Os autores agradecem Tom Robinson para leitura de prova do manuscrito, C. Bärtschi e H. Benz para a construção do sistema de controle de pressão custom-built. Gostaríamos também de agradecer o uso da instalação de sala limpa primeiro e Microscopia de Luz Center (LMC), ambos na ETH Zürich. O trabalho foi financiado pela Merck Serono e do Conselho Europeu de Investigação (ERC) no âmbito do 7 º Programa-Quadro (ERC Começando Grant, projeto n º. 203428, nμLIPIDs).

1. SU-8 Fabricação mestre Prepare dois moldes mestres para os canais (fluídicos e controle, para esquemas e dimensões veja a Figura 2) com o seguinte protocolo, mas com diferentes padrões de máscara. O processo é mostrado na Figura 3a. <ol><li> Começar por aquecimento de uma bolacha de silício de 4 polegadas por 10 min a 180 ° C. Carregue o wafer desidratado em um spin-coater e use o seguinte protocolo para spin-coating SU-8 de 2015: <ol><li> Gire wafer a 100 rpm por 20 s (tampa aberta de spin-coater, dispensar SU-8 durante esta etapa, feche a tampa depois da dispensa). </li><li> Wafer de rotação a 500 rpm durante 10 seg (isto vai espalhar a resistir ao longo de toda a bolacha). </li><li> Wafer de rotação a 1750 rpm durante 30 seg (define a altura do resistir a 20 um). </li></ol></li><li> Retirar resistir a partir da borda da pastilha com acetona (usar um cotonete) como esta vai ficar de outro modo para a placa de aquecimento no passo seguinte. Transfira a bolacha para ahotplate a 95 ° C e aquecer durante 4 min. Após a softbake, expor a resistir através de um photomask colado Sodalime vidro em um alinhador de máscara com luz UV (150 mJ / cm 2, medido a 365 nm). </li><li> Após a exposição, aquecer a bolacha novamente a 95 ° C durante 5 minutos numa placa de aquecimento. Refresque-se a hóstia para RT e depois mergulhe em um banho de SU-8 desenvolvedor para 4 min. Agite suavemente para remover não exposto SU-8. Lave o wafer com sala limpa classe isopropanol e seque com nitrogênio. Verifique sob um microscópio se o desenvolvimento foi bem sucedida (especialmente as armadilhas de células). Se as armadilhas de células estão completamente desenvolvidos, a reflexão da bolacha de silício deve ser visível. Se for necessário, realizar a bolacha de novo durante alguns minutos. </li><li> Cozer a bolacha numa estufa durante 2 horas a 180 ° C para remover todo o dissolvente residual. Verifique a altura dos canais com um perfilador passo. Se a altura é diferente da altura desejada, repita este protocolo começando no passo 1.1 com uma nova bolacha emudar o spin-velocidade (passo 1.1.3). Finalizar a fabricação do molde mestre de silanização o wafer com 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorodecilo-dimethylchloro-silano num exsicador durante a noite. </li></ol> 2. Fabricação Mestre para impressão microcontact <ol><li> De modo a preparar moldes de mestre para impressão microcontact, desidratar uma bolacha de silício de 10 min a 180 ° C. Gire-coat 1 ml HDMS para esta wafer a 7.500 rpm por 30 segundos (a resistir adere melhor a uma superfície silanizada). Spin-coat 2 ml de AZ1518 resistir positivo com este protocolo: <ol><li> Dispense estática da resistência sobre a bolacha. </li><li> Gire wafer por 5 segundos a 500 rpm. </li><li> Gire wafer por 60 segundos a 4000 rpm. </li></ol></li><li> Após 50 seg softbake a 100 ° C numa placa de aquecimento, expor a resistir à luz UV (21 mJ / cm 2 de 365 nm) através de uma fotomáscara e em um alinhador de máscara. Desenvolver a resistir em um banho de AZ 726 por 75 seg. Lavar o wafer desenvolvido com DI-água e golpe dry com nitrogênio. Remover o solvente residual por aquecimento da bolacha a 115 ° C durante 50 seg. Silanizadas a bolacha sob vácuo durante a noite. </li></ol> 3. Fabricação do chip microfluídico A concepção do dispositivo de duas camadas é utilizada para estas experiências. As duas camadas são preparadas separadamente e são ligados em conjunto, antes de o chip é finalmente ligado sobre uma lâmina de vidro (Figura 3b). Este passo descreve a produção de camadas de PDMS e o selo PDMS para impressão microcontacto. <ol><li> Prepare uma mistura de PDMS 10:01 e agente de cura. Prepare aproximadamente 80 g de PDMS no total (usando nossos projetos, isso irá resultar em 10 fichas). Misturar ambas as partes vigorosamente e desgaseifique os PDMS até que a mistura está livre de bolhas (~ 30 min). </li><li> Coloque o wafer com a camada de controle dentro de uma placa de Petri e fita-lo para o fundo. Em seguida, despejar ~ 50 g de PDMS em cima e colocar a bolacha durante pelo menos 2 horas numa estufa a 80 ° C para assegurar completacura do PDMS. Repetir o mesmo procedimento para a bolacha impressão microcontact, para este ~ 20 g PDMS é necessário. </li><li> Spin-revestimento PDMS sobre a