Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Australiano sob Linkage Projeto concessão LP120100264.

1. Cultura de neurônios do gânglio espiral <ol><li> Esterilizar redonda pequena (por exemplo, 10 mm de diâmetro) lamínulas de vidro e uma pinça curva em uma autoclave. Transferir as lamelas esterilizadas em poços individuais de uma solução estéril de 4 anéis placa de petri de 35 milímetros ou placa de 4 poços, utilizando as pinças esterilizadas. Aplicar 150 ul de poli-L-ornitina (500 ug / ml) e laminina rato (0,01 mg / ml) para a superfície superior da lamela e colocar numa incubadora (37 ° C) durante até 48 horas. Assegurar que as lamelas não flutuem a partir do fundo do poço. </li><li> Preparar 50 ml de meio Neurobasal estéreis (NBM) de cada cultura neural: 47,5 ml neurobasal A, 0,5 ml de N 2 suplemento, 1 ml de suplemento de B27, de 0,5 ml de L-glutamina, e 0,5 ml de penicilina-estreptomicina. Nota: Os suplementos podem ser congelado, armazenado a -20 ° C e adicionado ao meio no dia necessária. </li><li> Dissociar neurônios do gânglio espiral de pós-natais dias 4-7 filhotes de rato, como descrito anteriormente 20,21, nosção enzimáticas (0,025% de tripsina e 0.001% de DNase I) e técnicas mecânicas. Consulte Whitlon et al. 22 e Vieira et al. 23 para os procedimentos detalhados de neurônios do gânglio espiral da cultura, ou Parker et al. 24 para uma demonstração de isolamento modiolus. </li><li> Aspirar qualquer solução poly-L-ornithine/laminin restante das lamelas e lave brevemente com NBM. </li><li> Adicionar 150-200 ul da suspensão de neurónios do gânglio espiral dissociado para as lamelas e colocar numa incubadora (37 ° C, 10% de CO 2). Nota: até 20 lamelas pode ser preparado a partir de uma ninhada média de oito filhotes de ratos. </li><li> Quatro horas depois do chapeamento neurónios, aspirar a solução para remover os detritos celulares e substituir com 150-200 ul aquecido NBM fresco. Nota: A mídia pode exigir a reposição diária para evitar a desidratação. </li><li> Retorno lamelas à incubadora até ser necessário para registos electrofisiolicos. Nota: espiral dissociadaculturas de neurónios do gânglio pode ser utilizado para experiências electrofisiológicas e quatro horas após a dissociação e por até dois dias depois. Tempo in vitro, deve ser tido em conta durante a análise dos resultados. Reabastecer NBM cada 24-48 horas. </li></ol> 2. Preparação para o patch Recordings Grampo <ol><li> Preparar soluções <ol><li> Solução intracelular (micropipeta): 115 mM de K-gluconato, 7 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,05 mM de EGTA, 2 mM de Na 2 ATP, 2 mM de MgATP, 0,5 mM Na 2 GTP (ajustar para pH 7,3 com KOH, ajustar a 295 mOsmol / kg, com sacarose). Filtrar a solução através de um filtro estéril (0,2 um) e dividem-se em alíquotas de 200 ul de ser armazenado a -20 ° C até ao dia da gravação. </li><li> Solução extracelular (banho): NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 10 mM, glucose 10 mM (ajustado a pH 7,4 com NaOH; ajustar a 300-310 mOsmol / kg, com sacarose) . Esta solução é feita no dia da gravação. </li></ol></li><li> Prepare gravação micropipetas com uma resistência de 2-6 mohms. Nós usamos um laser de CO 2 extrator (P-2000; Sutter Instruments) e vidro de borosilicato (1,0 mm de diâmetro externo, 0,58 milímetros de diâmetro interno e 75 mm de comprimento). </li><li> Prepare o laser. Este protocolo destina-se a utilização com um laser de fibra de acoplamento, tal como a 1870 nm, a partir de Infravermelhos neuroestimulador Optotech P / L. A fibra óptica utilizado para entrega de luz nas nossas experiências é uma fibra de sílica diâmetro 200/220 mM de núcleo / revestimento, com uma abertura numérica de 0,22 e conectores FC-PC em ambas as extremidades (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0,22). Os cordões foram cortadas ao meio para produzir duas tranças de fibras (isto é, conectorizada numa extremidade e clivada no outro). Os efeitos do diâmetro do núcleo da fibra e a abertura numérica em mudanças de temperatura induzidas a laser têm sido discutidas em detalhe por Thompson et ai 25. <ol><li> Cleave a ponta da fibra de entrega