Gostaríamos de agradecer as seguintes pessoas por sua contribuição para este projecto: Kakali Sarkar, PhD, Joani Christensen, BS, Kate Buretta, BS, Nance Yuan, BS, William Lehao, MD, Johanna GRAHAMMER, Georg Furtmüller, MD, Erin Rada MD, Mohammed Al-Rakan MD, Karim Sarhane MD, Sami Khalifian, BS, Mao Qi, MD, e Angelo Barone Leto MD, VCA Laboratório do Departamento de Cirurgia Plástica e Reconstrutiva, Faculdade de Medicina, Janis Taube, MD da Universidade Johns Hopkins, Mark Fischer, MD, Departamento de Dermatologia e Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Johns Hopkins, Sue Eller, Cirurgia Minimamente Invasiva Centro de Treinamento da Faculdade de Medicina da Universidade Johns Hopkins e Cheng-Hung Lin, MD Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, Taiwan. Fonte de financiamento: Forças Armadas Instituto de Medicina Regenerativa (DoD W81XWH-08-2-0032)

Nesta publicação de vídeo, todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com um protocolo de animais aprovado pelo Animal Care and Use Committee da Universidade Johns Hopkins Institucional (IACUC). 1. Planejamento pré-operatório <ol><li> Nós utilizamos MHC-definido MGH puras suína miniatura (15-20 kg) em nossos estudos translacionais para allotransplantation membro em que um doador do sexo masculino fornece membros para dois destinatários femininos (Figura 1). Antes da cirurgia, doador e receptor animais passam por avaliação clínica minuciosa por um médico veterinário. </li><li> A fim de minimizar o tempo de isquemia e anestesia, processos de dador e do receptor são realizados simultaneamente em três mesas de operação em uma sala dedicada operacional animal. Trabalho em equipe e coordenação entre as equipes cirúrgicas, bem como o pessoal veterinário são fundamentais para o sucesso global do presente procedimento. O plano cirúrgico é discutido com a equipe veterinária em uma reunião formal 1-2 Semanas antes do dia da cirurgia. </li><li> Um cateter venoso central em túnel (7 Fr duplo lúmen Hickman cateter) é colocado em uma veia jugular externa ou interna de cada animal receptor antes do transplante para imunossupressora monitoramento do nível de droga e administração intravenosa de imunossupressor e / ou imunomoduladores. Estes cateteres são colocados sob visão direta através de uma técnica de corte-down venosa e posterior túnel para sair alto no pescoço dorsal e protegido usando monofilamento suturas não absorvíveis e cola envoltório atadura em torno do pescoço. </li><li> Manter os animais NPO (nenhum alimento sólido, mas são permitidos água ad lib), pelo menos 12 horas antes da cirurgia. </li><li> No dia da cirurgia, os animais sedar com cetamina 20 mg / kg e xilazina a 2 mg / kg, IM. </li><li> Coloque um tubo endotraqueal de tamanho adequado e conectá-lo ao aparelho de anestesia e ventilação mecânica (manutenção em isoflurano 0,5-3%) </li><li> Inserir um cateter intravenosa em uma veia marginal da orelha e administrarpeso base de 0,9% de solução salina ao longo do procedimento. </li><li> Administrar analgesia preventiva (buprenorfina 0,02 mg / kg IV). </li><li> Administrar antibiótico profilático (cefazolina 20-25 mg / kg IV) antes da incisão inicial para dador e animais receptores. </li><li> Use uma técnica asséptica em todos os procedimentos para ambos os receptores e doadores. Isso inclui o uso de instrumentos autoclavados ou esterilizados, máscaras de gás, tampas de cabeça, aventais cirúrgicos estéreis e luvas estéreis. Raspar a área da incisão com um cortador e desinfectar com a alternância de solução Betadine e álcool. </li></ol> Monitorização intra-operatória: <ol><li> Após a indução e intubação, manter a anestesia com uma mistura de inalação 0,5-3% de isoflurano em oxigênio. </li><li> Monitor de freqüência cardíaca, oximetria de pulso, ECG, ao final da expiração de CO 2 e temperatura retal de forma contínua e gravar cada 15 min. </li><li> Prevenir hipotermia com um Bair Hugger quente cobertor de ar forçado. </li></ol><ol><li> Colocar o animal doador em decúbito dorsal na mesa de operação e armar de forma estéril. </li><li> Use quase infravermelho angiografia laser para identificar vasos perfurantes para a pele ântero-medial. Injetar indocianina verde em cerca de 0,06 mg / kg diluída em 2-5 ml de soro fisiológico por meio do acesso vascular periférico. Aproximadamente 10 segundos depois, realizar 30 seg-2 min de perto as gravações de infravermelho. Use o vídeo a partir dessas gravações para identificar perfuradores. Baseado em perfuradores, marcar