Este trabalho foi financiado em parte pelo BBSRC (BB/1006478/1). PRR é o destinatário de uma Bolsa de Investigação da Universidade Royal Society.

1. Considerações Estratégicas <ol><li> A escolha de uma semente de cristais utilizados para experiências microdispersão irá variar, dependendo do objetivo do ensaio. No início de um projeto é útil para encontrar vários hits de cristalização que podem fornecer pontos de partida alternativos para otimização de cristal. MGR reduz significativamente a necessidade de otimização de cristal porque cristais de boa qualidade são mais propensos a crescer na zona metaestável do diagrama de fases, ou seja, na região onde seguinte perturbação ou nucleação o sistema retorna ao equilíbrio. Assim, sugerimos usar Rmms rotineiramente assim que os primeiros cristais são obtidos (ou, mais precisamente, logo que os primeiros cristais parar de crescer). </li><li> Para a rodada inicial de MGR, um estoque de sementes deve ser feita com o máximo de material cristalino possível. Se apenas um poço está disponível que contém cristais, ou se os cristais são pequenos, pode ser útil para definir múltiplas repetições dohit original (sem semeadura) para aumentar a oferta de cristais. Se, no entanto, vários acessos diferentes são obtidos, os cristais de semente podem ser colhidas a partir de várias condições e misturados em conjunto. </li><li> Para evitar a separação de fase, os cristais crescidos em condições de alto sal devem ser colhidas separadamente dos cristais crescidos em condições de alta PEG. Se os cristais de vários poços são misturados, uma solução de reserva que é menos susceptível de dar origem a cristais de sal deve ser seleccionada para a suspensão de sementes. Por exemplo, a altas concentrações de fosfato, sulfato, cálcio e magnésio deve ser evitada. </li><li> Mais tarde, num projecto, pode ser importante procurar cristais com células unitárias diferentes, a fim de melhorar a difracção, evitar cristais geminados, e obter cristais que são adequados para ligandos de ligação. Nesta fase, apenas os cristais mais adequadas (por exemplo, aqueles que difractam melhor) deve ser utilizado para fazer o material de sementes. Às vezes, são necessárias repetidas rodadas de microdispersão, onde apenas o &quot;melhor&quot;Cristais são usados ​​para fazer o material de semente para o ciclo subsequente. Se possível, um&quot; agente precipitante neutros &quot;tais como o PEG 3000 deve ser usado para suspender os cristais de semente para encorajar novos contactos de cristais e cristalização de complexos que podem ser instáveis ​​em alta soluções salinas-12. </li><li> Experimentos microdispersão clássicos, onde uma condição única cristalização é usado, muitas vezes são úteis após a identificação de uma condição promissora e durante a otimização subseqüente. Muitas vezes, é necessário diluir o estoque de semente de forma a obter o número desejado de cristais por gota. A &quot;combinatória&quot; experimento microdispersão (onde uma série de estirpes de crescente diluição são adicionados a uma condição de cristalização) é um método rápido para encontrar a diluição ideal do estoque de sementes. Esta abordagem é descrita abaixo. </li></ol> 2. Preparação de semente da Bolsa <ol><li> Faça uma sonda de vidro arredondado de uma pipeta Pasteur de vidro usando uma chama de Bunsen. <ol><li> Aqueça a pipeta perto do meio até que se torne macio, em seguida, removê-lo rapidamente da chama e retirá-la, puxando para além das extremidades. Destinam-se a puxar o copo de diâmetro inferior a 0,25 mm. </li><li> Quebre o vidro no ponto onde ela é de cerca de 0,25 milímetros e brevemente mergulhar o final arrombado a chama. Repetir este procedimento até um hemisfério de vidro com um diâmetro de 0,75 milímetros ~ é formada na extremidade. Esta sonda é útil para esmagar material cristalino, uma vez que está devidamente dimensionada para golpear objetos sólidos na escala de 0,01-1,0 mm e não danificar a superfície de plástico de uma cristalização bandeja sub-bem ou lamela. Sondas maiores (~ 1,0 mm) pode esmagar pequenos cristais de forma mais eficaz porque os cristais são presos entre