de luz, utilizando técnicas convencionaise assegurar que a ponta resultante é de alta qualidade por meio de observação com um microscópio óptico (isto é, a ponta deve ser perpendicular ao eixo da fibra e aparecem plana sobre a inspecção visual). Ligar o fornecimento de luz de fibra para a fibra de saída acoplado do laser utilizando um estímulo adequado, através do conector (por exemplo, Thorlabs ADAFC2). </li><li> Medir a potência do laser de saída da ponta clivada da fibra de entrega de luz, utilizando um instrumento adequado (por exemplo, Fieldmate Coerente com LM-3 cabeça do detector). Recomenda-se verificar a potência do laser cada vez que a fibra de entrega luz é clivada ou um ajuste significativo é feito para o laser (por exemplo, o transporte de um laboratório para outro). </li><li> Insira fibra entrega a luz em uma bucha de fibra ou dispositivo equivalente e apor o mandril ao microposicionador apropriado. É importante ser capaz de determinar com precisão o ângulo θ que a fibra óptica faz com a lamela. Este anglE pode ser medido tomando uma fotografia do arranjo experimental e utilizando software de processamento de imagem (por exemplo ImageJ) para se obter o ângulo. O ângulo θ (ou intervalo de ângulos possíveis) é limitado principalmente por limitações espaciais do arranjo experimental - em particular o microscópio. Os valores típicos de θ nas nossas experiências (com base em um microscópio vertical) são cerca de 36 °, no entanto, o ângulo ideal pode diferir significativamente para configurações alternativas (por exemplo, aqueles que utilizam um microscópio invertido). </li><li> Fazer as ligações entre o laser e o sistema de aquisição de dados de patch clamp (Digidata 1440A, por exemplo, Molecular Devices), conforme mostrado na Figura 2. A saída digital a partir do sistema de aquisição de dados de patch clamp deve ser ligado ao laser através de um gerador de função externa, tornando-se possível especificar parâmetros de pulso de laser independentes do sistema de aquisição de dados. Alternativamente, esta saída pode ser conectado diretamente aoo motorista do laser (que exige a duração de pulso e taxa de repetição para ser definido pelo software de aquisição de dados). Em qualquer caso, o sinal utilizado para disparar o laser deve ser ligada de volta para uma entrada do sistema de aquisição de dados, para assegurar que a temporização e duração dos pulsos de laser pode ser registada concorrentemente com o sinal electrofisiológico. </li></ol></li></ol> 3. Remendo Recordings Grampo para investigação de INS <ol><li> Encher o contentor apropriado do sistema de perfusão com uma solução extracelular e ajustar a taxa de fluxo para proporcionar perfusão do banho a uma taxa de 1-2 ml / min. Usamos um sistema (frasco aspirador, de válvula de estrangulamento, e tubagem PE) alimentada por gravidade com um aquecedor em linha, para permitir um aquecimento rápido da solução, e uma bomba peristáltica, para remover a solução passou por sucção. </li><li> Coloque uma lamela com a cultura de células para a câmara de registo (de banho) de um microscópio vertical. Utilizando uma objetiva de imersão em água de alta ampliação (e. G. 40X) e de contraste de fase (por exemplo, contraste de interferência diferencial ou contraste gradiente Dodt), localizar visualmente os neurônios do gânglio espiral dentro da cultura. Um neurónio típico gânglio espiral é de fase brilhante, redondos e cerca de 15 um de diâmetro, com um núcleo proeminente, como mostrado na figura 1a. </li><li> Uma vez que um neurônio foi localizado, mudar para um objetivo de ampliação menor (por exemplo, 10x) e localize o neurônio alvo dentro do campo visual. </li><li> Mover o fornecimento de luz de fibra óptica em posição usando o seguinte procedimento (ou equivalente): <ol><li> Utilizar a microposicionador para mover a fibra de saída até que a ponta fica perto do neurónio alvo nos planos horizontal e vertical. A posição vertical da ponta da fibra pode ser verificada por meio de mover o objectivo cima e para baixo (a digitalização da focagem). </li><li> Retornar ao objectivo alta ampliação e posicionar a ponta da fibra óptica na sua posição destinada ao lado de tele neurônio (ver Figura 2 inset). Ao ajustar a posição vertical da fibra, é importante que o bordo inferior da fibra está assente sobre (isto é, apenas tocando) da lamela, para minimizar a incerteza na localização da fibra. O alinhamento óptimo, no plano horizontal irão depender do ângulo θ que faz com que a fibra com a lamela e o raio r da fibra. A fim de posicionar as fibras de modo que o centro do neurónio-alvo se situa ao longo do eixo da fibra, a distância horizontal entre o bordo superior da fibra e da célula alvo deve ser Δ target = r (θ Cosec - 2 sin θ), em que os valores negativos indicam que as saliências de fibras ópticas da célula. Quando o alinhamento da fibra, uma distância de alvo Δ entre a borda superior da fibra e do centro do neurónio pode ser conseguida por cerca de uma inspecção visual. No entanto alvo Δ é projetado paraservir como uma orientação aproximada só. Posicionamento da fibra de tal modo que a distância real Δ entre o bordo superior da fibra e do centro do neurónio difere de forma mensurável a partir Δ alvo (como mostrado na Figura 1) pode fornecer informações sobre o efeito de ambos deslocamento radial (ou seja, a partir do centro da feixe) e deslocamento axial (isto é, ao longo do eixo da fibra) do feixe em relação ao neurónio alvo. Por exemplo, configurando Δ ≈ 0 seria esperado um aumento da temperatura local na vizinhança da célula - ou seja, uma vez que o perfil do feixe de fibras multimodo típicos é bem aproximada pela distribuição de um chapéu de topo 26, a diminuição na energia absorvida localmente (temperatura) devido ao deslocamento a partir do centro do feixe é mínima em comparação com o aumento da energia absorvida a partir de mover a face da extremidade da fibra mais perto da célula. Enquanto cuidados devem ser tomados para posicionar a fibra com a maior precisão e repetidamente como possible usando sinais visuais, medições precisas da localização da fibra em relação ao alvo neurônio (por exemplo, Δ) é de maior importância do que posicionando-o a uma distância pré-determinada distância. Δ pode ser determinado (com um grau de incerteza máxima estimada de ± 3 mm) por análise de imagem tal como descrito no passo 3.8.2 do protocolo. Em algumas experiências a 5,8, fontes de luz branca foram acoplados através da fibra, a fim de atingir a célula desejada. Esta abordagem foi encontrado para ser ineficaz na configuração microscópio vertical, conforme a intensidade da luz difundida a partir da região alvo foi relativamente baixo a estes ângulos rasos (θ). </li><li> Uma vez que a fibra está em posição, a movê-lo para fora de uma quantidade conhecida para permitir o posicionamento simples da micropipeta. A fibra pode então ser devolvida à sua posição original quando a gravação é conseguida neural. </li></ol></li><li> Encha a micropipeta com solução intracelular e segura se encaixar nas cabeçastagem do amplificador (por exemplo, Multiclamp 700B, Molecular Devices). Usando o tubo ligado ao lado do suporte de microeléctrodos, aplicar uma pequena quantidade de pressão positiva para evitar o entupimento da micropipeta. </li><li> Usando um micromanipulador, mova o micropipeta na posição logo acima do neurônio-alvo. </li><li> Protocolo para gravações de células inteiras: <ol><li> Aplicar a 10 mseg, 10 mV pulso de onda quadrada (por exemplo, selo de teste) no modo de fixação de tensão do amplificador e ajustar o potencial micropipeta (offset pipeta) do sinal de linha de base para 0 nA. O ensaio de vedação deve também ser usada para determinar se a resistência dos microeléctrodos está dentro da gama desejada (por exemplo, 2-6 mohms). </li><li> Enquanto monitoriza a resistência, usados ​​ajustes finos da micromanipulador para posicionar cuidadosamente a micropipeta sobre a superfície do neurónio alvo. Quando a micropipeta está em contacto com o neurónio, irá aumentar a resistência (por ~ 0,5 a 1 mohms). Eummediately seguindo o aumento da resistência, remover a pressão de fluido positiva e aplicar uma pequena pressão negativa. Uma vez que a resistência passou 10-20 mohms, corrigir o potencial para um nível de retenção (por exemplo, em