uma área de pele (aproximadamente 100 cm 2) para a monitorização. </li><li> Use um bisturi para fazer uma incisão na pele da virilha em continuidade com marcações para o remo pele (Figura 2). </li><li> Identificar vasos femorais e isolá-los distalmente ao nível dos ramos suprageniculado e proximal ao nível do ligamento inguinal. </li><li> Dissecar da pele e tecido subcutâneo, enquanto preservandog a área da pá da pele. Suturar as extremidades da pele para os músculos subjacentes, para evitar a contracção durante a aba de colheita. </li><li> Realizar uma osteotomia um pouco acima do tarso usando uma serra de vaivém (Electric Pen Drive, Synthes, West Chester PA). </li><li> Divida os músculos da coxa proximal utilizando o eletrocautério. </li><li> Divida o fêmur ao meio-eixo deixando uma aba osteomyocutaneous em um pedículo vascular. A aba contém o remo pele, músculos da coxa subjacentes, articulação do joelho, fêmur distal e tíbia proximal que inclui medula óssea vascularizada intacta, com suas características imunológicas únicas. </li><li> Use cera óssea para alcançar a hemostasia nos espaços da medula. Óssea suavizar as bordas usando ronjeurs em preparação para o destinatário. </li><li> Manter o enxerto na sua perfundido pedículo vascular até vasos femorais do destinatário são preparados (figura 3). </li><li> Uma vez que a dissecção destinatário estiver concluída, ligadura dos vasos femorais de doadores como proximal possível umaª infundir o enxerto com histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK, Custodiol, Newtown PA) antes do transplante. NOTA: O membro doador é transplantado no lado contralateral do destinatário ou seja, o membro doador esquerda para o lado direito do recipiente e o membro doador direito para o lado esquerdo do receptor). </li><li> Eutanásia o porco doador imediatamente após a colheita da segunda parte traseira utilizando pentobarbital sódico 100 mg / kg IV. A morte foi confirmada pela equipe veterinária por protocolo estabelecido. </li></ol> 4. Procedimento Destinatário (Hind Limb Alotransplante) <ol><li> Comece a indução e intubação receptor imediatamente após a incisão inicial dador para permitir a preparação de vasos receptores, enquanto o membro doador está a ser colhida. Isso elimina o tempo de espera necessário e reduz o tempo total de anestesia para o dador e receptores. </li><li> Posicione o supino animal com uma rotação de 30 ° no lado operacional para alloexposição w do lado dorsolateral. </li><li> Fazer uma incisão na virilha e expor os vasos femorais, isolá-los distalmente ao nível dos ramos suprageniculado e proximal ao nível do ligamento inguinal. </li><li> Criar uma bolsa subcutânea a partir da virilha para a parede abdominal dorsolateral para a inserção do enxerto (Figura 4). </li><li> Ligadura dos navios dadores e lave o enxerto com HTK. </li><li> Realizar a inserção do enxerto de forma invertida: Já o remo pele virada para dorsolateral para permitir o monitoramento fácil imune em uma posição ereta e as extremidades cortadas dos vasos femorais enfrentam caudal para permitir anastomoses vasculares end-to-end, sem qualquer tensão sobre os vasos ( Figura 5). </li><li> Se possível, use um dispositivo de acoplamento vascular (Synovis, St Paul MN) para anastomoses venosas (2,5-3,5 tamanho é adequado para animais de 10-20 kg). Isto reduz significativamente o tempo de isquemia, quando comparado com os métodos convencionais. </li><li> Realize anast arterialomoses usando uma técnica de sutura convencional com 9-0 sutura (Synovis, St Paul MN) </li><li> Após a permeabilidade vascular for confirmada, proteger o enxerto no lugar com 3-0 suturas PDS (Figura 5). Os músculos do enxerto são suturados para os músculos da parede abdominal. Os músculos de enxerto não deve ser suturado aos músculos da coxa de destinatários, uma vez que pode ser prejudicial quando o animal se move ao redor da gaiola. </li><li> Exteriorizar o remo pele no lado dorsolateral para monitorização imune (Figura 6) e uma sutura de pele adjacente utilizando suturas 3-0 Vicryl subcutâneos e de monofilamento 4-0 suturas absorvíveis interrompidas. </li><li> Feche a pele virilha em camadas usando 3-0 Vicryl suturas subcutâneas e monofilamento 4-0 absorvíveis suturas interrompidas. </li><li> Coloque um pedaço de 50-100 mcg / hr fentanil para analgesia pós-operatória. </li><li> Após o transplante do enxerto dos membros posteriores, devolver o animal para a sua caneta, uma vez acordado e respirando confortavelmente em sua própria.</li>
</ol>