bolacha com a camada fluidificada, a uma velocidade de rotação de 2000 rpm de modo a formar uma camada de elevada PDMS aproximadamente 40 pm. Curar o PDMS numa estufa durante pelo menos 1 hora a 80 ° C. </li><li> Quando as duas partes são curados, remover a camada de controlo da bolacha e cortado em pedaços com uma lâmina de barbear. Faça furos de conexão pressão usando uma biópsia perfurador de 1 mm. Para o armazenamento, é aconselhável colocar um pedaço de fita adesiva sobre os canais. </li><li> Para unir as duas camadas, tomar a hóstia spin-revestido e a parte de cima e colocá-los em um aspirador de plasma 23. Após o tratamento de plasma, alinhar rapidamente as duas partes em um microscópio com grande distância de trabalho. Adicione algumas peças PDMS em torno das peças principais colocados. Este passo não é obrigatório, no entanto, que facilita a remoção do PDMS da bolacha. Coloque a bolacha num forno a 80 ° C durante pelo menos 1 hr. </li><li> Usar um bisturi para remover cuidadosamente o PDMS da bolacha e para cortar os microchips. Faça furos de acesso para as ligações fluídicas com uma biópsia perfurador de 1,5 mm. </li><li> O chip PDMS está terminada e pode ser armazenado durante meses. Opcional: Se o chip é utilizado com um reservatório, cortar a parte superior de uma pipeta de ponta de 200 ul e utilizar alguns de reposição, PDMS semi-curado a mantê-la no topo. Colocar o chip no forno novamente a 80 ° C durante pelo menos 1 hr. </li></ol> 4. Colagem de lâmina de vidro Para usar o dispositivo para ensaios enzimáticos directos, a única etapa necessária após a ligação é o bloqueio das superfícies. Para este protocolo, proceder à A. No entanto, para usar o chip de microfluídica para imunoensaios ou ELISA, consulte o protocolo B para restringir os locais obrigatórios apenas para a lâmina de vidro (ou seja, para a microscopia TIRF ou SPR). Se essa restrição não é importante, referem-se a A, mas use conjugados biotinilados no passo 4.3 e continue com o passo 4.8no protocolo B para criar uma superfície totalmente funcional. Antes de realizar o protocolo A e B: É aconselhável filtrar todas as soluções de proteína utilizadas antes de os introduzir no chip. Detritos e agregados de proteína podem de outra forma bloquear armadilhas de células, reduzindo desse modo o número de câmaras, que podem ser utilizados para a análise. Para esta finalidade, utilizam uma unidade de filtro de absorção não proteico para filtrar todas as soluções antes de introduzi-las no interior dos canais. Um protocolo (ELISA) <ol><li> Para finalizar o dispositivo micro, unir as partes PDMS sobre uma lâmina de vidro. Para isso, em primeiro lugar limpar a lâmina de vidro com sabão, água destilada e etanol. Seque a lâmina utilizando uma corrente de azoto. Limpe a parte de PDMS com fita adesiva. </li><li> Coloque a parte PDMS ea lâmina de vidro limpa para o limpador de plasma por 45 segundos a 18 W. Para assegurar uma ligação apertada, colocar o chip em uma placa quente (100 ° C) por 5 min. </li><li> Após a colagem, preencher o chip com fLUIDs. Uma maneira fácil de fazer isso é usar a força centrífuga. Corte a parte inferior de 200 mL ponteira. Para os canais de fluidos, enchê-los com a solução de bloqueio (albumina de soro de bovino (4% w / v), ou poli-L-lisina) glicol de polietileno enxertado (0,05% w / v) e colocar as pontas para as entradas. Encha as entradas de controlo de camada com água ou com uma solução isosmótica, por exemplo, PBS. Colocar o chip no centrifugador (800 xg) durante 5 min. Os canais devem ser agora preenchido com fluido completamente. Se não, repita este passo. </li><li> Incubar a solução de bloqueio durante, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente. Lava-se a solução para fora da camada de fluido com PBS a uma taxa de fluxo de 10 mL / min usando uma bomba de seringa. O dispositivo está pronto para experimentos com células. </li></ol> Protocolo B (imunoensaios) Para uma visão completa da modificação da superfície do passo 4.7 em diante, por favor, consulte a Tabela 1. <ol start="5"><li> EmPDMS Cubate selos para impressão microcontact com uma solução BBSA / BSA (por exemplo, 1-100). Após 30 min, limpar os selos cuidadosamente com água destilada e secar o selo, sob uma corrente de azoto. Colocar rapidamente os selos em uma lâmina de vidro limpa (Figura 4). </li><li> Expor a lâmina de vidro com o selo junto com a parte superior do chip microfluídico de plasma de oxigênio por 45 s na potência máxima (18 W) em um aspirador de plasma. Após o tratamento por plasma, remover o selo e alinhar a superfície impressa debaixo microchambers do dispositivo. Colocar o chip durante 30 min sobre uma placa quente a 50 ° C. </li><li> Para bloquear a superfície restante, introduzir solução esterilizada