torno de -60 mV) membrana. </li><li> A resistência do eléctrodo deve continuar a aumentar até exceder um GÊ, o que significa que uma vedação eficaz (denominado «gigaseal &#39;) foi formado entre a membrana celular e micropipeta. Neste ponto, remove toda a pressão do fluido a partir da micropipeta. </li><li> Uma vez que o gigaseal tenha sido formado, o uso de impulsos de corrente de curta duração (25 a 100 ms; +1 V) ou breves impulsos de pressão de fluido negativa a ruptura da membrana celular e obter uma configuração de célula total. </li><li> Gravar a capacitância de membrana, a resistência em série e resistência de entrada, conforme determinado a partir da curva exponencial montado na corrente durante o impulso de teste de vedação. Minimizar os transientes de capacitância, ajustando os controles CpFast e CpSlow no amplificador, então switch no amplificador em modo de células inteiras, e compensar a capacitância e resistência até que uma corrente fixa é observada durante o ensaio de vedação. Aplicar a compensação de resistência em série (~ correção de 70%, a previsão de 70%), o ajuste de capacitância e resistência controles para manter uma resposta selo teste plana. </li><li> Alternar para o modo atual-clamp no amplificador. Tome nota do potencial de repouso (na ausência de injeção de corrente). Ajustar a corrente que prende a estabilizar o potencial da membrana no nível desejado (por exemplo, -60 mV). Neutralizar a capacitância pipeta e ajustar o equilíbrio da ponte para equilibrar a queda de tensão. </li><li> Verifique as propriedades de disparo do neurônio, estimulando com despolarização atual (10-200 pA pA em 10 etapas, 300 ms de duração). </li></ol></li><li><ol><li> Mova a volta de fibra óptica para a posição ao lado do neurônio. Utilizando o software de imagem acoplado a uma câmara CCD captar imagens da posição da fibra em relação ao alvo neuron, incidindo sobre o plano do neurónio, inicialmente, e, em seguida, sobre a borda superior da fibra óptica (ver Figura 1). </li><li> Por análise subsequente das imagens resultantes (por exemplo, Figuras 1B e 1C) é possível determinar com exactidão Δ (a posição do bordo superior da fibra óptica em relação ao centro do neurónio alvo). Depois Δ é conhecido, os parâmetros tais como a distância entre a face da extremidade da fibra para o neurónio alvo (ao longo do eixo da fibra) z e o deslocamento no sentido radial do neurónio a partir do centro do feixe de δ r pode ser calculada usando as relações trigonométricas simples: z = r sin 2θ + Δ cos θ δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) Ay 2 + 2) 1/2, Ay onde é a distância entre o eixo da fibra e do centro do neurónio, como visto a partir de cima (por exemplo, sie Figura 1). A análise deve levar em conta as variações de posicionamento de célula para célula, como conhecimento exato desses parâmetros de localização pode ser necessária para resolver as possíveis diferenças entre os processos de estimulação 25. </li></ol></li></ol> 4. Experimentos INS <ol><li> Durante a gravação de dados eletrofisiológicos em qualquer pinça de corrente ou configurações braçadeira de tensão, execute o laser de estimulação para os parâmetros desejados (por exemplo, energia, comprimento de pulso, taxa de repetição, etc.) Com a nossa laser, a potência óptica é controlado através de uma entrada direta para o motorista laser e é especificada manualmente antes de cada gravação. Duração do impulso e frequência de repetição pode ser controlada por qualquer um gerador de sinal externo ou o software de aquisição de dados (tal como descrito no passo 2.3.4). Assegure-se que os dados são registados a partir de tanto o canal de fixação de membranas e o canal de gatilho laser. </li></ol> Pulsos de laser com comprimentos que variamde cerca de 500 ms a 15 ms e energias de ~ 0,25-5 mJ por impulso normalmente produzem respostas elétricas mensuráveis. Definindo a taxa de repetição de pulsos de laser para ser 1 Hz ou menos pode ser útil para as experiências iniciais, uma vez que irá minimizar os efeitos deste parâmetro. Os resultados típicos que mostram a variação do sinal gravado é apresentado no seguinte ponto.

