Este trabalho foi financiado por uma doação da BSF EUA-Israel para BS e EDSBS é um titular da cátedra Hilda e Cecil Lewis em Genética Molecular.

NOTA: Os procedimentos que envolvem seres animais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional (IACUC) no Instituto de Ciência Weizmann. Preparação 1 Amostra <ol><li> Isolamento de ácinos pancreáticos <ol><li> Prepare 300 ml de doce de bicarbonato de Krebs-Ringer HEPES (KRBH) médio antes de começar. Misturar NaCl 140 mM, KCl 4,7 mM, 1,16 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, 11 mM de glucose, 10 mM de HEPES. Adicionar a albumina de soro bovino (BSA) e 0,1 mg / ml de inibidor de tripsina de soja (STI) (meio de ressuspensão). Prepare 5-10 ml de meio de ressuspensão suplementados com colagenase (~ 0,75 mg / ml) (meio de digestão). </li><li> Oxigenar o meio KRB para ~ 30 min. Adicionar BSA após oxigenação para evitar formação de bolhas. Traga a ressuspensão e digestão médiuns a 37 ° C. NOTA: Oxigenante a forma reduz a mortalidade celular e melhora a capacidade de resposta de secreção. O efeito de oxigenação é aparente pelo menos durante 6 horas. </li><li&gt; Sacrifício o mouse por deslocamento cervical ou CO 2 asfixia, de acordo com as orientações de cuidados de animais institucionais. Colocar o animal sacrificado em sua parte traseira, anexá-lo a um bloco de dissecção e limpar a superfície abdominal com etanol. NOTA: Para evitar a contaminação, autoclave os instrumentos de dissecação e da água utilizada para médias KRBH antes do uso. Filtre KRBH meio através de um filtro de 0,2 um. Antes da excisão do pâncreas lavar os instrumentos de dissecação, com 70% de etanol e realização da dissecção em uma bancada limpa. Realizar infecções virais em nível 3 gabinete bio-segurança. Adicione antibióticos para o O / N meio de cultura (ver secção 4). </li></ol></li><li> Excisão do pâncreas murino <ol><li> Incisão amplamente a pele abdominal e camada subcutânea. Identificar o fígado, estômago, intestino, pâncreas e baço (Figura 1). NOTA: Nas etapas seguintes, lidar com o tecido pancreático suavemente e evitar a aplicação de forc mecânico excessivoe para evitar a auto-digestão da morte de células e tecidos. </li><li> Usando duas pinças sem corte, retire o intestino delgado. Iniciar a extremidade proximal do intestino pequeno, perto da saída do estômago. Separa-se do pâncreas a partir do intestino e retê-la no interior da cavidade do corpo. Depois de chegar ao intestino grosso, observe um tecido conjuntivo rosa / branco. Não confundir com o pâncreas. </li><li> Limpe o máximo de tecido pancreático quanto possível, sem coleta de tecido adiposo ou conjuntivo. Remover o pâncreas destacando-o a partir do baço e do estômago e cortando os vasos sanguíneos abdominais por baixo dele (Figura 1A-C). Observação: Uma vez que o rendimento de ácinos pancreáticos a partir de um único animal é elevada, pode abster-se da recolha de todo o tecido do pâncreas, a fim de evitar a recolha de outros tecidos. </li></ol></li><li> Digestão de colagenase <ol><li> Lavar os pâncreas algumas vezes em meio de ressuspensão aquecidas a 37 ° C e remover as partes restantes do não-pancreáticatecidos. Imergir os pâncreas ~ 5 ml de meio de pré-digestão foi aquecida num frasco de cintilação de 20 ml. Picar o pâncreas a peças de 1-3mm. Coloque-o em um banho de água aquecida (de forma otimizada sob agitação de ~ 100 rpm). Para acelerar a digestão, pipetar o up tecido digerido e para baixo uma vez a cada poucos minutos. NOTA: A duração da digestão da colagenase depende principalmente da concentração de colagenase e da quantidade de força mecânica aplicada no tecido. Utilização de 0,75 mg / ml de colagenase durante aproximadamente 15 minutos e a pipetagem do tecido com uma pipeta de 5 ml de poliestireno com um orifício de dois milímetros cada 3-5 minutos, resultando em ácinos de 10-30 células. Após a digestão, a suspensão se