o vidro e plástico. </li></ol></li><li> Coloque um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, contendo uma semente de grânulo de gelo. </li><li> Inspecione a bandeja cristalização pré-estabelecida, utilizando um microscópio binocular ou sistema de imagem de cristal e selecione uma ou mais apquada poços da bandeja a partir da qual colhem material cristalino para geração de estoque de sementes. Qualquer material pode ser utilizado, incluindo as agulhas finas, esferulites, microcristais e irregulares, cristais mal formados. O estoque de sementes deve ser feita o mais rapidamente possível após os cristais param de crescer, como o material mais antigo é mais provável que seja parcialmente reticuladas, reduzindo assim a sua adequação para uso em experimentos de semeadura. Se existir qualquer dúvida quanto ao facto de o material cristalino a ser colhido é o sal ou a proteína também pode ser visualizado utilizando um microscópio de fluorescência, UV ou um sistema de imagem antes da abertura, ou se o material cristalino pode ser sujeito a análise in-situ de difracção de raios-X na bandeja. Ao usar os antigos cristais de proteínas abordagem fluorescência sob irradiação UV, cristais de sal aparecerá incolor. </li><li> Abra a bandeja de cristalização bem selecionado. Para 96 ​​poços sentado bandejas gota cortam a folha de plástico de vedação superior ao redor do poço selecionado using uma lâmina de bisturi. Para 24 poços tabuleiros hanging gota remover a lamela utilizando um par de pinças. Inverta a lamela e coloque-o sobre uma superfície limpa estável. Retirar 50 mL da solução de reservatório e transferir o líquido para o tubo de microcentrífuga contendo a semente grânulo assegurar que o tubo se mantém no gelo durante todo. </li><li> Completamente esmagar os cristais no subwell (96 poços bandeja) ou lamela (bandeja de 24 poços) cai, utilizando a sonda de vidro preparado na seção 2.1, a visualização dos resultados sob um microscópio. Pequenos cristais pode demorar alguns minutos para esmagar completamente. Este passo permite que o experimentador para verificar que os cristais são fáceis de esmagar e por isso não são de ligação cruzada, e também que não se encontram cristais de sal. Cristais de sal produzir um clique característico que pode ser ouvido e sentido quando são esmagados. Se os cristais são duras e difíceis de esmagar tentativa de obter e utilizar o material mais fresco. </li><li> Retirar 5 ml da solução de reservatório a partir do tubo de talão de sementes e transferência para o sub-bem equivalente (sentado experimento gota), ou lamela (pendurado experimento gota) contendo o material cristalino a ser colhida. Pipetar este líquido para cima e para baixo 5-6 vezes para voltar a suspender o máximo de sub-bem ou lamela conteúdo possível. Retorne a suspensão no tubo do grânulo Semente e repita esta etapa mais duas vezes, garantindo que o material cristalino, tanto é colhida possível. </li><li> Vortex o grânulo semente, durante dois minutos, paragem a cada 30 segundos para arrefecer o tubo em gelo. </li><li> Fazer uma série de diluições, a diluição da solução stock de sementes no reservatório por um factor de 4 a 10 em cada fase. Normalmente, muitos cristais serão obtidos ao usar um estoque de sementes não diluído, então use os stocks de sementes diluídas para controlar o número de cristais por bem. Na primeira rodada de MGR, é importante para não diluir a solução estoque de sementes, uma vez que quanto maior a concentração de sementes os hits mais de cristalização serão obtidos. </li><li> Se não estiver a ser utilizado imediatamentetamente, transferir a suspensão de estoque de sementes e do stock de sementes diluída para uma -20 ° C, ou -80 ° C congelador para armazenamento. Para evitar que os ciclos de congelamento e descongelamento repetidos, o que pode reduzir a eficácia do stock de sementes, armazenar este material em pequenas alíquotas de volume, ou seja, 10-20 ul. Uma vez congelado, os estoques de sementes podem ser mantidos indefinidamente até que seja necessário. </li></ol> 3. Estabelecimento de cristalização Bandejas <ol><li> Dependendo da disponibilidade