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	<li>Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+infrared+light+for+in+vivo+neural+stimulation.">Application of infrared light for in vivo neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).</li><li>Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stimulation+with+optical+radiation.">Neural stimulation with optical radiation.</a> Laser &amp; Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).</li><li>Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+photochemical+tools+for+controlling+neuronal+activity.">New photochemical tools for controlling neuronal activity.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Albert, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trpv4+channels+mediate+the+infrared+laser-evoked+response+in+sensory+neurons.">Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).</li><li>Wells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+mechanisms+of+transient+optical+stimulation+of+peripheral+nerve.">Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve.</a> Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).</li><li>Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infrared+light+excites+cells+by+changing+their+electrical+capacitance.">Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance.</a> Nature Communications. 3, 736 (2012).</li><li>Bec, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+laser+stimulation+by+near+infrared+pulses+of+retinal+and+vestibular+primary+neurons.">Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).</li><li>Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+calcium+transients+evoked+by+pulsed+infrared+radiation+in+neonatal+cardiomyocytes.">Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes.</a> Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).</li><li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+stimulation+of+auditory+neurons:+Effect+of+shorter+pulse+duration+and+penetration+depth.">Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth.</a> Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).</li><li>Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsed+laser+versus+electrical+energy+for+peripheral+nerve+stimulation.">Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).</li><li>Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+stimulation+of+the+facial+nerve:+A+new+monitoring+technique.">Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique.</a> Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).</li><li>Jenkins, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+pacing+of+the+embryonic+heart.">Optical pacing of the embryonic heart.</a> Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).</li><li>Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+stimulation+of+the+auditory+nerve.">Laser stimulation of the auditory nerve.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).</li><li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectivity+of+neural+stimulation+in+the+auditory+system:+A+comparison+of+optic+and+electric+stimuli.">Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli.</a> J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).</li><li>Richter, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+stimulation+of+auditory+neurons:+Effects+of+acute+and+chronic+deafening.">Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening.</a> Hearing Research. 242, 42-51 (2008).</li><li>Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+stimulation+of+single+auditory+nerve+fibers.">Laser stimulation of single auditory nerve fibers.</a> Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).</li><li>Izzo, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+parameter+variability+in+laser+nerve+stimulation:+A+study+of+pulse+duration,+repetition+rate,+and+wavelength.">Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable-membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).</li><li>Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+application+of+brain-derived+neurotrophic+factor+and+neurotrophin-3+and+its+impact+on+spiral+ganglion+neuron+firing+properties+and+hyperpolarization-activated+currents.">Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents.</a> Hearing Research. 291, 1-14 (2012).</li><li>Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+hair+cell+explant+co-cultures+promote+the+differentiation+of+stem+cells+into+bipolar+neurons.">Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons.</a> Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).</li><li>Whitlon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+morphology+of+auditory+neurons+in+dissociated+cultures+of+newborn+mouse+spiral+ganglion.">Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion.</a> Neuroscience. 138, 653-662 (1016).</li><li>Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+stimulation+of+neurite+outgrowth+in+a+serum-free+culture+of+spiral+ganglion+neurons+from+adult+mice.">Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice.</a> Hearing Research. 230, 17-23 (2007).</li><li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+corti.">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti.</a> J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+light+absorption+in+tissue+during+infrared+neural+stimulation.">Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation.</a> Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).</li><li>Snyder, A. W., Love, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Waveguide Theory. , (1983).</li><li>Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+of+the+temporal+effects+of+heating+during+infrared+neural+stimulation.">Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation.</a> J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).</li><li>Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+temperature+jump+by+infrared+diode+laser+irradiation+for+patch-clamp+studies.">Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies.</a> Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Utilizando os protocolos descritos neste documento, é possível extrair e cultura de neurônios do gânglio espiral e investigar evocadas laser de atividade elétrica através da realização de experimentos de patch clamp de células inteiras. Quando usado in vitro, a técnica de fixação de membranas oferece um nível de controlo sobre os parâmetros experimentais, que não é alcançável in vivo. Parâmetros de estimulação a laser, tais como comprimento de onda, a energia de pulso, comprimento ...