turvas, contendo pedaços visíveis de tecido. Desde colagenases eficiência varia entre os diferentes tipos comerciais e lotes, determinar o tempo de digestão empiricamente. </li><li> Lavagem e filtragem <ol><li> Transferir o tecido digerido para um tubo de 50 ml e encerrar escavaçãoestion pela adição de 45 ml de meio de ressuspensão. Filtra-se a suspensão através de um grosso (~ 1 mm), malha de metal para um novo tubo. Centrifuga-se o fluxo de passagem a 100 x g durante 3 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspenderam-se os pâncreas digeridos em 50 ml de meio de ressuspensão. Filtra-se a suspensão através de uma malha de nylon de 70 ou 100 mm. Centrífuga como antes. </li><li> A fim de remover flutuante, ácinos danificado, descartar o sobrenadante e ressuspender o tecido pancreático em 3-5 ml de meio de ressuspensão. Aplicar um ml da ácinos pancreáticos em 15 ml de tubos cónicos contendo 7 ml de meio de ressuspensão. Permitir que os ácinos se contentar com 2-3 min. Recolhe-se o ácinos que se estabeleceram para o fundo do tubo com uma pipeta de 1 ml, e repetir este passo de 2 - 3 vezes. </li><li> Ver o ácinos pancreáticos sob um microscópio de luz ou de dissecação para testar a sua condição. Na Figura 2, observar a pureza de isolamento e os danos infligidos sobre as células Duriisolamento ng. Use estas ácinos imediatamente ou cultura para até 20 horas. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Amylase Secreção Assay NOTA: O ensaio de secreção de amilase serve como uma medida global para a capacidade de secreção de ácinos pancreáticos. Isto é conseguido através da recolha do meio no qual a ácinos pancreáticos foram incubados, e a determinação da actividade da amilase de o meio, geralmente, utilizando um kit comercial. <ol><li> Determinar o número de condições experimentais devem ser ouvidas (vs. por exemplo não estimulada estimulada). Use pelo menos três repetições para cada condição. Além disso, incluir um conjunto de réplicas para determinar o teor total celular amilase (amostra &quot;total&quot;) e um conjunto para a actividade de amilase da média (&quot;zero&quot; da amostra). Rotular uma placa de multi-cavidades em que o ensaio será conduzido, e dois conjuntos de microtubos para cada uma das repetições, para ser usado. NOTA: 12 ou 24 poçoss pode ser utilizado para monitorizar um e 0,5 ml de suspensões acinares, respectivamente. </li><li> Lava-se a ácinos duas vezes em 30 ml de meio de ressuspensão KRBH e incubar em meio de re-suspensão, durante 30 min a 37 ° C. Para a placa de multi-poços adicionar uma gota de 10 ul de secretagogo para atingir a concentração final adequada. </li><li> Ácinos pancreáticos responder a um gradiente de secretagogo de uma forma bifásica. As concentrações com valores de secreção óptimas são 50 - 100 pM de colecistoquinina (CCK) e 1 uM de carbacol (Figura 3A) 5. </li><li> Lave e ressuspender o ácinos em meio a ressuspensão. Certifique-se de que os ácinos são distribuídos de forma homogénea em suspensão e as alíquotas de quantidades iguais de suspensão na placa multi-poços e na dos microtubos marcado com total&#39;. Incubar a placa durante 30 minutos a 37 ° C. (De preferência, em um banho de água sob agitação suave (~ 50 min)). NOTA: O número exato de ácinos pode variar entre experiments, mas deve ser semelhante em repetições de cada experimento. Assim, precisa de alíquotas da suspensão ácinos é crítica para a comparação entre diferentes repetições e condições. </li><li> Durante a incubação, produzir o &#39;total&#39; e amostras nulas. Centrifugar os microtubos &quot;total&quot; para alguns segundos a 5000 × g e remover 50 ul do sobrenadante para &#39;microtubos zero&#39; rotulados e colocá-los a 4 ° C. Lise ácinos nas amostras &quot;totais&quot; pela adição de Triton X-100 para os microtubos para atingir uma concentração final de 1%. Vortex os microtubos vigorosamente. NOTA: Aliquote o &#39;total&#39; replica semelhante às repetições do experimento. Lise dos ácinos, leva à liberação do conteúdo total de amilase. Em alternativa, recolher os ácinos em cada condição e lise no fim da experiência, para determinar o conteúdo celular de cada replicado. </li><li> Recolha a maior parte da suspensão de i acinarnto do primeiro conjunto de microtubos pré-rotulados. Centrifugar os microtubos por alguns segundos a 5.000 × g. Transferir o sobrenadante para o segundo conjunto de microtubos pré-rotulados. </li><li> Ensaiar o sobrenadante para a actividade de amilase com um kit comercial. Calcula-se a percentagem da amilase secretada. NOTA: É fundamental ler a atividade da amilase na sua gama linear. Apresentar percentual de amilase secretada como o percentual da amilase liberado do conteúdo total inicial. Subtrair o nível de fundo amilase do meio de cada triplicado e dividi-lo pelo conteúdo total inicial semelhante normalizado. </li></ol> 3 Imagens ao vivo da secreção pancreática Secreção de ácinos pancreáticos podem ser monitorados diretamente por imagens ao vivo. Usando vários corantes fluorescentes e sensores, imagens em tempo real permite caracterizar a secreção de uma resolução sub-celular. <ol><li> Prepare médio ressuspensão recém oxigenado como in passo 1.1 e trazê-lo a 37 ° C. Defina o microscópio, e se equipado com um controlador de temperatura, ajuste-a a 37 ° C. </li><li> Lave as células acinares em 30 ml de meio de ressuspensão e colocá-los num vidro ou plástico deslizante. Nota: Se corantes lipofílicos estão a ser utilizados para rotular Para membrana plasmática marcada com corantes lipofílicos, manchar a ácinos por não mais de 5 min para evitar a rotulagem de membranas internas por endocitose. Ao longo do trabalho, lidar com os ácinos suavemente e evitar pipetagem excessiva. </li><li> Uma vez no microscópio, imagem ácinos cuja morfologia é clara, e evitar a imagem de ácinos que apresentam bolhas basolateral ou vacúolos intracelulares. Adicionar gota secretagogo sensato ou usando uma câmara de perfusão, durante ou imediatamente antes do início da imagiologia. Nota: Um lentes de alta ampliação com altas aberturas numéricas (por exemplo × 63 / 1.4 ou × 100 / 1,4) é recomendado para observar estruturas subcelulares. </li></ol> 4. O / N Cultura de pâncreas Acini (técnica de cultura celular Alternate) NOTA: O / N cultura é muitas vezes usado para a infecção pelo vírus adeno. A infecção é realizada a 10 6 -10 7 pfu / ml durante 9-16 horas antes do exame. <ol><li> Cultura ácinos pancreáticos por até 20 horas. Ácinos ressuspensos obtidos a partir de um único pâncreas em 25 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com soro fetal de vitelo (FCS) (5%),-piruvato de sódio (1%), antibióticos (1%), L-glutamina (0,5%), BSA (10 mg / ml) e STI (0,2 mg / ml), e divididas em cinco placas de 10 centímetros. Infect ácinos com vírus no nível 3 do armário de bio-segurança. </li><li> Incubadas ácinos pancreáticos a 37 ° C em um ar de 5% de CO 2 umidificado. Permitir ácinos se recuperar em meio a ressuspensão oxigenado para 30 min antes do exame posterior 3,8. </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Rho+and+Rac+in+secretagogue-induced+amylase+release+by+pancreatic+acini.">A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).</li><li>Palade, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+aspects+of+the+process+of+protein+synthesis.">Intracellular aspects of the process of protein synthesis.</a> Science. 189, 867 (1975).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Petersen, H., Grossman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+secretion+in+anesthetized+and+conscious+rats.">Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats.</a> The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+the+actin+cytoskeleton+during+regulated+exocytosis.">Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

