Neisseria meningitidis é uma das causas mais comuns de sepse e meningite entre a população humana em todo o mundo, e a bactéria é restrita ao hospedeiro humano. Neste protocolo experimental, descreveremos o procedimento personalizado para a indução de meningite meningocócica em um modelo de camundongo baseado na inoculação intracisternal de bactérias. Este modelo murino reproduziu os eventos patológicos característicos da meningite meningocócica como uma doença humana grave.
Assim, representa uma ferramenta útil para avaliar a interação hospedeiro-patógeno e analisar o mecanismo patogenético responsável por esta doença letal. O modelo de infecção poderia ser útil não apenas para avaliar a estratégia terapêutica inovadora para evitar a replicação de bactérias diretamente no CSF, mas também para analisar a eficácia de uma possível imunoterapia passiva contra patógenos humanos. A técnica requer a fase de treinamento para garantir o sucesso não só do inoculum intracisternal, mas mais em geral a indução da doença.
Os procedimentos serão Roberta Colicchio e Chiara Pagliuca como pesquisadoras, e Elena Scaglione como doutoranda, todas pelo meu laboratório. Para começar, escolha uma única colônia de uma cultura fresca de meningite Neisseria na placa de ágar gonocócica suplementada com suplemento de 1%polibitox e inoculada em 10 mililitros gc caldo. Todos os procedimentos que envolvam o uso de meningococci devem ser feitos sob um armário de cubos de biosegurança de fluxo laminar.
Cresça a bactéria a 37 graus Celsius em uma incubadora de shake orbital a 220 RPM e continue verificando a densidade óptica da cultura em diferentes pontos de tempo com um espectrofotômetro. Cresça a cultura até chegar a OD600 de 0,7 correspondente à fase exponencial inicial. Uma vez obtida essa densidade óptica, faça estoques congelados adicionando 10% de glicerol e distribuindo um mililitro da cultura nos frascos de criogeno.
Armazene os frascos a 80 graus Celsius até o uso. Antes da infecção, descongele bactérias congeladas à temperatura ambiente, em seguida, transfira para um tubo de centrífuga em centrífuga por 15 minutos a 1500xG Remova o supernascimento e suspenda novamente em um mililitro de caldo GC fresco contendo cinco miligramas por quilograma de dextran de ferro. Antes de iniciar o experimento, pese os animais e avalie sua temperatura corporal.
Raspe o animal do pescoço para baixo e desinfete o abdômen com 70% de etanol. Aproximadamente 2 horas antes da infecção, usando uma agulha calibre 25, injete dextran de ferro intraperitonealmente no quadrante inferior direito do abdômen. Após anestesiar o animal, verifique a profundidade da anestesia confirmando a ausência de resposta à dor ao beliscar o dedo do pé.
Depois de colocar o rato no gabinete de fluxo laminar posicione-o em decúbito severo e estique cuidadosamente os membros e a coluna cervical para manter a coluna vertebral em uma posição reta. Para manter uma suspensão bacteriana consistente, misture-a suavemente antes de carregá-la em uma seringa com agulha de calibre 30 de oito milímetros. Desinfete a cabeça com 70% de etanol.
Coloque o animal em recumbência lateral, puxe as orelhas para fora do caminho e flexione o pescoço moderadamente. Certifique-se de que a linha média do pescoço e da cabeça estão em posição perfeitamente paralela à parte superior da mesa. Em seguida, toque nas asas atlas, certificando-se de que elas se sobrepõem, e sinta o recuo natural na linha média onde a agulha é mais provável de entrar no orifício occipital.
Encha uma seringa com uma agulha calibre 30 de 8 milímetros com a dose bacteriana sub-letal estabelecida de meningococci ou dextran de ferro complementado GC Caldo como controle em um volume total de 10 microliters. Use a agulha para identificar o ponto de injeção e, em seguida, injete o conteúdo da seringa na cisterna magna dos camundongos através de um orifício de rebarba occipital. Descarte a seringa e a agulha com segurança após a injeção.
Coloque o animal na gaiola sob um armário de fluxo laminar. Aguarde o despertar e a recuperação completa do movimento e prossiga para a sobrevivência animal nos animais infectados, conforme descrito no protocolo. Depois de anestesiar o rato, desinfete o baú com 70% de etanol.
