Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust, Glaxosmithkline (GSK) eo Instituto Escocês de Sinalização Celular (agora parte da Fosforilação MRC e unidade ubiquitinação).

1. Ensaio Etapa de Desenvolvimento Nota: antes de iniciar a tela de siRNA, uma fase de desenvolvimento do ensaio é fundamental para definir os parâmetros importantes para a triagem com a linha de células repórter. É essencial investir esforço significativo nesta fase, pois isso contribuirá para o sucesso futuro da tela. <ol><li> Para caracterizar a capacidade de resposta de hipoxia o HRE-U20S linha de células repórter, crescer 2 x 75 cm dois frascos de células U20S-HRE a 80-90% de confluência em Dulbeccos Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de FBS. </li><li> Aspirar os meios de comunicação a partir de um frasco de células, lava-se duas vezes com 10 ml de PBS e separar as células por adição de 2 ml de solução de tripsina-EDTA a 0,05% e incubando a 37 ° C durante 5 min. Ressuspender as células em 8 ml de DMEM 10% FBS e pipeta-se para baixo e para criar uma suspensão de células homogéneas. </li><li> Pipetar 20 mL da suspensão a uma câmara de contagem de células, em duplicado, e inserir a câmara em um cou células automatizadonter. Clique em &quot;Imagem Display&quot; no software contador de células e assegurar que as células estão em foco. Clique em &quot;Contagem&quot; e tome nota da densidade celular. Repita este procedimento para o outro duplicado e calcular a densidade celular média. Dilui-se as células com DMEM FBS a 10% a uma concentração de 60.000 células / ml. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 100 ul (6000 células) das células de diluído para as mesmas três colunas (por exemplo, A5-H5, A6 e A7-H6-H7) de 5 placas estéreis de paredes brancas de 96 cavidades de ensaio, e a transferência humidificada a 37 ° C na incubadora de 5% de CO 2 durante a noite. Nota: estas placas vão ser usadas para determinar a produção de luciferase dependente da hipoxia para uma variedade de posições de hipoxia: 0 horas, 2 horas, 6 horas, 10 horas e 24 horas. </li><li> No final do dia seguinte, observar o tempo e adicionar a chapa de hipoxia de 24 horas para o conjunto da estação de trabalho para a hipoxia 1% de oxigénio. Na manhã seguinte, calcular o tempo de 10 horas, 6 horas e 2 horas antes do prato hr 24 deverá ser removido from a estação de trabalho de hipóxia. Nessas ocasiões, adicione a 10 horas, 6 horas e 2 placas de RH para a estação de trabalho de hipóxia. </li><li> Preparar 30 ml de 2 x tampão de lise de luciferase / ensaio combinado (50 mM Tris pH 7,8 fosfato; mM de MgCl 2 16; DTT 2 mM, 2% de Triton-X-100, 30% de glicerol; ATP 1 mM, 1% BSA, 0,25 mM luciferina e 8 uM de Na 4 P 2 O 7). Nota: adicionar os componentes na ordem indicada e permitir que a BSA, pelo menos, 30 minutos para se dissolver antes da adição de luciferina e Na 4 P 2 O 7. </li><li> Remover todas as placas a partir da estação de trabalho de hipoxia no momento apropriado. Adicionar 100 ul de tampão de lise de luciferase / 2x ensaio aos poços apropriados da placa de ensaio e cobrir com película transparente. Agitar as placas sobre um agitador de placas durante 10 minutos a 500 rpm para lisar completamente as células. </li><li> Transferir a pilha de placas para um sistema automatizado de 96 cavidades cremalheira placa luminómetro. Sob o menu &quot;Protocolos&quot;, selecione &quot;abs 595&quot; e destacar todos wells para ser lido na placa de mapa na tela no menu &quot;bem a seleção.&quot; Clique em &quot;Executar&quot; para medir a luminescência de cada poço, em seguida, calcular a média de leitura de cada placa. Calcule o fold-aumento dependente da hipóxia da atividade repórter dividindo a leitura média de cada placa hipóxia pela leitura média da normóxia (0 hr hipoxia) placa de controle. Nota: é essencial para observar uma resposta de luciferase dependente de hipoxia robusta para ser adequado para o rastreio. Um aumento de cinco a dez vezes na atividade de repórter é considerado excelente. </li><li> Criar uma placa de controle mestre que contém quatro alto controle (HIF1A siRNA) repetições (poços A1-D1), quatro baixo controle (FIH1 siRNA) replica (poços A12-D12), quatro tampão só controlar repetições (poços E1-H1) e quatro repetições de controlo siRNA não-alvo (E12-H12), onde todos os pools de siRNA estão a uma concentração de 200 nM. Nota: controles de altos e baixos são estabelecidos com base na via reguladores conhecidos que aumentam e DECRaliviar a resposta hipoxia, respectivamente. Em alternativa, o desenvolvimento de ensaio utilizando um subconjunto da biblioteca podem ser utilizados para identificar os controlos adequados. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, transferir 10 ml de cada um siRNA de controlo para uma placa de ensaio de paredes brancas estéril. Preparar a mistura de transfecção de reagente de transfecção de 0,1 mL em 10 ul de meio de soro reduzido (1:100) por poço, e a transferência de 10 uL de mistura de transfecção a cada poço de controlo. Pipeta cima e para baixo rapidamente para misturar, e deixar a placa em repouso por 20-60 min para permitir a formação de complexos de transfecção. </li><li> Prepara-se uma suspensão de células de 75.000 células / ml com o segundo balão de células U20S-HRE. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 80 ul (6000 células) de suspensão de células a cada mistura de transfecção. Transferir a placa para um incubador humidificado a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 24 horas, em seguida a transferência para uma estação de trabalho para uma hipoxia ainda mais 24 horas e realizar ensaios de luciferase, tal como descrito nas etapas 1.6-1.8. </li><li> Calcular o fator Z para os controles de alta e baixa, usando a fórmula Z = 1 - [3 x (desvio padrão de alto controle + desvio padrão de baixo controle) / (média de controle de alta - média de baixo controle)]. Nota: um valor de entre 0,5-1 indica uma excelente ensaio e deve ser esforçado para. </li></ol> 2. Tela Principal Nota: uma vez que estas condições alcalinas a partir da fase de desenvolvimento do ensaio estão no lugar, o ecrã primário pode ser realizado em triplicado, em formato de 96 poços da placa usando o seguinte protocolo. <ol><li> Grow 7 x 75 cm 2 frascos de células U20S-HRE a 80-90% de confluência em meio DMEM suplementado com 10% v / v de soro fetal bovino (FCS). Nota: os passos a seguir 2,2-2,13 deve ser levada a cabo no Dia 1. </li><li> Iniciar uma repetição através da preparação de uma placa de controlo principal contendo 200 ul de cada controlo, tal como descrito no passo 1.9 e de descongelamento para uma série de diluições do siRNA ubiquitome library por um período mínimo de 30 min. Nota: cada poço contém uma piscina de 4 siRNAs reunidos em 17 placas x 96 poços com colunas 1 e 12 deixados em branco para controles. </li><li> Em uma câmara de fluxo laminar, a etiqueta (ou código de barras) 17 placas de ensaio de paredes brancas estéreis com tampa de números 1-17, que corresponde a cada uma das placas da série biblioteca de siRNA. </li><li> Centrifugar a placa de controlo principal e o siRNA ubiquitome brevemente biblioteca (1 min a 2000 xg) para assegurar que todos os siRNAs se acumulam no fundo do poço. </li><li> Use um líquido dispensador automático para roboticamente &quot;selo&quot; 10 ml de cada controle da placa de controle principal para as placas de ensaio 17, utilizando-se o mesmo de 96 poços pilha dica para cada placa. </li><li> Usando um de 96 poços frescas pilha ponta de cada uma das placas da biblioteca 17, a transferência de 10 uL de cada ubiquitome siRNA para a sua placa de ensaio correspondente, utilizando um dispensador de líquido automatizado. </li><li> Preparar 40 ml de reagente de transfecção para as 17 placas de ensaio utilizando os es ráciolecido em 1.10. Nota: isto inclui um adicional de 20 ml para explicar o &quot;volume morto&quot; no distribuidor celular. O &quot;volume morto&quot; refere-se ao volume de líquido continuamente presente no interior da rede de tubagem para o dispensador de células. </li><li> Usar um dispensador de células automatizado para transferir 10 ul de reagente de transfecção a cada poço nas placas de ensaio 17. Agitar rapidamente as placas de ensaio num agitador (1 min a 500 rpm) para permitir que a mistura completa do siRNA e reagentes de transfecção, em seguida, deixar ainda à temperatura ambiente durante 20-60 minutos para permitir que o siRNA: reagente de transfecção a formação do complexo. </li><li> Lavar duas 75 centímetros dois frascos de células U20S-HRE duas vezes com 10 ml de PBS e destacam com 2 ml de tripsina-EDTA, a 37 ° C durante 5 min. Adicionar 8 mL de DMEM 10% FBS a cada balão e pipeta cima e para baixo várias vezes para criar uma suspensão de células homogéneas. Combinar as células de ambos os frascos e transferir para um tubo de 50 ml de plástico estéril. </li><li> Calcular a concentração de células por pipetagem20 ul de células em duplicado a uma câmara de contagem de células e calcular a concentração de célula média de duas leituras do contador de células automatizado como descrito no passo 1.3. </li><li> Preparar 155 ml de suspensão de células por diluição com meio DMEM FBS a 10% a uma concentração de 75.000 células por ml, em um recipiente de plástico estéril. Nota: este volume é suficiente para 17 placas e inclui