Além disso a cultura ex vivo, configurações alternativas para o estudo da secreção exócrina incluem microscopia intravital e medição de fluidos do ducto pancreático. Microscopia intravital foi mostrado para operar bem na rato glândulas salivares 10. Este método pode gravar a secreção em tempo real no animal intacto, mas é limitada na sua resolução e por os meios para a manipulação do tecido exócrino. Avaliando a secreção através da recolha de fluidos do ducto pancreático foi co...

O pâncreas exócrino constitui a maior parte da massa do pâncreas dos mamíferos e é dedicado à produção e secreção de enzimas digestivas 1. A unidade funcional do pâncreas exócrino, o ácino, é um aglomerado de células epiteliais que formam partes e um lúmen conjunta. Após a estimulação hormonal ou neuronal, as vesículas cheias com enzimas são transportados para a superfície celular apical, fusível com ele e expelir o seu conteúdo para dentro do lúmen 1-3. As enzimas secretadas são, em seguida, drenada por um conjunto de condutas de coalescência para o intestino delgado, onde eles catalisam a quebra dos alimentos em nutrientes. Este vídeo demonstra como ácinos intactos são isolados a partir de todo o pâncreas, e como a sua capacidade de secreção pode ser avaliada. Usando esta configuração, a secreção pancreática é quantificada através da medição da quantidade relativa de amilase que foi lançado após a estimulação. Alternativamente, a secreção pode ser trabalhada ao vivo através da utilização de diferentessensores e corantes. A configuração ex vivo de ácinos pancreáticos é vantajoso uma vez que ácinos isolado, que retêm muitas das características dos pâncreas intacto, pode ser manipulado mais facilmente e monitorizados em que o animal inteiro 4-6. Esta configuração foi originalmente desenvolvido no final dos anos 1970 e foi estendido desde para o estudo de vários tecidos exócrinas, como a saliva e glândulas mamárias 3-7. Notavelmente, que permite o estudo da secreção com uma interferência mínima com as organizações celulares complexos destes epitélios polarizados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ICR mice</td>
			<td style="width:115px;">Harlan</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:203px;">Any strain will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>Can substitude for KRB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Fraction V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon mesh</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>70-100&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylase infinity reagent&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TR25421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCK</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM4-64</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>F34653</td>
			<td>Diluted to 16&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20mL scintillation vial</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeltaVision system&#160;</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

Células acinares do pâncreas produzir e secretar enzimas digestivas. Estas células são organizadas como um conjunto que forma e partilha uma luz comum. Este trabalho demonstra como a capacidade de secreção dessas células pode ser avaliada por cultura de isolado ácinos. A configuração é vantajosa, uma vez ácinos isolado, que retêm muitas das características do pâncreas exócrino intacto pode ser manipulado e monitorizado mais facilmente do que em todo o animal. Isolamento adequado dos ácinos pancreáticos é um requisito essencial para que a cultura ex vivo irá representar a natureza in vivo dos ácinos. O protocolo demonstra como isolar intacta ácinos do pâncreas do rato. Posteriormente, dois métodos complementares para avaliar a secreção pancreática são apresentados. O ensaio de secreção de amilase serve como uma medida global, enquanto a imagem directa da secreção pancreática permite a caracterização de secreção com uma resolução sub-celular. Coletivamente, as técnicas presented aqui possibilitar um largo espectro de experiências para estudar a secreção exócrina.

Ácinos do pâncreas que foram isolados correctamente exibir uma morfologia estereotipado quando vistas pela luz transmitida. Seus domínios basolateral deve aparecer redonda e sem bolhas. O domínio apical é rodeado por centenas de vesículas secretoras e aparecer de cor mais escura (Figura 2A, B). Os núcleos estão localizados basal para a área vesicular. Detritos e componentes do sistema ductal pancreático e do pâncreas endócrino, que pode ser detectada nos primeiros estádios de isolamento ác...

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Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Isolados ácinos pancreáticos manter a sua morfologia in vivo e atividade e oferecer maneiras poderosas para a monitoração e manipulação de secreção. Este trabalho demonstra como ácinos pode ser isolada a partir do pâncreas do rato, e como as suas capacidades de secreção pode ser avaliada.

Avaliando a capacidade de secreção de pâncreas Acinar Células

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.5K visualizações.  Weizmann Institute of Science.  Isolados ácinos pancreáticos manter a sua morfologia in vivo e atividade e oferecer maneiras poderosas para a monitoração e manipulação de secreção. Este trabalho demonstra como ácinos pode ser isolada a partir do pâncreas do rato, e como as suas capacidades de secreção pode ser avaliada. 

Vídeo: Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

Isolamento de células-tronco de xenoenxertos Humano do Câncer de pâncreas

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Biologia

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

Preparação de células pancreáticas acinares para Fins de cálcio Imaging, celulares Medidas ferimento e infecção adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

Função Pulmonar Fenotipagem Rato<em&gt; In Vivo</em&gt; Com a capacidade pulmonar Diffusing

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

Capacidade de diferenciação de células progenitoras de aorta humana Perivascular adiposo

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

O uso da técnica de grampo de remendo para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

Quantificando a fagocitose epitelial pigmentar da retina e o acúmulo de lipofuscina

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

Autor em destaque: Modelos aprimorados de lipofuscina e quantificação da capacidade de fagocitose do segmento externo em culturas epiteliais pigmentares da retina humana altamente polarizadas  

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

Modelos aprimorados de lipofuscina e quantificação da capacidade de fagocitose do segmento externo em culturas epiteliais pigmentares da retina humana altamente polarizadas

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...