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	<li>Barth, R. N., Rodriguez, E. D., Mundinger, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+bone+marrow-based+immunosuppression+inhibits+rejection+of+vascularized+composite+allografts+in+nonhuman+primates.">Vascularized bone marrow-based immunosuppression inhibits rejection of vascularized composite allografts in nonhuman primates.</a> Am. J. Transplant. 11 (7), 1407-1416 (2011).</li><li>Brandacher, G., Gorantla, V. S., Schneeberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hand/Forearm+transplantation+using+a+novel+cell-based+immunomodulatory+protocol-experience+with+five+patients.">Hand/Forearm transplantation using a novel cell-based immunomodulatory protocol-experience with five patients.</a> Am. J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+composite+tissue+allografts+across+a+major+histocompatibility+barrier+in+miniature+swine.">Tolerance to composite tissue allografts across a major histocompatibility barrier in miniature swine.</a> Transplantation. 27, 514-521 (2004).</li><li>Ibrahim, Z., Busch, J., Awwad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selected+physiologic+compatibilities+and+incompatibilities+between+human+and+porcine+organ+systems.">Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems.</a> Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2005).</li><li>Kirk, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+the+bridge:+large+animal+models+in+translational+transplantation+research.">Crossing the bridge: large animal models in translational transplantation research.</a> Immunol. Rev. 19, 176-196 (2003).</li><li>Lee, W. P., Rubin, J. P., Cober, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+swine+model+in+transplantation+of+vascularized+skeletal+tissue+allografts.">Use of swine model in transplantation of vascularized skeletal tissue allografts.</a> Transplant Proc. 30, 2743-2745 (1998).</li><li>Mathes, D. W., Hwang, B., Graves, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+vascularized+composite+allografts+in+canine+mixed+hematopoietic+chimeras.">Tolerance to vascularized composite allografts in canine mixed hematopoietic chimeras.</a> Transplantation. 92 (12), 1301-1308 (2011).</li><li>Mathes, D. W., Randolph, M. A., Solari, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+tolerance+to+a+composite+tissue+allotransplant+in+a+swine+model.">Split tolerance to a composite tissue allotransplant in a swine model.</a> Transplantation. 75 (1), 25-31 (2003).</li><li>Mezrich, J. D., Haller, G. W., Arn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histocompatible+miniature+swine:+an+inbred+largeanimal+model.">Histocompatible miniature swine: an inbred largeanimal model.</a> Transplantation. 75 (6), 904-907 (2003).</li><li>Petruzzo, P., Lanzetta, M., Dubernard, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+International+Registry+on+Hand+and+Composite+Tissue+Transplantation.">The International Registry on Hand and Composite Tissue Transplantation.</a> Transplantation. 90, 1590-1594 (2010).</li><li>Sucher, R., Lin, C., Zanoun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+hind+limb+transplantation:+a+new+composite+tissue+allotransplantation+model+using+nonsuture+supermicrosurgery.">Mouse hind limb transplantation: a new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery.</a> Transplantation. 90, 1374-1380 (2010).</li><li>Ust&#252;ner, E. T., Majzob, R. K., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swine+composite+tissue+allotransplant+model+for+preclinical+hand+transplant+studies.">Swine composite tissue allotransplant model for preclinical hand transplant studies.</a> Microsurgery. 20, 400-406 (2000).</li><li>Ust&#252;ner, E. T., Zdichavsky, M., Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+composite+tissue+allograft+survival+in+a+porcine+model+with+cyclosporine/mycophenolate+mofetil+therapy.">Long-term composite tissue allograft survival in a porcine model with cyclosporine/mycophenolate mofetil therapy.</a> Transplantation. 661, 581-587 (1998).</li><li>Wachtman, G. S., Wimmers, E. G., Gorantla, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biologicals+and+donor+bone+marrow+cells+for+targeted+immunomodulation+in+vascularized+composite+allotransplantation:+a+translational+trial+in+swine.">Biologicals and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine.</a> Transplant Proc. 43, 3541-3544 (2011).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Historicamente, o protocolo de transplante heterotópico membro posterior incluídos exteriorização de uma pá de pele da parede abdominal ventral e os vasos anastomosados ​​de uma maneira extremo-a-lado (Hettiarachty 2004). No entanto, em nosso método modificado, uma aba invertida insetting e end-to-end anastomoses trazer o remo pele mais lateralmente e, portanto, facilita o monitoramento imunológico em uma posição de pé do animal. A identificação da artéria sural e as zonas de máxima de perfusão utiliz...