Os campos da neurofisiologia e biônica médica dependem fortemente de técnicas que permitem a estimulação controlável de respostas elétricas no tecido neural. Enquanto a estimulação elétrica continua sendo o padrão ouro em excitação neural, sofre de uma série de inconvenientes, tais como a presença de artefatos de estímulo durante a gravação de respostas neurais, e uma falta de especificidade estimulação devido à propagação de corrente em um tecido circundante. As duas últimas décadas têm visto o desenvolvimento de técnicas de estimulação opticamente mediadas 2. Várias destas técnicas requerem a modificação do tecido-alvo, quer através da adição de uma molécula em particular (por exemplo, moléculas em gaiolas) 3 ou alguma forma de manipulação genética (por exemplo, Optogenetics) 4, nenhum dos quais são fáceis de aplicar do lado de fora de um ambiente de pesquisa. De particular interesse é, por conseguinte, a estimulação neural por infravermelhos (INS), whereby tecido neural é excitado por luz pulsada de laser infravermelho. INS tem o potencial para ultrapassar muitos dos problemas da estimulação eléctrica, permitindo altamente específico, a estimulação não-contacto do tecido neural 2. No entanto, enquanto que o INS tem sido demonstrado com sucesso numa variedade de configurações, in vivo, o mecanismo exacto de excitação permanece incerto. Algumas publicações recentes têm mostrado progresso para desvendar o mecanismo por trás INS 5-7. Aquecimento rápido devido à absorção da luz do laser por água parece desempenhar um papel fundamental. No entanto, para além deste consenso ainda está para ser atingido. Shapiro et ai. 7 propor um mecanismo geral pelo qual altamente rápido aquecimento provoca uma perturbação na distribuição de partículas carregadas adjacentes à membrana celular, conduzindo a uma alteração na capacitância da membrana celular e subsequente despolarização. Além disso, Albert et al. Cinco afirmar que laser aquecimento induzido activa uma classe específica de canais de iões sensíveis à temperatura (receptor de potencial transiente canais vanilóides), permitindo que os iões passam através da membrana celular. Nesta fase, ainda não está claro como esses mecanismos se combinam, ou mesmo se existem outros factores que estão ainda a ser identificado. Apesar de um pequeno número de publicações (Referências 5,7-9) investigaram INS in vitro, a grande maioria dos trabalhos publicados neste campo foi realizado in vivo (por exemplo, as referências 1,6,10-18). Estimulação dos neurônios auditivos infravermelho tem sido uma área de interesse particular, devido às potenciais aplicações em implantes cocleares 10,14-18. Enquanto experimentos in vivo são importantes para verificar a eficácia da técnica em diversas configurações, o aumento do nível de controle oferecido por estudos in vitro deverá levar a uma compreensão mais detalhada do mechnismo responsável pelo INS. Este relatório descreve a preparação de culturas de neurônios do gânglio espiral para as investigações patch clamp, pois estes podem ser usados ​​para estudar os mecanismos fundamentais e ao mesmo tempo ligando para a grande massa de dados existentes no sistema auditivo. A técnica de patch clamp é uma excelente ferramenta para investigações de fenômenos eletrofisiológicos, proporcionando um meio de registrar a atividade elétrica das células individuais e estudar a contribuição das correntes subjacentes individuais 19. Quando esta técnica é aplicada a uma preparação estável na in vitro de neurónios primárias, tais como culturas de neurónios do gânglio espiral, oferece a oportunidade de estudar em profundidade os mecanismos pelos quais a actividade neural é controlada e manipulada. Os protocolos especificados neste trabalho métodos esboço para investigar o efeito da estimulação a laser sobre as propriedades elétricas dos neurônios do gânglio espiral através de patch clampgravações. A abordagem baseia-se um laser de fibra de acoplamento, em vez de um laser de espaço livre, permitindo uma operação mais segura bem como mais fácil e reproduzível de alinhamento sem a necessidade de modificar a configuração do microscópio padrão. Com base nestes protocolos, deverá ser possível realizar uma vasta gama de ensaios de modo a determinar de forma mais clara o mecanismo ou os mecanismos por detrás do INS.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Cell culture materials and equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass coverslips</td>
 <td>Lomb Scientific</td>
 <td>CSC 10 1 GP</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4-ring cell culture dish </td>
 <td>VWR International</td>
 <td>82050-542</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Poly-L-ornithine solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4957</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laminin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>23017-015</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Curved forceps</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14101</td>
 <td>Dumont #5 tweezers (45&deg; angle tip)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CO2 Incubator</td>
 <td>ThermoScientific</td>
 <td>Heracell 150i</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 1. Cell culture materials and equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Neurobasal media</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neurobasal A</td>
 <td>Gibco</td>
 <td>10888-022</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N-2 supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17502-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>B27 serum-free supplement</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17504-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140-148</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-Glutamine</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>25030-149</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intracellular solution</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4034</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium D-gluconate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G4500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EGTA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>E3889</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Na2ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A2383</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9187</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaGTP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8877</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium hydroxide</td>
 <td>LabServ</td>
 <td>BSPPL738.500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sucrose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S8501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Extracellular solution </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>310166</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4504</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4034</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>383147</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Magnesium chloride</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>M8266</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>D-Glucose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G8270</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium hydroxide</td>
 <td>LabServ</td>
 <td>BSPSL740.500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sucrose</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>S8501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Upright microscope</td>
 <td>Zeiss </td>
 <td>AxioExaminerD1</td>
 <td>Equipped with Dodt contrast </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water-immersion objective</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Platform and X-Y stage </td>
 <td>ThorLabs</td>
 <td>Burleigh Gibraltar</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Recording chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>RC-26G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vibration isolation table</td>
 <td>TMC</td>
 <td>Micro-g 63-532</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD Camera</td>
 <td>Diagnostic Instruments</td>
 <td>RT1200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Camera software</td>
 <td>Diagnostic Instruments</td>
 <td>SPOT Basic</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>In-line solution heater</td>
 <td>Warner</td>
 <td>SH-27B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Temperature controller</td>
 <td>Warner</td>
 <td>TC-324B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Patch clamp amplifier</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Multiclamp 700B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Patch clamp data acquisition system</td>
 <td>Molecular Devices</td>
 <td>Digidata 1440A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micromanipulator</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>MPC-325</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette glass</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>GBF100-58-15</td>
 <td>Borosilicate glass with filament</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette Puller</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P2000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Recording Software</td>
 <td>AxoGraph</td>
 <td></td>
 <td>Lab pack and electrophysiology tools</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator bottle</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>CLS12201L</td>
 <td>1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PE Tubing</td>
 <td>Harvard</td>
 <td>PolyE #340</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masterflex peristaltic pump</td>
 <td>Cole-Parmer</td>
 <td>HV-07554-85</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3.Patch clamp equipment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,870 nm laser diode</td>
 <td>Optotech</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200/220 &mu;m diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)</td>
 <td>AFW Technologies</td>
 <td>MM1-FC2-200/220-5-C-0.22</td>
 <td>Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber through connector (FC/PC)</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>ADAFC2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber cleaver</td>
 <td>EREM</td>
 <td>FO1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) </td>
 <td>Siemens</td>
 <td></td>
 <td>For removing optical fiber jacket</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)</td>
 <td>Siemens</td>
 <td></td>
 <td>For removing outer coating of patch cord</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Signal generator</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber positioner</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical fiber chuck</td>
 <td>Newport</td>
 <td>FPH-DJ</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser power meter and detector head</td>
 <td>Coherent</td>
 <td>FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Laser equipment.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation

Demonstrou-se em anos recentes que pulsado, o laser de infravermelhos podem ser utilizadas para induzir respostas eléctricas em tecido neural, independente de qualquer outra modificação do tecido alvo. Estimulação neural de infravermelho foi relatada numa variedade de tecido neural periférico e sensorial in vivo, com particular interesse mostrado na estimulação de neurónios do nervo auditivo. No entanto, enquanto que o INS foi mostrado para trabalhar nestas configurações, o mecanismo (ou os mecanismos) pelo qual a luz infravermelha provoca excitação neuronal não é actualmente bem compreendido. O protocolo aqui apresentado descreve um método de fixação de membranas de células inteiras concebido para facilitar a investigação de estimulação neural infravermelhos em cultura neurónios auditivos primários. Por caracterizar completamente a resposta destas células a iluminação laser infravermelho, in vitro, sob condições controladas, pode ser possível obter uma melhor compreensão da physica fundamentaisl e os processos bioquímicos subjacentes estimulação neural por infravermelhos.

Neurónios do gânglio espiral respondem à iluminação laser com formas de onda repetíveis em ambos tensão braçadeira e configurações de gravação actual-clamp. Figura 3a mostra alterações típicas na corrente de fluxo através de uma membrana celular, em resposta a um 2,5 ms, 0,8 mJ impulso laser (de resposta média de 6 pulsos de laser, repetido a intervalos de 1 segundo), com o potencial de membrana realizada a -70 mV, -60 mV e -50 mV. Correntes internas líquidas são constantemente evocad...

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Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

A estimulação do nervo infravermelho tem sido proposto como uma alternativa para a estimulação eléctrica em uma variedade de tipos de nervos, incluindo os que estão associados ao sistema auditivo. Este protocolo descreve um método de patch clamp para estudar o mecanismo da estimulação do nervo no infravermelho de uma cultura de neurónios auditivos primários.

Todo patch clamp celular para investigar os mecanismos de estimulação neural Infrared

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

whole-cell-patch-clamp-for-investigating-mechanisms-infrared-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.8K visualizações.  Swinburne University of Technology. A estimulação do nervo infravermelho tem sido proposto como uma alternativa para a estimulação eléctrica em uma variedade de tipos de nervos, incluindo os que estão associados ao sistema auditivo. Este protocolo descreve um método de patch clamp para estudar o mecanismo da estimulação do nervo no infravermelho de uma cultura de neurónios auditivos primários.

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Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates of associative learning 1-5. In these studies, it is important to provide behavioral evidence of conditioning to verify that differences in brain activity are learning-related and correlated with human behavior. 
Fear conditioning studies often monitor autonomic responses (e.g. skin conductance response; SCR) as an index of learning and memory 6-8. In addition, other behavioral measures can provide valuable information about the learning process and/or other cognitive functions that influence conditioning. For example, the impact unconditioned stimulus (UCS) expectancies have on the expression of the conditioned response (CR) and unconditioned response (UCR) has been a topic of interest in several recent studies 9-14. SCR and UCS expectancy measures have recently been used in conjunction with fMRI to investigate the neural substrates of aware and unaware fear learning and memory processes 15. Although these cognitive processes can be evaluated to some degree following the conditioning session, post-conditioning assessments cannot measure expectations on a trial-to-trial basis and are susceptible to interference and forgetting, as well as other factors that may distort results 16,17 .
Monitoring autonomic and behavioral responses simultaneously with fMRI provides a mechanism by which the neural substrates that mediate complex relationships between cognitive processes and behavioral/autonomic responses can be assessed. However, monitoring autonomic and behavioral responses in the MRI environment poses a number of practical problems. Specifically, 1) standard behavioral and physiological monitoring equipment is constructed of ferrous material that cannot be safely used near the MRI scanner, 2) when this equipment is placed outside of the MRI scanning chamber, the cables projecting to the subject can carry RF noise that produces artifacts in brain images, 3) artifacts can be produced within the skin conductance signal by switching gradients during scanning, 4) the fMRI signal produced by the motor demands of behavioral responses may need to be distinguished from activity related to the cognitive processes of interest. Each of these issues can be resolved with modifications to the setup of physiological monitoring equipment and additional data analysis procedures. Here we present a methodology to simultaneously monitor autonomic and behavioral responses during fMRI, and demonstrate the use of these methods to investigate aware and unaware memory processes during fear conditioning.

A methodology to investigate the neural mechanisms that support aware and unaware memory processes during fear conditioning is described. This method monitors blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging, skin conductance response, and unconditioned stimulus expectancy during Pavlovian fear conditioning to assess the neural correlates of distinct memory processes.

Investigar os mecanismos neurais da memória Fear Consciente e Inconsciente com fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Neurociência

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell Recordings patch-clamp de Morphologically- e identificados Neuroquimicamente hipocampo Interneurônios

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Auditivo de tronco encefálico e exterior cabelo célula célula inteira Patch Clamp gravação em ratos pós-natal

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic multiplicity). Synaptic multiplicity is plastic and changes throughout development and in different physiological conditions, being an important determinant for the efficacy of synaptic transmission. Here, we outline experiments for estimating the degree of multiplicity of synapses terminating onto a given postsynaptic neuron using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices. Specifically, voltage-clamp recording is used to compare the difference between the amplitude of spontaneous excitatory postsynaptic currents (sEPSCs) and miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). The theory behind this method is that afferent inputs that exhibit multiplicity will show large, action potential-dependent sEPSCs due to the synchronous release that occurs at each synaptic contact. In contrast, action potential-independent release (which is asynchronous) will generate smaller amplitude mEPSCs. This article outlines a set of experiments and analyses to characterize the existence of synaptic multiplicity and discusses the requirements and limitations of the technique. This technique can be applied to investigate how different behavioral, pharmacological or environmental interventions in vivo affect the organization of synaptic contacts in different brain areas.

Here, we present a protocol for evaluating the functional synaptic multiplicity using whole-cell patch clamp electrophysiology in acute brain slices.

Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...