Este é um método simples e eficaz para isolar e culminar pericítos cerebrais primários para estudo de sinalização intercelular de cálcio. A cultura celular obtida é uma população quase homogênea de pericítos, e é simples carregar os pericílitos para imagem de cálcio. Os métodos descritos aqui devem fornecer a outros pesquisadores do campo ferramentas fortes para estudar biologia pericíte, e sinalização intracelular em pericílitos in vitro.
Comece descongelando um frasco de capilares em um banho de água de 37 graus Celsius. Uma vez que os capilares tenham descongelado, transfira-os para um tubo de centrífugas com 30 mililitros de DMEM comp, e centrífugue-os por cinco minutos a 500 vezes G.Em seguida, remova o meio do tubo e suspenda novamente a paleta em 10 mililitros de DMEM comp fresco. Transfira a suspensão para um frasco T-75 revestido e permita que os capilares aderam ao fundo por quatro a seis horas em uma incubadora de 37 graus Celsius fornecida com dióxido de carbono de 10%.
Após a incubação, inspecione o frasco sob um microscópio leve. Frações de capilares devem agora ser anexadas ao fundo do frasco. No quarto dia após a semeadura dos capilares, inspecione-os sob o microscópio para garantir que eles sejam aproximadamente 60 a 70% confluentes.
Aspire o meio e lave suavemente as células com PBS. Adicione dois mililitros de trippsin-EDTA descongelados, e deixe o frasco na incubadora por um a três minutos, tirando o frasco com frequência, e observando o descolamento celular com o microscópio. Quando as células endoteliais começarem a arredondar, bata suavemente no frasco para desprezá-las.
Quando as células se separarem, pare a trippsinização adicionando 10 mililitros de DMEM comp ao frasco. Lave o frasco algumas vezes com o meio, e aspire a suspensão da célula endotelial, que agora pode ser usada para outros fins. Adicione 10 mililitros de DMEM comp ao frasco e verifique-o sob o microscópio de luz para garantir que os pericítos ainda estejam presentes e ligados ao fundo.
Então, coloque o frasco de volta na incubadora para permitir que a cultura enriquecida com pericítos cresça. Para semear pericítes em placas revestidas de 96 poços, desvinculá-los como descrito no manuscrito do texto. Aspire o meio, tomando cuidado para não perturbar a pelota celular, e suspenda a pelota em um mililitro de DMEM comp fresco.
Conte as células usando uma câmara de contagem, em seguida, calcule o volume de suspensão que deve ser adicionado a cada poço a sementes 10.000 células por poço. Adicione a suspensão celular e adicione DMEM comp suficiente às células para alcançar um volume total de 200 microliters por poço. Quando estiver pronto para carregar os pericítes com corante indicador de cálcio Fura-2 AM, retire a placa de 96 poços com as células da incubadora e aspire o meio dos poços.
Lave as células duas vezes com tampão de ensaio e adicione 100 microliters de solução de carregamento a cada poço. Enrole a placa com papel alumínio para evitar branqueamento fotográfico e incuba-o por 45 minutos com 30 RPM tremendo à temperatura ambiente. Após a incubação, aspire o tampão de carga e lave as células com o tampão de ensaio duas vezes.
Adicione 100 microliters frescos ao tampão de ensaio, e deixe as células incubarem por 30 minutos. Após a incubação, ajuste a temperatura do leitor de placas para 37 graus Celsius e transfira a placa de 96 poços com células para a posição da placa de amostra, em seguida, coloque a placa de reagente com agonista na posição da placa de reagente. Comece medindo o carregamento das células para garantir o carregamento igual de Fura-2 AM em todos os poços, em seguida, realize as medições com comprimento de onda de fluorescência excitação em 340 a 380 nanômetros, e o comprimento de onda de emissão em 510 nanômetros.
Adicione 50 microliters de agonista, a uma velocidade de 150 microliters por segundo, desde a placa de reagente até cada poço com células. Coloque uma tampa na câmara da cela e aperte-a para evitar vazamentos. Adicione o DMEM comp e o volume calculado de suspensão celular em cada câmara, para um volume final de 500 microliters.
Incubar as câmaras celulares a 37 graus Celsius e 10% dióxido de carbono por seis dias, ou até confluente. Uma vez que as células são confluentes, tire as câmaras celulares da incubadora e aspire o meio. Lave as células duas vezes com tampão de ensaio e adicione 500 microliters de tampão de carga a cada câmara e, em seguida, incuba-as à temperatura ambiente por 45 minutos.
Após a incubação, aspire o tampão de carga e lave as células duas vezes com tampão de ensaio, em seguida, adicione 500 microliters de tampão de ensaio fresco em cada câmara e incuba-as por mais 30 minutos à temperatura ambiente, para permitir o decote do éster AM. Substitua o buffer por 500 microlitros de tampão de ensaio fresco e prossiga com imagens ao vivo em um microscópio confocal. Monte a câmara celular no palco do microscópio o mais suavemente possível para evitar a perturbação das células.
Ajuste o comprimento de onda de excitação em 488 nanômetros, emissão em 515 nanômetros, aquisição de imagem sequencial de dois minutos com cinco intervalos de segundo, e um tamanho de imagem x, y de 512 por 512 pixels. Adicione 300 microliters de 100 mililitros ATP à câmara celular e inicie a aquisição de imagens. Este protocolo foi usado para purificar pericílitos de capilares cerebrais bovinos.
O crescimento celular dos capilares semeados foi imageado ao longo de nove dias. Os capilares estavam totalmente ligados ao frasco no primeiro dia, e no segundo dia, o broto endotelial era visível. Após quatro dias, a expansão celular foi distinta, e as células endoteliais foram removidas através da trippsinização.
Remanescentes dos capilares estavam presentes após a trippsinização, mas desapareceram do frasco nos dias seguintes. Após a remoção da camada endotelial, os pericítos foram autorizados a crescer até a confluência. No nono dia, os pericílitos atingiram aproximadamente 80% de confluência, e formaram ilhas.
A adição de ATP aos pericytes carregados fura-2 resultou em um aumento nos níveis de cálcio citosósico. A resposta ocorreu imediatamente após a adição de ATP aos pericytes, e diminuiu lentamente durante o período de tempo medido. A resposta ao cálcio também foi medida com imagens confocal em tempo real.
A fluorescência da linha de base foi medida, então a ATP foi adicionada em 64 segundos, e uma forte resposta intracelular de cálcio foi evidente. Logo depois, o cálcio citosomico compartimentalizado nas células, e uma redução na área celular era visível. Em 300 segundos, a área celular reduziu fortemente, e a fluorescência diminuiu quase para os níveis de linha de base.
Este método tem sido usado para obter as primeiras medidas intracelulares de cálcio a partir de pericytes capilares cerebrais primários, demonstrando que os pericítos são estimulados via ATP, e são capazes de contrair in vitro.