de locais de cristalização e as preferências do experimentador, MGR rastreio de cristalização pode ser realizada utilizando ou bandejas de 24 poços empregando o método de difusão de vapor de gota em suspensão, ou em tabuleiros de 96 poços utilizando o método de difusão de vapor gota sentado. Tabuleiros de cristalização para Rmms pode ser estabelecida tanto por lado, utilizando um dispensador de líquido de manuseamento robotizado, ou uma combinação dos dois. </li><li> Uma experiência típica MGR criado pela mão compreenderá, 1,0 mL solução de proteína, condição cristalização 1,0 mL, e0,5 mL estoque de sementes. Uma experiência típica configurada usando um robô cristalização compreenderá, solução de proteína de 0,3 mL, 0,2 mL condição de cristalização, e 0,1 mL estoque de sementes. </li><li> Para realizar a triagem Rmms em 24 poços pendurado bandejas gota, em primeiro lugar, usando uma pipeta manual, transferir 300 ul de cada condição de uma tela de condições de cristalização de 96 poços em 10 mL de formato de tubo único para cada poço de 4 x 24 poços cristalização pregreased bandejas. <ol><li> Transferência de 1 ul de cada uma das condições de cristalização a partir de cada reservatório de 300 ul para a superfície de uma lamela de plástico correspondente a partir do qual ambas as tiras de suporte de protecção dianteiros e traseiros foram removidos. </li><li> Para os 1 ml de cada uma das condições de cristalização adicionar 1 ml de solução de proteína, seguido por 0,5 l de estoque de sementes de cristal. Inverter cada lamela de tal forma que a gota de líquido é virada para baixo e por cima da posição apropriada bem. </li><li> Pressione para baixo sobre a lamela, comprimindo o sealing graxa e formando uma vedação segura. Uma vez que todas as gotas 96 são estabelecidas, a bandeja deve ser transferido para uma incubadora ou numa sala de temperatura constante, normalmente na gama de 4-18 ° C durante o armazenamento. </li></ol></li><li> Para realizar a triagem Rmms em 96 poços sentado bandejas gota em primeiro lugar transferir 20-50 ul de cada condição de uma tela condição de cristalização de 96 poços no formato de bloco de poços profundos em cada cavidade correspondente da bandeja de cristalização. Esta etapa de transferência pode ser realizada utilizando um robot de cristalização, ou por transferência manual, utilizando uma pipeta de 8 canais. <ol><li> Transferência de reservatório, proteínas e sementes soluções estoque para as gotas à mão ou com um robô usando os volumes detalhados em 3.1. Alguns robôs de cristalização comercialmente disponíveis não entre em contato dispense, e desempenho de sementes de transferência de estoque usando um tal sistema pode resultar em bloqueio de dispensar dicas ou tubulação associada. A ordem de distribuição é variável: alguns robôs dispensar todas as soluções simultaneamente. Seisso não é possível, dispensar proteína primeiro, depois o reservatório, então sementes de ações. </li><li> Se um contato dispensação robô não é transferência disponíveis as sementes usando uma seringa de vidro de baixa de volume com uma agulha sem corte. Lavar a agulha passando-a através da solução do reservatório, em seguida dispensar o estoque de sementes em cada gota. </li><li> Selar o tabuleiro com uma folha de selagem transparente e transferir para uma incubadora ou sala de temperatura constante, durante o armazenamento. </li></ol></li></ol> 4. Inspeção de cristalização Bandejas <ol><li> Visualize todos os experimentos de cristalização usando tanto um microscópio binocular ou um sistema de imagem de cristal. O ex geralmente proporciona ao utilizador um maior controlo sobre a profundidade de visão e o grau de ampliação do que o segundo, mas é mais demorado. </li><li> Inspecione cada sub-well/coverslip em seqüência e registrar qualquer evidência de formação de cristais. Experimentos deve ser inspecionado a cada 24 horas durante 5 dias após o estabelecimento ean, posteriormente, uma vez a cada 7 dias para até 4 semanas. </li><li> Múltiplos ciclos de MGR muitas vezes são necessárias antes de cristais de qualidade óptima de difracção são produzidos. </li></ol>