um adicional de 25 ml de volume morto no distribuidor célula. </li><li> Adicionar um agitador magnético estéril à suspensão de células e colocar em um agitador configurado no interior da câmara de fluxo laminar, para limitar a acumulação de células. Equilibrar o dispensador de células automatizado com a suspensão celular e configurá-lo para dispensar 80 mL de células por poço (6.000 células). </li><li> Colocar cada uma das 17 placas, por sua vez, para o distribuidor de células automático e dispensar as células. Gravar a hora e as placas da pilha, em grupos de 5, em seguida, colocar as pilhas num húmido 37 ° C numa estufa a 5% de CO 2 durante 24 horas. Nota: a concentração final desiRNA piscina será de 20 nM em 100 ul de volume total. Nota: os passos a seguir 2,14-2,15 deve ser levada a cabo no Dia 2. </li><li> Inicie a segunda réplica no dia 2, seguindo o procedimento descrito no Dia 1 para replicar 1 (2,2-2,13). </li><li> Após 24 horas de transfecção, placas de transferência de replicar 1 em um ambiente estéril para uma estação de trabalho hipóxia fixado em 1% de oxigênio e deixe por 24 horas para induzir o repórter HRE. Nota: os passos a seguir 2,16-2,20 deve ser realizada no dia 3. </li><li> Inicia a terceira réplica, seguindo o procedimento descrito no Dia 1 para replicar 1 (2,2-2,13). </li><li> Após 24 horas de transfecção, placas de transferência de replicar 2 em um ambiente estéril para uma estação de trabalho hipóxia fixado em 1% de oxigênio e deixe por 24 horas para induzir o repórter HRE. </li><li> Duas horas antes de replicar uma placas estão a ser removidos da estação de trabalho de hipoxia, preparar 200 ml de tampão de lise 2x luciferase / ensaio como descrito em 1.6. Nota: este volumemente, incluem um adicional de 20 ml para assegurar o reservatório tampão permanece bem coberto. </li><li> Retirar replicar uma placas de ensaio a partir da estação de trabalho depois de exposição a hipoxia hipoxia e 24 horas utilizando um dispensador de líquido automatizado, adicionar 100 mL de tampão de lise 2x luciferase / ensaio a cada placa de ensaio e cobrir com película transparente. </li><li> Agitar as placas sobre um agitador de células durante 10 minutos a 500 rpm para lisar completamente as células. Transferir cada placa em vez de um leitor de placa de luminómetro e ficha luminescência, tal como descrito na etapa 1.8. Nota: os passos a seguir 2,21-2,22 deve ser realizada no dia 4. </li><li> Após 24 horas de transfecção, placas de transferência de replicar 3 em um ambiente estéril para uma estação de trabalho hipóxia fixado em 1% de oxigênio e deixe por 24 horas para induzir o repórter HRE. </li><li> Leia a réplica 2 placas seguindo os passos 2,18-2,20 utilizados para replicar 1. Nota: o seguinte passo 2.23 deve ser levada a cabo no Dia 5. </li><li> Leia as réplicas 3 placas, seguindopasso 2,18-2,20 usado para replicar 1. </li><li> Compilar todos os 3 repetições da tela principal, e calcular o fator Z para cada placa usando a fórmula dada em 1.12. Nota: se qualquer placa tem um factor de Z de menos que 0,5, considerar repetindo esta placa para melhorar a qualidade dos dados. </li><li> O cálculo do coeficiente de variação (CV) para o alto e os controlos baixos, utilizando a seguinte fórmula: 100 x desvio padrão de controlo / média de controlo. Nota: CV deve ser tão baixo quanto possível, é razoável esperar variação de 10-15%. Se a variação é significativamente mais elevada, considere repetindo o prato. </li><li> Calcule por cento ativação de cada siRNA por placa utilizando a seguinte fórmula: [(média de alto controle - pontuação siRNA) / (média de controle de alta - média de baixo controle)] x 100 Além disso, o cálculo do não-alvo (NT. ) vezes de cada siRNA usando a fórmula [Amostra de dados / média de NT]. Para ambos os por cento de activação e NT-dobra, calcular a média dos três replicates e compilar os valores. </li><li> Utilizando os dados brutos, calcular Ranking coeficiente de correlação de Spearman (SRCC) para determinar o quão perto as três placas idênticas, correlacionar com a fórmula: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51572/51572eq1.jpg" width="120" /> onde r = SRCC; d = diferença entre os dois números em cada par de fileiras e n = número de pares de dados. Nota: uma boa correlação entre réplicas de placas vai dar valores próximos a 1 Se uma réplica apresenta baixa SRCC contra as outras duas placas, investigar e considerar repetir aquele prato.. </li><li> Decida qual siRNAs são de interesse suficiente para a triagem secundária (até 80). Empregar offs corte definidos pelo usuário (por exemplo, a seleção de todos os siRNAs mostrando menos de 5% ou mais de 95% de ativação por