16. A infecção ocorre quando os ratinhos ingerir pedaços de contaminados comida, um processo que não é traumático, e não requer habilidades especializadas por investigadores do laboratório. Durante um período limitado de tempo (36-48 horas), L. Listeria reprodutivelmente apenas colonizar o trato gastrointestinal, permitindo assim a investigação dos mecanismos utilizados pelo patogénico Listeria para translocar através da mucosa intestinal e disseminar para tecidos periféricos. É importante ressaltar que o modelo pode ser usado para estudar as diferenças na resistência inata do hospedeiro à infecção. Em um estudo anterior, mostramos que BALB / c / por / J camundongos foram altamente suscetíveis à listeriose transmitida por alimentos, com a replicação exponencial de L. Listeria que ocorrem no intestino, o baço, o fígado, vesícula biliar e 16. Em contraste, os ratinhos C57BL / 6 foram resistentes à infecção transmitida por alimentos, com apenas a colonização de L. transiente Listeria ocorrendo em cada um destes tecidos. Uma característica adicional do modelo de origem alimentar que imita a doença humana é que a disseminação naturaispara o cérebro ocorreu durante as fases posteriores da infecção (dpi 5-7).

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Brain Heart Infusion Agar</td>
 <td>Difco</td>
 <td>BD-241830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lithium chloride</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>L9650</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>Omnipur</td>
 <td>4840</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>15575-038</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D5545</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase, type IV</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS004089</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAse I</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS002007</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Diff-Quik</td>
 <td>Dade-Behring</td>
 <td>B4132-1A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PowerGen 1000 homogenizer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-261-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>stainless steel type 304 mesh #80</td>
 <td>Small Parts, Inc.</td>
 <td>CX-0080-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cytospin</td>
 <td>Statspin</td>
 <td>M801-22</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

oral transmission of listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food

L. monocytogenes são facultativos patógenos intracelulares que causam infecções de origem alimentar em humanos. Muito pouco se sabe sobre a fase de listeriose gastrointestinal, devido à falta de um modelo animal de pequeno porte que imita a doença humana. Este artigo descreve um novo modelo do rato para a transmissão oral de L. monocytogenes. Usando esse modelo, ratos alimentados com L. Listeria contaminado pão tem uma fase discreta de infecção gastrointestinal, seguido por diversos graus de disseminação sistémica em estirpes de ratinho susceptíveis (BALB / c / por / J) ou resistentes (C57BL / 6). Durante as últimas fases da infecção, a divulgação da vesícula biliar e do cérebro é observada. O modelo de listeriose de origem alimentar é altamente reprodutível, não requer conhecimentos especializados, e pode ser usado com uma grande variedade de isolados de bactérias e estirpes de ratinho de laboratório. Como tal, é o modelo ideal para estudar a virulência ambas as estratégias utilizadas por L. monocytogenes </in&gt; para promover a colonização intestinal, assim como a resposta do hospedeiro à alimentação infecção bacteriana ter invasivo.

L. monocytogenes colónias será visível em placas de L + BHI / L, após 36-48 horas de incubação a 37 ° C. As colónias têm, em forma de cúpula aparência branca suave e cremosa (Figura 1A). O crescimento será inibido durante a maior parte da microbiota intestinal, mas é comum ver algumas colónias que não são L. monocytogenes, particularmente quando plaqueamento intestino delgado ou cólon directamente sem diluição significativa (Figura 1B). Colónias sus...

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Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

Este artigo descreve um novo método para a infecção oral de camundongos, usando<em&gt; Listeria monocytogenes</emFood&gt; contaminados. O protocolo pode ser facilmente adaptado para utilização com outros agentes patogénicos bacterianos transmitidas pela comida.

Transmissão Oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em camundongos através de ingestão de alimentos contaminados

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

oral-transmission-listeria-monocytogenes-mice-via-ingestion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

19.1K visualizações.  University of Kentucky. Este artigo descreve um novo método para a infecção oral de camundongos, usando Listeria monocytogenes contaminados. O protocolo pode ser facilmente adaptado para utilização com outros agentes patogénicos bacterianos transmitidas pela comida.

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Imunologia e Infecção

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised patients, the elderly, and pregnant women. The most common manifestations of listeriosis in humans include meningitis, encephalitis, and fetal abortion. A significant but much less documented sequelae of invasive L. monocytogenes infection involves the heart. The death rate from cardiac illness can be up to 35% despite treatment, however very little is known regarding L. monocytogenes colonization of cardiac tissue and its resultant pathologies. In addition, it has recently become apparent that subpopulations of L. monocytogenes have an enhanced capacity to invade and grow within cardiac tissue. This protocol describes in detail in vitro and in vivo methods that can be used for assessing cardiotropism of L. monocytogenes isolates. Methods are presented for the infection of H9c2 rat cardiac myoblasts in tissue culture as well as for the determination of bacterial colonization of the hearts of infected mice. These methods are useful not only for identifying strains with the potential to colonize cardiac tissue in infected animals, but may also facilitate the identification of bacterial gene products that serve to enhance cardiac cell invasion and/or drive changes in heart pathology. These methods also provide for the direct comparison of cardiotropism between multiple L. monocytogenes strains.

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causes fetal infections in pregnant women and meningitis in susceptible populations. Subpopulations of bacteria can colonize cardiac tissue, causing myocarditis in patients and laboratory animals. Here we present a protocol that describes how to assess L. monocytogenes cardiac cell invasion in vitro and cardiac colonization in infected animals.

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

Transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum Ensaio de Ligação ao que prevê a penetração da droga na tuberculose Lesões

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

Listeria monocytogenes Infecção do cérebro

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

Transmissão Oral de

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Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes

Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano

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Transformação de levedura probiótica e sua recuperação a partir gastrointestinais imunitário tecidos após a sonda oral em camundongos

A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown

Infecção experimental com

A

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

Listeria monocytogenes Infecção do cérebro

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans