Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo de patogênese bacteriana sobre se as bactérias transmitidas pelo sangue podem atravessar a barreira hemencefálica para infectar o sistema nervoso central e o cérebro. Com essa técnica, os números bacterianos dentro do sangue e tecido cerebral de animais infectados podem ser determinados, excluindo o número de bactérias residentes dentro dos vasos sanguíneos do cérebro. Demonstrando o procedimento estará Pallab Ghosh, um pesquisador associado do meu laboratório.
Às 72 horas após a infecção, defina um sistema automatizado de perfusão para uma taxa de fluxo de quatro mililitros de PBS suplementados com 10 mililitros de EDTA por minuto. E coloque o animal eutanizado na posição supina em uma panela de dissecção. Confirme a eutanásia por falta de resposta ao aperto de pata.
E molhar o abdômen com 75% de etanol. Use uma tesoura para fazer uma incisão na parede abdominal logo abaixo da caixa torácica para expor o diafragma e órgãos viscerais. E corte o diafragma para abrir a cavidade torácica.
Corte a gaiola de rublo bilateralmente para expor o ventrículo esquerdo e use fórceps para agarrar suavemente o coração. Insira uma agulha borboleta de 21 bitola conectada ao sistema de perfusão no ventrículo esquerdo e corte cuidadosamente o átrio direito para coletar cerca de 200 microliters de sangue em um tubo de dois mililitros contendo 10 mililitros EDTA para evitar a coagulação. Em seguida, perfunde o animal por quatro minutos com 15 a 20 mililitros de PBS mais EDTA.
Após a perfusão completa, o cérebro e o fígado aparecerão branqueados garantindo que as bactérias remanescentes sejam dos órgãos colhidos e não do sangue circulante. Após a perfusão, transfira cuidadosamente os órgãos de interesse para tubos cônicos individuais de 15 mililitros contendo cinco mililitros de PBS estéreis de quatro graus Celsius por tubo. Para colher o cérebro após a decapitação, use uma tesoura para cortar a pele do couro cabeludo pela linha média entre os olhos, mantendo as pontas pressionadas contra o crânio para aparar qualquer excesso de tecido conforme necessário.
Insira suavemente uma ponta da tesoura no foie magnum e corte lateralmente no crânio de ambos os lados. Corte cuidadosamente o crânio entre os olhos pela linha média do crânio, tomando o cuidado de aplicar pressão lateral e evitar perturbação do cérebro. Usando fórceps, abra o crânio para expor o cérebro e coloque uma espátula entre a parte inferior do cérebro e a base do crânio para transferir cuidadosamente o cérebro para um tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de quatro graus Celsius PBS.
Em um armário de biossegurança, insira a ponta e execute um homogeneizador de tecido por 10 segundos em alvejante sequencial de 5%, água estéril, 75% etanol e soluções de água estéril em tubos cônicos separados de 15 mililitros. Quando a ponta estiver completamente esterilizada, homogeneize o cérebro infectado em seu tubo. Quando não restam fragmentos de tecido visíveis, reesterirei a ponta para evitar a transferência bacteriana para a próxima amostra de órgão e homogeneizar o próximo órgão.
Quando todos os órgãos tiverem sido homogeneizados, preparem diluições seriais de cada órgão homogeneizado em PBS estéril e emplaquem as diluições nas placas de ágar de infusão cérebro-coração. Em seguida, incubar as culturas de diluição homogeneate a 37 graus Celsius durante a noite e contar o número de colônias em cada placa para determinar o número total de bactérias por órgão ou mililitro de sangue. O cálculo das cargas bacterianas nos órgãos de camundongos infectados por L.monocytogenes como apenas demonstrado sugere que a perfusão pós-infecção não altera significativamente a carga bacteriana no sangue ou órgãos de camundongos infectados que foram examinados neste estudo representativo.
Após este procedimento, os órgãos infectados por listeria monocytogenes podem ser processados para análises adicionais, como o processamento histopatológico, para responder a perguntas adicionais sobre a infiltração de células inflamatórias em órgãos de camundongos infectados em comparação com animais de controle não infectados. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar para evitar perturbação do cérebro e manter o mínimo contato entre a tesoura e o tecido cerebral.