cento, ou menos de 0,5 NT vezes ou mais de 1,5 NT-fold) ou aplicar bioinformática ou raciocínio baseado em conhecimento para procurar aglomerados de atinge abrangidos pelo mesmo caminho Usama Bin Laden. Nota:normalmente, uma combinação destas abordagens determina que siRNA são tomados em rastreio secundário. </li></ol> 3. Tela secundária Nota: uma tela secundária de confirmação é realizada com base em um máximo de 80 siRNAs de interesse a partir da tela principal. Este número pode ser convenientemente levada a cabo com cada repetição banhado numa única placa de 96 poços com os controlos completos como por o ecrã primário (ver 2.2). É muito útil para confirmar que os reguladores identificados na tela principal reproducibly obter o mesmo fenótipo, e isso vai ajudar a refinar as decisões de triagem em que bate deve ser levada até a tela final terciário / deconvolução. <ol><li> Grow 1 x 75 cm 2 balão de células U20S-HRE a 80-90% de confluência em DMEM com 10% de FBS. </li><li> Anote o número da placa e localização dos acessos de tela primários e planear a sua nova localização no ecrã secundário cereja pegou placa mestre, deixando colunas 1, umad 12 livre para controles. Preparar a placa mestre de controlo como na secção 1.9, mas com um volume total de cada controlo de 50 ul. </li><li> Descongele uma segunda série de diluição da biblioteca ubiquitome (reservado para piscinas siRNA individuais cherry-picking) para um mínimo de 30 min. Centrifugar brevemente a placas (1 min a 2.000 xg), em seguida, adicionar 50 ul dos siRNAs tela secundária para seus novos locais de placa na cereja pegou placa mestre. </li><li> Realizar o ecrã secundário utilizando o mesmo protocolo de base descrito para o ecrã primário com as seguintes modificações: (a) executar todas as três repetições, no mesmo dia em uma placa de ensaio de cada repetição e (b) ajustar os volumes de reagentes em conformidade. </li></ol> 4. Terciário Tela / Deconvolution Nota: triagem terciário ou deconvolução é realizada em um máximo de 20 siRNAs a partir do ecrã secundário. Este passo é examinar o efeito do uso de cada siRNA knockdown indivíduo do poo originaisl de quatro. Normalmente, pelo menos, duas cadeias duplas de siRNA individuais de cada grupo deverá ilícito o mesmo fenótipo, que apresentam um grau de confiança razoável que o fenótipo observado não é devido ao siRNA efeitos fora do alvo. Para aumentar ainda mais a confiança nesta fase, ARNic em cadeia dupla individuais adicionais que visam o gene em questão pode ser projectado e testado quanto à sua capacidade para induzir o fenótipo determinado. Os resultados destas experiências pode então ser usado para calcular a pontuação de H, em que H = 0,6 ou mais (isto é, pelo menos 3 dos 5 siRNAs individuais induzir o fenótipo) é considerada aceitável 6. <ol><li> Crescer uma 75 centímetros 2 balão de células U20S-HRE a 80-90% de confluência em DMEM com 10% de FBS. </li><li> Criar um mapa da placa para a tela superior, planejando a localização dos quatro sobrados siRNA individuais de cada hit na placa mestre tela superior, deixando colunas 1 e 12 livre para controles. Prepare a placa mestre de controle como na 1.9, mas com um totalvolume de cada controlo de 50 ul. </li><li> Descongelar as placas desconvolução / siRNA individuais e adicionar 50 ul de os siRNAs individuais (200 nm) em cada poço da placa mestre tela terciário de acordo com o mapa da placa (4.2) para permitir a três repetições x 10 ul e um excesso de 20 ul confortável . </li><li> Efectuar a tela superior, usando o mesmo protocolo básico traçado para a tela principal com as seguintes modificações: (a) executar todas as três repetições, no mesmo dia em uma placa de ensaio por repetição e (b) ajustar os volumes de reagentes de acordo </li></ol> Nota: O ideal seria o limite para siRNA duplex individuais devem ser definidos ao mesmo rigor de corte como para a piscina. No entanto, pode ser aceitável para relaxar o limite de 10-20% por siRNA individuais, especialmente em que pelo menos um outro duplex cai dentro do limite definido. É vantajoso rolamento em mente que o efeito individual de siRNAs pode ser menor do que aa piscina, e, inversamente, em alguns casos, siRNAs individuais podem mostrar um efeito mais forte sobre o fenótipo celular isoladamente do que quando ela existe na piscina (mesmo quando a concentração é contabilizado).

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Os autores não têm nada a revelar.