Vascularizado Composite Alotransplante (VCA), tais como mãos e rosto transplantes são agora uma realidade clínica com inúmeros transplantes de mão e rosto realizados em todo o mundo 12. Apesar do facto de que os resultados iniciais e intermediários são favoráveis ​​e muito encorajadores 2, o requisito de imunossupressão multidroga crónica continua a limitar a sua aplicação clínica generalizada. Os avanços em modelos murinos de VCA incluindo anastomoses super-microcirurgia e técnicas de punho nonsuture 13, 3 abriram o caminho para uma melhor compreensão do aloimunes respostas em VCA. Miríades de protocolos imunomoduladores têm sido propostos para aplicações clínicas com base em nossa melhor compreensão dos mecanismos imunes em VCA, mas eles precisam ser validados em um modelo animal de grande porte que seria razoavelmente preditivo do seu desempenho em humanos 7. Com base nas semelhanças fisiológicas e imunológicas entre os sistemas de órgãos humanos e suínos <sup&gt; 6, os modelos VCA suína podem ser consideradas alternativas confiáveis ​​e de baixo custo a canino 9 e modelos de primatas não humanos 1. Este artigo fornece uma visão detalhada da metodologia utilizada em nosso modelo MHC-definido suína heterotópico traseira membro transplante, que serve como base para as nossas estratégias imunomoduladoras atuais e futuras destinadas a induzir tolerância imunológica a VCA e, consequentemente, ampliando sua aplicação clínica. Nós utilizamos porcos puras bem caracterizados criados para homozigose no antígeno leucocitário lócus suína especificamente para seu uso em pesquisa relacionada ao transplante 11. Nós levantamos uma ponta osteomyocutaneous vascularizado baseado em vasos femorais. A aba contém medula óssea vascularizada intacto no fêmur distal e tíbia proximal. A pele da coxa anteromedial também está incluído no enxerto e é exteriorizada do aspecto dorsolateral do animal receptor por monitorização imunitária do componente o mais imunogênicaf o VCA. Posicionamento Dorsolateral facilita o exame clínico em pé e sentada, e também mantém a pele do enxerto relativamente limpa. Ustener et al. Introduziu um dos primeiros grandes modelos translacionais animais em VCA por transplante radiais abas membro anterior osteomyocutaneous em suínos fazenda outbred 15. O grupo utilizou este modelo para demonstrar pela primeira vez que a rejeição aguda em VCA que inclui o componente de pele altamente imunogénica pode ser retardada e tratada com uma estratégia clinicamente relevantes sem complicações específicos da droga e os efeitos colaterais significativos. Os resultados favoráveis ​​obtidos neste estudo posteriormente construído um passo fundamental na concepção de regimes de medicamentos para transplante de reconstrução humana. Embora estes modelos VCA porco precoce foram bem adequado para o desenvolvimento de protocolos para evitar a rejeição de pele, músculo, ossos, nervos e vasos que não tinham estruturas especializadas, como articular cartilage e membranas sinoviais das articulações. Os esforços subsequentes foram focados na inclusão do dígito medial do animal, o que exigiu a colocação elenco completo para evitar o deslocamento do enxerto 14. Embora adequado para investigar a rejeição de todos os principais componentes do transplante de limbo, uma das principais limitações deste modelo era pós-transplante dificuldade ambulatorial devido ao lançar colocação. Assim, os modelos de alotransplante membro suína heterotópicos, que consiste na tíbia, fíbula, articulação do joelho, fêmur distal, músculo circundante, e uma pá de pele, foram criados para estudar principalmente os aspectos imunológicos da VCA, permitindo que o animal de deambular livremente no pós-operatório com morbidit mínimo 8 . O desenvolvimento de porcos puras SLA definidos bem caracterizados através do trabalho pioneiro do Dr. David H. Sachs levou a uma nova era de pesquisa translacional VCA. Utilizando um modelo de transplante heterotópico membro posterior em um ambiente antígeno incompatibilidade menor, Mathes et al. 10 demonstraram sobrevivência indefinida de componentes músculo-esqueléticas com um curto período de tratamento ciclosporina. A sobrevivência componente da pele, no entanto, só foi prolongada quando comparado com os controlos sem tratamento. A perda da componente da pele do enxerto foi atribuída a uma resposta imune isolado e altamente vigorosa, em particular, para a epiderme. Da mesma forma, usando porcos totalmente incompatíveis com depleção de células T, um curso curto de ciclosporina e de citocinas mobilizou doadores de células mononucleares do sangue periférico induzidos tolerância apenas aos componentes osteomusculares eo componente pele ainda foi rejeitado 5. Esse fenômeno, chamado de &quot;tolerância dividida &#39;, trouxe uma mudança de paradigma na investigação VCA com um foco maior sobre o componente da pele altamente imunogênica, que é um componente integral da maioria dos transplantes de reconstrução realizados até o momento. Neste modelo modificado, nós utilizamos anastomose fim-de-final por ligating a artéria femoral destinatário e rodando-cefálica (Figura 1). Isto não só reduz o tempo de isquemia, permitindo a utilização de um dispositivo de acoplamento convencional, mas também diminui a probabilidade de falha da anastomose. Não observamos eventos isquêmicos seguintes ligadura da artéria femoral em nossos destinatários, indicando que a circulação colateral foi suficiente para fornecer a vascularização na perna nativa. Além disso, neste método modificado, o componente de pele é exteriorizada mobilizados com base nos vasos subjacentes perfurantes e está posicionada lateralmente (Figura 1), em contraste com uma posição ventral virilha no modelo tradicional 10. Isso permite fácil visualização do enxerto para o monitoramento imunológico em pé ou sentado do animal. Assim, um grande modelo animal confiável e reprodutível é essencial para investigar estratégias de indução de tolerância em relação a componente de pele de VCA e desenvolver novos nestratégias de monitoramento do sistema imunológico oninvasive para uma melhor previsão de sobrevida do enxerto.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HTK</td>
			<td>Custodial</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Electric Pen Drive</td>
			<td>Synthes, Westchester PA </td>
			<td>05.001.011 </td>
			<td>Reciprocating saw</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Vascular Coupling device</td>
			<td>Synovis, Newtown PA</td>
			<td>21003B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (vca) research