<ol>
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S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. 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G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Neste artigo descrevemos um método geral para MGR proteína triagem cristalização. Nós demonstramos usando duas proteínas de teste uma melhoria significativa na taxa de sucesso de cristalização utilizando este método. Análise de difração usando radiação síncrotron de um subconjunto de cristais gerados usando MGR e métodos não-MGR revelou pouca variação de qualidade de difração entre cristais crescidos usando qualquer método, embora autores anteriores relataram que os cristais de boa qualidade são m...

A partir de sua aplicação inicial por Perutz, Kendrew e colegas de trabalho na determinação das estruturas de hemoglobina e mioglobina, aos alto rendimento modernos pipelines automatizados da genômica estrutural consórcios, macromolecular cristalografia de raios-X nos proporcionou uma visão estrutural sem precedentes no mundo da proteína . Esta técnica continua sendo o método experimental mais amplamente aplicável, que permite a visualização direta da estrutura da proteína em atômica, ou perto de resolução atômica (ou seja, no intervalo a 1-3). Um pré-requisito para a difracção de raios-X para ser aplicado a uma proteína é que ele deve primeiro ser cristalizado, e é esta fase do processo, que continua a ser o maior única etapa limitante da velocidade na determinação da estrutura por meio de métodos de difracção de 1, 2. Apesar dos avanços significativos em nossa compreensão do processo de cristalização de proteínas, e grandes melhorias na qualidade e disponibilidade de telas de cristalização,bandejas, e tecnologias relacionadas, permanece impossível prever com segurança a probabilidade de sucesso de cristalização 3. Métodos bioquímicos e biofísicos pode ser aplicado para avaliar se uma proteína de interesse apresenta características favoráveis ​​para a nucleação e crescimento de cristais, ou seja, é bem dobrada, homogêneo, monodispersa, etc, no entanto, essas idéias de forma alguma fornecer uma previsão definitiva de cristalização propensão. Sementeira tem sido suposto ser um método viável para aumentar o número, o tamanho e a qualidade dos cristais existentes ou material cristalino 4-7. Esta abordagem é baseada na premissa de que uma condição que suporta nucleação de cristais pode não ser ideal para o crescimento de cristais posterior e vice-versa. Por transferência de material nucleadas de uma condição para outra, pode-se tentar separar efetivamente esses processos, dando assim acesso, espaço novo cristalização ainda tão pouco explorado,e, como resultado do aumento da taxa de sucesso total de uma experiência de rastreio. Métodos estabelecidos foram documentadas para (i) macroseeding, a transferência de um único cristal na sua totalidade a partir de um estado para outro 8, (ii) sequência de semeadura, a transferência de material em núcleos, geralmente obtidos através da aplicação de pressão, por exemplo, usando direccional suiça de um gato para a superfície de um cristal existente, seguido pela passagem subsequente do suiça através de uma nova gota cristalização 9, e (iii) microdispersão &quot;clássica&quot;, a transferência de cristais &quot;sementes&quot;, gerados pela colheita esmagado cristais (ou cristalino material), em condições semelhantes às que produziram as sementes 10. Notavelmente todos esses três métodos são demorados e pouco escalável, certamente em comparação com o que é possível com modernos robótica cristalização manipulação de líquidos. Esses fatores têm contribuído, em algum nível, pelo menos, para a percepção de que as sementesing é um método único para ser visitado quando outras abordagens falharam a dar frutos. Aleatório matriz microdispersão (MGR) é uma inovação metodológica recente que combina os benefícios da microdispersão tradicional com os de rastreio de alto rendimento e escalabilidade 11-13. Esta abordagem baseia-se na geração de um stock de sementes, produzido a partir de material cristalino nucleada, que podem ser divididas em alíquotas para / em cada sub-well/coverslip dentro de uma tela de cristalização de 96 condição padrão. Este método é aplicável tanto sentado ou pendurado experimentos de difusão de vapor de queda, criada à mão ou usando a robótica de manipulação de líquidos, em 24 poços ou formato de tabuleiro de 96 poços. MGR foi demonstrada experimentalmente para aumentar significativamente a taxa de sucesso de cristalização, e produzir cristais de melhor qualidade e maior quantidade de 11, 13, 14 de difracção, e representa uma ferramenta inovadora no arsenal dos cristalógrafos de abordagens no oNgoing esforço para o sucesso de cristalização. Aqui nós descrevemos um método geral para MGR e fornecer dados de exemplo que ilustram a eficácia desta técnica.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

Rastreio aleatório matriz microseed (MGR) é uma técnica de cristalização de proteínas, em que os cristais de semente são adicionados às telas aleatórios. Ao aumentar a probabilidade de que os cristais vai crescer na zona metaestável do diagrama de fases de uma proteína, leva cristalização extras são muitas vezes obtidos, a qualidade dos cristais produzidos poderá ser aumentado, e uma boa oferta de cristais para coleta de dados e experiências de imersão é fornecido. Aqui nós descrevemos um método geral para MGR que podem ser aplicadas a qualquer sentados gota ou pendurados experimentos de difusão de vapor de queda, criada à mão ou usando a robótica de manipulação de líquidos, em 96 poços ou formato de tabuleiro de 24 poços.

(A) Exemplo de um experimento MGR Para demonstrar a eficácia do rastreio MGR aplicamos este método para a cristalização de galinha lisozima de ovo branco (HEWL) e fígado bovino catalase (BLC). Ambos estes enzimas são eminentemente cristalizável e são estruturalmente alvos 15, 16, bem caracterizados. Como tal, tanto fornecer assuntos de teste excelentes com as quais ilustram a taxa de sucesso reforçada cristalização alcançável com MGR. Experimentos de cristalização fora...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Aqui nós descrevemos um método geral para triagem aleatória matriz microseed. Esta técnica é mostrado para aumentar significativamente a taxa de sucesso de proteína de cristalização experimentos de triagem, reduzir a necessidade de otimização, e fornecer um suprimento confiável de cristais para a coleta de dados e experimentos ligante de imersão.

Melhorar a taxa de sucesso de cristalização de proteínas pela Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

improving-success-rate-protein-crystallization-random-microseed

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K visualizações.  University of Bristol.  Aqui nós descrevemos um método geral para triagem aleatória matriz microseed. Esta técnica é mostrado para aumentar significativamente a taxa de sucesso de proteína de cristalização experimentos de triagem, reduzir a necessidade de otimização, e fornecer um suprimento confiável de cristais para a coleta de dados e experimentos ligante de imersão. 

Vídeo: Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Biologia

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Cristalização de proteínas para cristalografia de raios X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Detecção de Metaloproteinases da Matriz Funcional por zimografia

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristalização de proteínas da membrana lipídica em mesofases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimento cristalização de proteínas de membrana Usando o método Bicelle lipídico

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

Preparação do Mgm101 recombinação de proteínas por Estratégia Tagging baseado MBP

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...