Usando uma agulha calibre 25, retire de 600 a 700 microlitadores de sangue por punção cardíaca da cavidade torácica. Colete o sangue em um tubo contendo 3,8% de citrato de sódio e armazene a 80 graus Celsius para a avaliação posterior da contagem de células bacterianas viáveis. Coloque o rato eutanizado na posição supina.
Usando tesouras e fórceps cortou a pele ao longo do plano sagital do corpo. Com pinos, conserte a pele com a pele nas laterais do corpo. Use uma tesoura afiada para cortar a membrana peritoneal.
Em seguida, com tesouras e fórceps descartáveis, extirpar os órgãos, como baço e fígado, e colocar cada um em uma placa de Petri estéril separada com um mililitro de Caldo GC suplementado com 10% de glicerol. Usando um êmbolo de uma seringa de cinco milímetros, homogeneize os órgãos mecanicamente à temperatura ambiente por cerca de dois a três minutos até que a suspensão unicelular seja formada e transfira-a para um frasco criogênico escurdente. Coloque o tubo imediatamente no gelo seco.
Faça placas de ágar GC com antibióticos e seque-as antes de usar a 37 graus Celsius por duas a três horas. Prepare 10 diluições seriais completas das amostras em Caldo GC de cada tecido homogeneizado. Emplaque-os em placas de ágar GC e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Com 70% de etanol, desinfete a cabeça de um rato eutanizado. Usando uma pequena tesoura cirúrgica e uma fórceps de aço de ponta fina, ressecção da pele e da pele da cabeça removida, em seguida, prossiga em direção ao topo do crânio, a fim de ver claramente as suturas e orientar a abertura do crânio. Para abrir o crânio, insira a ponta da tesoura minúscula através do foramen magnum.
Corte em direção ao centro do crânio e através da linha média do osso parietal para o lado oposto do crânio e corte suavemente ao longo do membro lateral da sutura lambdoid. Usando fórceps finos, começando pelo canto parietal posterior, levante o crânio e puxe-o diagonalmente para cima para descobrir o cérebro, certificando-se de que o tecido cerebral não está preso a nenhum osso da cabeça quando o crânio é levantado. Use fórceps descartáveis para remover qualquer tecido conjuntivo entre o crânio e o cérebro e não permita que o tecido cerebral seque.
Use fórceps descartáveis para colocar imediatamente o cérebro em uma placa de Petri com um mililitro de caldo GC suplementado com 10% de glicerol. Use o êmbolo de uma seringa de cinco mililitros para homogeneizar o cérebro mecanicamente à temperatura ambiente por cerca de dois a três minutos até que uma suspensão unicelular seja formada. Transfira a suspensão para um tubo estéril de 2 mililitros e armazene a 80 graus Celsius para a avaliação posterior da contagem de células bacterianas viáveis.
Foram avaliadas a sobrevivência de camundongos infectados com 93/4286 cepas de Neisseria meningitidis defeituosas do tipo selvagem ou cssA defeituosas. A dose letal mediana para a cepa do tipo selvagem correspondeu ao desafio meningocócica de 10 a 4ª UFC. Considerando que a taxa de mortalidade de 10 a 5ª UFC foi igual a 83,4% e 100% com 10 à 5ª dose da UFC.
Para obter a dose letal mediana para a cepa mutante defeituosa cssA, foi necessária uma dose de 10 a 8ª UFC e uma quantidade 1000 dobras maior do que a cepa do tipo selvagem. Após a injeção, houve um rápido aumento de bactérias do tipo selvagem no tecido cerebral atingindo o pico em torno de 24 horas após a infecção. No cérebro de camundongos infectados com a cepa mutante, as contagens viáveis caíram progressivamente ao longo do tempo.
Além disso, 33,3% dos camundongos infectados mutantes apresentaram folga bacteriana do local da infecção, ao contrário de animais infectados do tipo selvagem. 48 horas após a infecção, o mutante defeituoso do CSSA foi completamente limpo em baço e fígado, enquanto os animais infectados com a cepa selvagem apresentaram uma infecção persistente. O método experimental descrito poderia ser útil para analisar danos cerebrais associados a esta doença letal, por sua avaliação patológica, como imunohistoquímica, imunofluorescência e análise de sangramento cerebral.