Vascularizado Composite Alotransplante (VCA), tais como mãos e rosto transplantes de representar uma opção viável de tratamento para trauma músculo-esquelético complexo e perda de tecido devastador. Apesar de os resultados funcionais favoráveis ​​e altamente encorajadores precoce e intermediário, a rejeição do componente pele altamente imunogênica de um VCA e potenciais efeitos adversos da imunossupressão multi-droga crônica continuam a dificultar a aplicação clínica generalizada de VCA. Portanto, a pesquisa neste campo novela precisa de se concentrar em estudos translacionais relacionados a características imunológicas únicas de VCA e desenvolver estratégias novas para imunomoduladores imunomodulação e indução de tolerância seguintes VCA, sem a necessidade de imunossupressão a longo prazo. Este artigo descreve um modelo de animal grande translação fiável e reprodutível de VCA, que é composta de uma aba osteomyocutaneous num suína alotransplante membro posterior heterotópico de MHC definidas. BriEFLY, uma pá pele bem vascularizado é identificada na região ântero-medial da coxa usando perto angiografia laser infravermelho. Os músculos subjacentes, articulação do joelho, fêmur distal e tíbia proximal são colhidas em um pedículo vascular femoral. Este enxerto pode ser considerado tanto um VCA e um transplante de medula óssea vascularizada com as suas características privilegiadas imunológicas únicas. O enxerto é transplantado para uma bolsa abdominal subcutânea no animal receptor com um componente de pele exteriorizados na região dorso-lateral para a monitorização imunitária. Três equipes cirúrgicas trabalhar simultaneamente de uma forma bem coordenada para reduzir a anestesia e os tempos de isquemia, melhorando assim a eficiência deste modelo e reduzindo potenciais fatores de confusão em protocolos experimentais. Este modelo serve como a base para futuras estratégias terapêuticas que visam a redução e, potencialmente eliminando a necessidade de imunossupressão crônica multi-droga em VCA.

