Aqui apresentamos os protocolos para a preparação de fatias cerebrais agudas contendo o núcleo geniculado lateral e a investigação eletrofisiológica da função geniculada de retina e sinapse geniculada cortical. Axônios de células gânglios de retina entram no núcleo geniculado lateral longe das entradas corticais. Isso permite que as estimulações separadas de sinapses geniculadas de retina e geniculato cortical, que possuem propriedades funcionais muito diferentes.
Para iniciar este procedimento, prepare duas câmaras de fatia, uma cheia com 100 mililitros da solução de dissecção e outra com 100 mililitros de solução de gravação. Coloque os dois béquers em um banho de água a 37 graus Celsius, e borbulhe as soluções com carbogen por pelo menos 15 minutos antes da dissecação. Em seguida, encha um béquer de plástico com 250 mililitros de solução de dissecção quase gelada, e borbulhe-o com carbogen por pelo menos 15 minutos antes do uso.
Em seguida, encha uma placa de Petri de plástico com a solução de dissecção fria para dissecção cerebral. Coloque um pedaço de papel filtro na tampa da placa de Petri e encha-o com uma pequena quantidade de solução de dissecção. Posteriormente esfrie a câmara de dissecção do vibratome.
Corte a pele da cabeça de caudal para nasal, e mantenha-a aberta com os dedos para expor o crânio. Para obter o cérebro, primeiro corte o crânio ao longo da linha média posterior/anterior. Em seguida, corte mais duas vezes através da sutura coronal e sutura lambdoide.
Remova o crânio entre a sutura coronal e a sutura lambdoid para expor o cerebrum. Corte a lâmpada olfativa e separe o cérebro do cérebro médio com uma lâmina fina. Remova o cérebro do crânio com uma espátula fina, e coloque-o em um papel filtro na tampa da placa de Petri.
Para preservar a integridade das entradas sensoriais e corticais ao núcleo geniculado lateral dorsal na fatia cerebral, separe os dois hemisférios com um corte parasagittal em um ângulo de três a cinco graus. Depois seque os planos laterais medial dos dois hemisférios colocando-os em um papel filtro. Em seguida, cole-os no estágio de corte com um ângulo de 10 a 25 graus do plano horizontal.
Coloque o palco no centro da bandeja de tampão de metal e despeje suavemente o resto da solução de dissecção gelada na bandeja de tampão. Execute este passo com cuidado, já que derramar muito forte pode remover o cérebro colado. Em seguida, mantenha a bandeja de tampão na bandeja cheia de gelo para manter a baixa temperatura durante a dissecção.
Seção 250-micrômetros fatias com uma lâmina de barbear a uma velocidade de 0,1 milímetro por segundo e uma amplitude de um milímetro. Transfira as fatias para a câmara de retenção cheia de solução de dissecção oxigenada a 34 graus Celsius por cerca de 30 minutos e, em seguida, permita que as fatias se recuperem na solução de gravação a 34 graus Celsius por mais 30 minutos. Após a recuperação, remova a câmara de corte do banho de água e mantenha as fatias à temperatura ambiente até ser usada em experimentos.
Neste procedimento, puxe as pipetas de gravação usando capilares de vidro borossilicato e um puxador de filamento. Em seguida, puxe as pipetas estimulantes usando o mesmo protocolo, mas quebre a ponta ligeiramente depois de puxar para aumentar o diâmetro. Posteriormente, preencha as pipetas de gravação com solução intracelular e biocittina, e encha as pipetas estimulantes com solução de gravação.
Em seguida, coloque as fatias na câmara de gravação e perfunda-as continuamente com a solução de gravação oxigenada à temperatura ambiente. Visualize as fatias com um microscópio vertical equipado com microscopia de vídeo IR-DIC. Verifique todas as fatias e selecione as que exibem os tratos ópticos intactos.
Coloque a pipeta de estimulação na fatia antes de remendar a célula com uma pipeta de gravação. Para investigar as sinapses geniculadas da retina, coloque a pipeta estimulante diretamente no trato óptico onde as fibras de axônio das células gânglios da retina são empacotados. Para analisar as sinapses geniculadas corticais, coloque o eletrodo estimulante no núcleo reticularis thalami, que é rostroventrally adjacente ao núcleo geniculado lateral dorsal.