O uso de telas siRNA ampla do genoma nas células de mamíferos tem provado ser extremamente útil na identificação de novos reguladores de vias biológicas distintas. Aqui, nós descrevemos o uso de um ecrã ubiquitome siRNA alvo para identificar reguladores da resposta celular mediada pelo HIF1A a hipóxia. Telas alvejados estão se tornando cada vez mais atraente como eles são geralmente mais barato, mais rápido, mais fácil de gerenciar e relatório apenas sobre os componentes da via em que os investigadores est...

Modificação de proteínas com ubiquitina e ubiquitina-like moléculas (UBLs) representa um sistema bioquímico expansivo que regula diversos caminhos biológicos e respostas ao estresse. A ligação covalente de UBLs para as suas proteínas alvo pode ter vários resultados que regulam a estabilidade, localização ou função interactoma do substrato 1. Foram estabelecidas as etapas enzimáticas subjacentes modificação UBL primeiro para ubiquitina, e agora servem como paradigma para a modificação com a maioria dos UBLs, incluindo SUMO, NEDD8, ISG15 e FAT10. Para a modificação ocorrer, o grupo carboxilato da diglicina motivo UBL é activado pela primeira vez por uma enzima E1 activação para formar um tiol de alta energia que é transferida para a cisteína do sítio activo de uma enzima de conjugação de E2. O E2 depois interage com uma ligase E3-bound substrato para mediar a transferência de LBM para (geralmente) um resíduo de lisina alvo criando uma cadeia ramificada (isopéptido) ligação 2. Rodadas sucessivas de modificação pode ocorrer para construir cadeias isopeptídicas sobre o substrato, o que para ubiquitina pode ocorrer através de qualquer uma de suas sete Usinas, ou através de sua metionina N-terminal para criar cadeias de ubiquitina lineares. Essas modificações formar topologias discretos com diversos fins, tais como a criação de novos motivos de interação e direcionamento de proteínas para a degradação antes da remoção UBL por proteases especializadas. No caso da ubiquitina existem duas enzimas E1, E2 enzimas de conjugação de 30-40, pelo menos, 600 E3 ligases e aproximadamente 100 enzimas deubiquitylating (DUBs). Enquanto os caminhos são menos expansivo para os outros 10 ou mais UBLs, a complexidade geral ubiquitome oferece enorme diversidade biológica no resultado de uma modificação especial Usama Bin Laden. No entanto, enquanto as principais avanços na biologia UBL têm sido feitas, as funções celulares precisas da maioria destes componentes ubiquitome permanecem desconhecidos. O uso de short interfering ácido ribonucleico (siRNAs) emergiu como uma ferramenta poderosa na genética inversa, devido à capacidade de siRNAs para alvejar especificamente mRNAs celulares para a destruição, permitindo que o papel dos genes individuais para ser analisada em diversos contextos biológicos 3. Telas do genoma inteiro têm sido utilizados para identificar e validar novos reguladores de muitos processos celulares, e criou uma riqueza de dados úteis acessível à comunidade científica em geral. No entanto, enquanto as telas de genomas inteiros já demonstrou ser extremamente útil, telas direcionados estão se tornando cada vez mais popular como eles são mais baratos, mais rápidos, envolvem menos de gerenciamento de dados e relatório apenas sobre os membros do genoma na qual o investigador é o mais interessado. Portanto, para entender melhor quais componentes da família processos celulares UBL estão envolvidos, nós compilamos uma biblioteca siRNA humano visando todos os conhecidos e os componentes do ubiquitome previsto. Isso inclui os UBLs, E1, E2 enzimas de activação conjugandoenzimas, ligases E3, domínio de ligação da ubiquitina (UBD) contendo proteínas e DUBs. Esta biblioteca pode ser utilizada para a tela de encontro a uma vasta gama de linhas de células repórter de problemas biológicas distintas, permitindo assim a identificação de componentes imparcial UBL novos regulam estas vias. O protocolo a seguir descreve como executar uma rigorosa siRNA direcionado ubiquitome tela para identificar novos reguladores da resposta dependente da HIF1A à hipóxia. Sob tensão normal de oxigênio, HIF1A está sujeita a hidroxilação prolyl que faz com que ela seja reconhecida e direcionada para a degradação pelo Von Hippel Lindau (VHL) E3 ligase complexo 4. Hipóxia inibe hidroxilação prolil levando à estabilização de HIF1A e sua subsequente ligação a elementos de resposta a hipoxia (Hres) para conduzir a expressão do gene. Aqui, nós descrevemos um ecrã usando células de osteosarcoma U20S estavelmente expressando a luciferase do pirilampo sob o controlo de três cópias em tandem da HyElemento de Resposta poxia (células U20S-HRE) 5. Este protocolo pode ser adaptado para qualquer via biológica se uma leitura robusta de actividade repórter é viável e pode ser acoplado com os controlos positivos e negativos adequados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:288px;">Automated Liquid Dispenser</td>