Vinte e quatro transplantes de membros posteriores heterotópicos suína SLA definidos foram realizadas utilizando a nossa técnica modificada com um tempo de isquemia médio de 78 min (intervalo: 62-94 min). Inserção do enxerto e dorsolateral posicionamento pá pele foram alcançados sem dificuldades em todos os animais. Perto angiografia laser infravermelho mostrou excelente perfusão do enxerto em todos os destinatários. Os doze anastomoses venosas iniciais foram realizadas utilizando técnicas de sutura convencio...

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A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation VCA Research

Vascularizado Composite Allotransplantations (VCA) tornaram-se uma realidade clínica. No entanto, a vasta aplicação clínica de VCA é limitada pela imunossupressão multi-droga crónica. Os autores apresentam um grande modelo animal confiável e reprodutível para traduzir estratégias inovadoras imunomoduladores que podem minimizar ou potencialmente eliminar a necessidade de imunossupressão em VCA.

Um modelo de transplante heterotópico Modificado Swine Hind Limb para Translational vascularizado Composite Alotransplante (VCA) Pesquisa

Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) such as hand and face transplants represent a viable treatment option for complex musculoskeletal trauma ...

a-modified-heterotopic-swine-hind-limb-transplant-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

A Modified Heterotopic Swine Hind Limb Transplant Model for Translational Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Research

12.4K visualizações.  Johns Hopkins University School of Medicine.  Vascularizado Composite Allotransplantations (VCA) tornaram-se uma realidade clínica. No entanto, a vasta aplicação clínica de VCA é limitada pela imunossupressão multi-droga crónica. Os autores apresentam um grande modelo animal confiável e reprodutível para traduzir estratégias inovadoras imunomoduladores que podem minimizar ou potencialmente eliminar a necessidade de imunossupressão em VCA. 

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A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents available. A difficulty is presented due to the small size of the animal and the considerable technical challenges of the microsurgery involved in heart transplantation. In particular, a high rate of technical failure early after transplantation may result from recipient death and post-operative complications such as hind limb paralysis or a non-beating heart. Here, the complete technique for heterotopic mouse heart transplantation is demonstrated, involving harvesting the donor heart and its subsequent implantation into a recipient mouse. The donor heart is harvested immediately following in situ perfusion with cold heparinized saline and transection of the ascending aorta and pulmonary artery. The recipient operation involves preparation of the abdominal aorta and inferior vena cava (IVC), followed by end-to-side anastomosis of the donor aorta with the recipient aorta using a single running 10-0 microsuture and a similar anastomosis of the donor pulmonary artery with the recipient IVC. Following the operation the animal is injected with 0.6 ml normal saline subcutaneously and allowed to recover on a 37&#160;&#176;C heating pad. The results from 227 mouse heart transplants are summarized with a success rate at 48 hr of 86.8%. Of the 13.2% failures within 48 hr, 5 (2.2%) experienced hind limb paralysis, 10 (4.4%) had a non-beating heart due to graft ischemic injury and/or thrombosis, while 15 (6.6%) died within 48 hr.

A technique is demonstrated for the microsurgical procedure for heterotopic transplantation of hearts in mice, including simplified methods for donor harvesting and recipient vessel anastomosis.

Um método modificado para heterotópico Rato coração transplante

Mice are often used as heart transplant donors and recipients in studies of transplant immunology due to the wide range of transgenic mice and reagents ...

Medicina

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Técnica de transplante heterotópico Murino Coração

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

A Microsurgical Modelo Novel para heterotópico, em bloco da parede torácica, Thymus, e Transplante Cardíaco em Ratos

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

Ortotópico Hind Limb Transplantation no mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Modelo do rato para transplante de pâncreas, usando uma técnica modificada do manguito

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Surgical Angiogenesis in Porcine Tibial Allotransplantation: A New Large Animal Bone Vascularized Composite Allotransplantation Model