Uma vez que a pipeta de gravação esteja imersa na solução de gravação, aplique um passo de cinco milivoltes para monitorar a resistência da pipeta. Defina o potencial de retenção para zero milvolt, e cancele o potencial de deslocamento para que a corrente de retenção seja zero picoampere. Aproxime-se da célula com uma pipeta de gravação enquanto aplica pressão positiva.
Quando a pipeta estiver em contato direto com a membrana celular, libere a pressão positiva e coloque o potencial de retenção para menos 70 milvolts. Em seguida, aplique uma leve pressão negativa para permitir que a membrana celular se anexe à pipeta de vidro de tal forma que uma vedação gigaohm se forme. Compense a capacitância da pipeta e abra a célula aplicando pulsos de pressão negativos.
Para investigar a função sináptica, aplique pulsos de corrente de 0,1 milissegundos através da pipeta de estimulação. Monitore a resistência da série continuamente aplicando um passo de cinco milivoltos. A resistência da série pode ser estimada dividindo cinco milivolts pela amplitude máxima da corrente evocada.
Use apenas as células com uma resistência de série menor que 20 megaohms para análise. Para rotulagem de biocittina, mantenha a configuração de células inteiras por pelo menos cinco minutos para permitir a difusão da biocittina nos dendritos distais. Após a gravação, remova suavemente a pipeta da célula para que a soma não seja destruída.
Prepare uma placa de cultura celular de 24 poços. Encha cada poço com 300 microliters de 4%PFA. Tome cuidado para não contaminar nada com PFA que estará em contato com as fatias a serem registradas.
Transfira as fatias da câmara de gravação para a placa contendo PFA com uma pipeta de borracha e fixe-as durante a noite. No dia seguinte, substitua o PFA por PBS. Mantenha as fatias em PBS a quatro graus Celsius para processamento futuro.
Para manchar as células, lave as fatias com PBS fresco três vezes. Bloqueie locais de ligação não específicos incubando as fatias na solução de bloqueio por duas horas à temperatura ambiente em um agitador orbital. Em seguida, descarte a solução de bloqueio e incuba as fatias com a Alexa 568 diluída na solução de bloqueio a quatro graus Celsius durante a noite em um agitador orbital.
No dia seguinte, descarte a solução de anticorpos e lave as fatias três vezes com PBS por 10 minutos cada uma em temperatura ambiente em um agitador orbital. Em seguida, lave as fatias com água da torneira antes de montar. Coloque as fatias de um mouse em um slide de vidro.
Certifique-se de que as células manchadas estão presentes na superfície superior das fatias. Absorva a água ao redor das fatias com tecidos e deixe as fatias secarem por aproximadamente 15 minutos. Em seguida, aplique duas gotas de meio de montagem em cada fatia e monte um deslizamento de tampa no slide sem produzir bolhas de ar.
Armazene as fatias rotuladas a quatro graus Celsius depois de vê-las com um microscópio confocal. Esta imagem IR-DIC mostra a soma de um neurônio de relé de núcleo geniculado lateral dorsal com uma ponta da pipeta de remendo. A coloração de biocittina nos permite ter uma visão do neurônio registrado.
Diferente dos interneurônios, que têm morfologia bipolar, os neurônios de relé têm arbóreos dendráticos multipolares contendo mais de três dendritos primários. A reconstrução tridimensional de um neurônio de relé rotulado por biocittina foi então gerada, o que mostra uma arquitetura dendrítica radialmente simétrica. Preservar os insumos gênicos de retina e os insumos cortical geniculados nas mesmas fatias cerebrais são mais importantes neste protocolo.
Após esse procedimento, podemos, por exemplo, também investigar os inibidores do núcleo reticularis thalami nos neurônios do núcleo geniculado lateral dorsal. Lembre-se de usar luvas ao fixar as fatias cerebrais com PFA, pois a PFA é perigosa.