			<td style="width:147px;">Fluid-X</td>
			<td style="width:200px;">XPP-721</td>
			<td style="width:156px;">http://www.fluidx.eu/BIOTRACK/xpp-721-liquid-handling-system.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated cell counter</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>Cellometer Auto T4</td>
			<td>http://www.nexcelom.com/Cellometer-Auto-T4/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hypoxia Workstation</td>
			<td>Ruskin</td>
			<td>In vivo2 300</td>
			<td>http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Automated Cell Dispenser</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Matrix Wellmate</td>
			<td>http://www.matrixtechcorp.com/automated/pipetting.aspx?id=11</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Plate Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Titramax 1000</td>
			<td>http://www.heidolph-instruments.co.uk/products/shakers-mixers/platform-shakers/vibrating/titramax/titramax-1000/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Luminometer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Envision 2104 Multilabel Reader</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Family/ID/EnVision%20Multilabel%20Plate%20Readers</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">White Walled Assay Plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655083</td>
			<td>http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/37_11/13221/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Clear Plate Film</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>1450-461</td>
			<td>http://www.perkinelmer.co.uk/Catalog/Product/ID/1450-461</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Name of the Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">siRNA library</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>On-Target Plus</td>
			<td>http://www.thermoscientificbio.com/rnai-and-custom-rna-synthesis/sirna/on-targetplus-sirna/search-gene/</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Transfection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Lipofectamine RNAimax</td>
			<td>http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Transfection-Selection/lipofectamine-rnaimx.html</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reduced Serum Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Optimem</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/31985062?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/product/41965039#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044?ICID=search-product#</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tryspin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054?ICID=search-product#</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sirna screening to identify ubiquitin and ubiquitin-like system regulators of biological pathways in cultured mammalian cells

Modificação pós-tradução de proteínas com ubiquitina e ubiquitina como moléculas (UBLs) está a emergir como uma rede de sinalização celular dinâmica que regula diversos processos biológicos incluindo a resposta a hipoxia, Proteostase, a resposta a danos no ADN e a transcrição. Para entender melhor como UBLs regular caminhos relevantes para doenças humanas, nós compilamos uma siRNA humano &quot;ubiquitome&quot; biblioteca composta de 1.186 siRNA piscinas duplex segmentação todos conhecidos e componentes das vias do sistema UBL previsto. Esta biblioteca pode ser pesquisada contra uma gama de linhas de células que expressam os repórteres de diversas vias biológicas para determinar quais os componentes UBL actuam como reguladores positivos ou negativos da via em questão. Aqui, nós descrevemos um protocolo utilizando esta biblioteca para identificar ubiquitome-reguladores da resposta celular mediada pelo HIF1A a hipóxia através de um repórter de luciferase baseados em transcrição. Uma fase inicial de desenvolvimento do ensaioé realizado para estabelecer os parâmetros de rastreio adequados para a linha celular antes de realizar a tela em três fases: triagem / desconvolução primário, secundário e terciário. O uso de alvo sobre bibliotecas genoma siRNA inteiros está se tornando cada vez mais popular, pois oferece a vantagem de relatar apenas sobre os membros da via com a qual os pesquisadores estão mais interessados. Apesar das limitações inerentes de triagem siRNA, em particular falso-positivos causados ​​por siRNA fora do alvo efeitos, a identificação dos verdadeiros inovadores reguladores das vias em questão superam essas deficiências, que podem ser superados através da realização de uma série de experimentos de controle cuidadosamente desenvolvidas.