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic options have significant risk of failure and substantial morbidity.
Use of bone vascularized composite allotransplantation (VCA) would offer both a close match of resected bone size and shape and the healing and remodeling potential of living bone. At present, life-long drug immunosuppression (IS) is required. Organ toxicity, opportunistic infection and neoplasm risks are of concern to treat such non-lethal indications.
We have previously demonstrated that bone and joint VCA viability may be maintained in rats and rabbits without the need of long-term-immunosuppression by implantation of recipient derived vessels within the VCA. It generates an autogenous, neoangiogenic circulation with measurable flow and active bone remodeling, requiring only 2 weeks of IS. As small animals differ from man substantially in anatomy, bone physiology and immunology, we have developed a porcine bone VCA model to evaluate this technique before clinical application is undertaken. Miniature swine are currently widely used for allotransplantation research, given their immunologic, anatomic, physiologic and size similarities to man. Here, we describe a new porcine orthotopic tibial bone VCA model to test the role of autogenous surgical angiogenesis to maintain VCA viability.
The model reconstructs segmental tibial bone defects using size- and shape-matched allogeneic tibial bone segments, transplanted across a major swine leukocyte antigen (SLA) mismatch in Yucatan miniature swine. Nutrient vessel repair and implantation of recipient derived autogenous vessels into the medullary canal of allogeneic tibial bone segments is performed in combination with simultaneous short-term IS. This permits a neoangiogenic autogenous circulation to develop from the implanted tissue, maintaining flow through the allogeneic nutrient vessels for a short time. Once established, the new autogenous circulation maintains bone viability following cessation of drug therapy and subsequent nutrient vessel thrombosis.

Currently any kind of vascularized composite allotransplantation depends on long-term-immunosuppression, difficult to support for non-life-critical indications. We present a new porcine tibial VCA model that can be used to study bone VCA and demonstrate the use of surgical angiogenesis to maintain bone viability without the need of long-term immune-modulation.

Angiogênese cirúrgica em suínos Allotransplantation Tibial: um novo grande osso Animal vascularizado composto Allotransplantation modelo

Segmental bone loss resulting from trauma, infection malignancy and congenital anomaly remains a major reconstructive challenge. Current therapeutic ...

Preclinical Model of Hind Limb Ischemia in Diabetic Rabbits

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular disease is the development of ischemia. In severe cases, patients can develop critical limb ischemia in which they experience constant pain and an increased risk of limb amputation. Current therapies for peripheral ischemia include bypass surgery or percutaneous interventions such as angioplasty with stenting or atherectomy to restore blood flow. However, these treatments often fail to the continued progression of vascular disease or restenosis or are contraindicated due to the overall poor health of the patient. A promising potential approach to treat peripheral ischemia involves the induction of therapeutic neovascularization to allow the patient to develop collateral vasculature. This newly formed network alleviates peripheral ischemia by restoring perfusion to the affected area. The most frequently employed preclinical model for peripheral ischemia utilizes the creation of hind limb ischemia in healthy rabbits through femoral artery ligation. In the past, however, there has been a strong disconnect between the success of preclinical studies and the failure of clinical trials regarding treatments for peripheral ischemia. Healthy animals typically have robust vascular regeneration in response to surgically induced ischemia, in contrast to the reduced vascularity and regeneration in patients with chronic peripheral ischemia. Here, we describe an optimized animal model for peripheral ischemia in rabbits that includes hyperlipidemia and diabetes. This model has reduced collateral formation and blood pressure recovery in comparison to a model with a higher cholesterol diet. Thus, the model may provide better correlation with human patients with compromised angiogenesis from the common co-morbidities that accompany peripheral vascular disease.

We describe a surgical procedure used to induce peripheral ischemia in rabbits with hyperlipidemia and diabetes. This surgery acts as a preclinical model for conditions experienced in peripheral artery disease in patients. Angiography is also described as a means to measure the extent of introduced ischemia and recovery of perfusion.

Modelo pré-clínico de isquemia de membros posteriores em coelhos diabéticos

Peripheral vascular disease is a widespread clinical problem that affects millions of patients worldwide. A major consequence of peripheral vascular ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand and face transplants and, more recently, abdominal wall, uterus, and urogenital transplants. Functional outcomes have exceeded initial expectations, and most recipients enjoy an improved quality of life. However, as clinical experience accumulates, chronic rejection and complications from the immunosuppression must be addressed. In many cases where grafts have failed, the causative pathology has been ischemic vasculopathy. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">The biological mechanisms of the acute and chronic rejection associated with VCA, especially ischemic vasculopathy, are important areas of research. However, due to the very small number of VCA patients, the evaluation of proposed mechanisms is better addressed in an experimental model. Multiple groups have used animal models to address some of the relevant unsolved questions in VCA rejection and vasculopathy. Several model designs involving a variety of species are described in the literature. Here we present a reproducible model of VCA heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap in the rat that can be utilized for translational VCA research. This model allows for the serial evaluation of the graft, including biopsies and different imaging modalities, while maintaining a low level of morbidity.