Antes do rastreio, a hipóxia-responsividade das células U20S-HRE é estabelecida. Células U20S-HRE expressar uma construção repórter consistindo de luciferase de vaga-lume fundido a jusante da três cópias em tandem do elemento de resposta a hipóxia, que é obrigado pelo heterodímero HIF1A/HIF1B após a exposição à hipóxia (Figura 1A). As células são colocadas numa estação de trabalho de hipoxia para uma série de vezes para estabelecer que a exposição a hipoxia produz a resposta mais...

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siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Aqui, descrevemos uma metodologia para realizar uma siRNA alvo &quot;ubiquitome&quot; tela para identificar romance ubiquitina e reguladores de ubiquitina-like da resposta celular mediada por HIF1A à hipóxia. Isto pode ser adaptado para qualquer via biológica, onde uma leitura robusta de actividade repórter está disponível.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

sirna-screening-to-identify-ubiquitin-ubiquitin-like-system

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K visualizações.  University of Dundee.  Aqui, descrevemos uma metodologia para realizar uma siRNA alvo "ubiquitome" tela para identificar romance ubiquitina e reguladores de ubiquitina-like da resposta celular mediada por HIF1A à hipóxia. Isto pode ser adaptado para qualquer via biológica, onde uma leitura robusta de actividade repórter está disponível. 

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Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biologia

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as small interfering RNAs (siRNAs). The short double-stranded RNAs originate from longer double stranded precursors by the activity of Dicer, a protein of the RNase III family of endonucleases. The resulting fragments are components of the RNA-induced silencing complex (RISC), directing it to the cognate target mRNA. RISC cleaves the target mRNA thereby reducing the expression of the encoded protein1,2,3. RNAi has become a powerful and widely used experimental method for loss of gene function studies in mammalian cells utilizing small interfering RNAs.
Currently two main methods are available for the production of small interfering RNAs. One method involves chemical synthesis, whereas an alternative method employs endonucleolytic cleavage of target specific long double-stranded RNAs by RNase III in vitro. Thereby, a diverse pool of siRNA-like oligonucleotides is produced which is also known as endoribonuclease-prepared siRNA or esiRNA. A comparison of efficacy of chemically derived siRNAs and esiRNAs shows that both triggers are potent in target-gene silencing. Differences can, however, be seen when comparing specificity. Many single chemically synthesized siRNAs produce prominent off-target effects, whereas the complex mixture inherent in esiRNAs leads to a more specific knockdown10.
In this study, we present the design of genome-scale MISSION esiRNA libraries and its utilization for RNAi screening exemplified by a DNA-content screen for the identification of genes involved in cell cycle progression. We show how to optimize the transfection protocol and the assay for screening in high throughput. We also demonstrate how large data-sets can be evaluated statistically and present methods to validate primary hits. Finally, we give potential starting points for further functional characterizations of validated hits.

Here we use a human esiRNA library in a high-throughput screen for genes involved in cell division. We demonstrate how to set up and conduct an esiRNA screens, as well as how to analyze and validate the results.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSÃO Pooled shRNA Screening Biblioteca em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi de triagem para identificar fenótipos pós-embrionário em C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...