Vascularized composite allograft offers life-altering benefits to transplant recipients, but the biological causes of graft rejection and vasculopathy remain poorly understood. The rodent surgical model presented here offers a reproducible, clinically relevant model of transplantation, allowing researchers to evaluate rejection events and potential therapeutic strategies to prevent their occurrence.

Modelo Osteomyocutaneous Heterotopic modificado da aleta do Hindmembro no rato para a pesquisa de Allotransplante composta Vascularized translacional

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity

The spleen is a unique lymphoid organ that plays a critical role in the homeostasis of the immune and hematopoietic systems. Patients that have undergone splenectomy regardless of precipitating causes are prone to develop an overwhelming post-splenectomy infection and experience increased risks of deep venous thrombosis and malignancies. Recently, epidemiological studies indicated that splenectomy might be associated with the occurrence of cardiovascular diseases, suggesting that physiological functions of the spleen have not yet been fully recognized. Here, we introduce a mouse model of vascularized heterotopic spleen transplantation, which not only can be utilized to study the function and behavioral activity of splenic immune cell subsets in different biologic processes, but also can be a powerful tool to test the therapeutic potential of spleen transplantation in certain diseases. The main surgical steps of this model include donor spleen harvest, the removal of recipient native spleen, and spleen graft revascularization. Using congenic mouse strains (e.g., mice with CD45.1/CD45.2 backgrounds), we observed that after syngeneic transplantation, both donor-derived splenic lymphocytes and myeloid cells migrated out of the graft as early as post-operative day 1, concomitant with the influx of multiple types of recipient cells, thus generating a unique chimera. &#160;Despite relatively challenging techniques, this procedure can be performed with &#62;90% success rate. This model allows tracking the fate, longevity, and function of splenocytes during steady state and in a disease setting following a spleen transplantation, thereby offering a great opportunity to discover the distinct role for spleen-derived immune cells in different disease processes.

This protocol details the surgical steps of a mouse model of vascularized heterotopic spleen transplantation, a technically challenging model that can serve as a powerful tool in studying the fate and longevity of spleen cells, the mechanisms of distinct spleen cell populations in disease progression, and transplant immunity.

Um modelo de camundongo de transplante de baço heterotópico vascularizado para estudar a biologia celular do baço e a imunidade a transplantes

The spleen is a unique lymphoid organ that plays a critical role in the homeostasis of the immune and hematopoietic systems. Patients that have undergone ...

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current limitations in immunosuppression and functional neuromotor recovery. Many animal models have been developed for studying unique features of VCA, but here we present a robust reproducible model of orthotopic hind limb transplant in rats designed to simultaneously investigate both aspects of current VCA limitation: immunosuppression strategies and functional neuromotor recovery. At the core of the model rests a commitment to meticulous, time-tested microsurgical techniques such as hand sewn vascular anastomoses and hand sewn neural coaptation of the femoral nerve and the sciatic nerve. This approach yields durable limb reconstructions that allow for longer lived animals capable of rehabilitation, resumption of daily activities, and functional testing. With short-term treatment of conventional immunosuppressive agents, allotransplanted animals survived up to 70 days post-transplant, and isotransplanted animals provide long lived controls beyond 200 days post-operatively. Evidence of neurologic functional recovery is present by 30 days post operatively. This model not only provides a useful platform for interrogating immunological questions unique to VCA and nerve regeneration, but also allows for in vivo testing of new therapeutic strategies specifically tailored for VCA.

This protocol presents a robust, reproducible model of vascularized composite allotransplant (VCA) geared toward simultaneous study of immunology and functional recovery. The time invested in meticulous technique in a right mid-thigh hind limb orthotopic transplant with hand sewn vascular anastomoses and neural coaptation yields the ability to study functional recovery.

Dando o próximo passo: um modelo de transplante ortotópico ortotópico de coaptation ortotópico para maximizar a recuperação funcional em ratos

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current ...