por filtração de BSA (4% (w / v) em PBS) para o chip com uma centrífuga (ver passo 4.2). Incubar durante 1 hora e lava-se a solução para fora da camada de fluido com PBS (ver passo 4.3). O chip pode, então, ser utilizada directamente ou armazenada durante cerca de 2 semanas a 4 ° C numa caixa húmida. </li><li> Para um surfac ligação totalmente funcionale, introduzir avidina (0,025% (w / v) em PBS) para dentro do reservatório. Use uma taxa de fluxo de 5 ul / min durante 30 minutos para retirar a solução de avidina através dos canais de fluído. Depois, lave PBS durante 10 min. Lave o reservatório completamente. </li><li> Em seguida, adicionar Proteína G (0,0025% (w / v) em PBS) e lave durante mais 30 min. Lavar com PBS durante mais 10 min depois. Em seguida, adicionar o anticorpo de interesse (0,0001% (w / v) em PBS) durante 10 min. Depois de 10 minutos, interromper o fluxo durante 15 minutos para permitir a ligação. Em seguida, lava-se com PBS durante 10 min. </li></ol> 5. Experimentos com células O protocolo é escrito em termos gerais, por causa da variedade de possíveis ensaios. Como um exemplo, os reagentes necessários para o ensaio de toxicidade de G6PDH são dadas. A célula prendendo eficiência inicial do aparelho é de cerca de 2,5%, ou seja, 5 de 200 células será preso. A ocupação final das armadilhas de células depende fortemente da linha celular utilizada, o protocolo para suspendera linha de células e o tempo que as células são lavadas por meio do canal. Para as células que crescem naturalmente em suspensão (por exemplo, U937), células isoladas pode ser encontrada em cerca de 75% das câmaras após alguns minutos. As outras câmaras ou não são preenchidas, ou ocupados por duas ou mais células. Em geral, a ocupação de uma única célula é menor para as linhas de células aderentes. Quando se utiliza o protocolo de suspensão bastante leve aqui apresentado, a percentagem diminui para cerca de 30% (HEK, células MLT). A ocupação de uma única célula pode ser melhorada por tratamento com tripsina das células, mas esta pode também alterar os resultados das experiências. Dependendo da molécula alvo, a adsorção ou a absorção de PDMS pode influenciar os resultados. Adsorção pode ser reduzida através do bloqueio das superfícies com a BSA ou PLL-g-PEG. A absorção é improvável para a maioria das biomoléculas hidrofílicas, mas deve ser verificado para os componentes celulares lipofílicos (pequenas). <ol><li> Preparar as células de acordo com o protocolo específico (por exemplo, </em&gt; Além da droga). Para células em suspensão, adicionar células diretamente para o chip. Para as linhas de células adesivas, usar tampão de dissociação isento de enzima para produzir uma suspensão de células. Filtrar as células antes de introduzi-los para o chip para reduzir a quantidade de agregados de células. </li><li> Carregar as células para o chip utilizando uma bomba de seringa e de fluxo para a frente, em vez de se retirar a suspensão de células. Use uma taxa de fluxo de 5 ul / min para as linhas de células de suspensão e maiores taxas de fluxo de 10-20 mL / min para as células adesivas uma vez que a redução de fixação não específica das células nas paredes do canal. </li><li> Quando as armadilhas são preenchidos, feche as câmaras. Se várias células aderir de forma não específica à superfície, tentar lavá-los com um tampão de dissociação celular, a uma taxa de fluxo de 10-30 mL / min. </li></ol> Um protocolo (ELISA) <ol start="4"><li> Retirar tampão de lise através do chip. Para este exemplo, este tampão é um tampão com hypoosmolar adicionado Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM de KCl, 1,5 mM MgCl2, 1% (v / v) de Tween 20). Para a lise, as câmaras rapidamente abrir e fechar (ou seja, 500 ms para as taxas de fluxo de 10-50 mL / min 7,21). Para o ensaio de G6PDH, adicionar 2 mM de glicose-6-fosfato, NADP 0,5 mM, 0,5 U / ml de diaforase e 0,3 mM de resazurina para o tampão de lise. Inicie o controlo da cinética da reacção imediatamente após a lise. </li></ol> Nota: Escolha qualquer tampão, que é adequado para o ensaio, no entanto ter em mente que os detergentes fortes (como Triton, SDS) lise das celulas imediatamente e vai levar a uma perda de analito durante a abertura da câmara. Protocolo B (imunoensaios) Para uma breve descrição das experiências de ELISA de células (taxas de fluxo, status de câmara, etc), por favor, consulte a Tabela 1. <ol start="5"><li> Para ELISA, adicionar o reagente de detecção é necessária (por exemplo, o anticorpo secundário, o antigénio marcado) directamente para o tampão de lise. O aqui adicionado Tween 20 reduz a adsorção não específica. Lise das células de acordo com o passo 5.4. Incubar a mistura durante 10-15 minutos para permitir a ligação do (tempo de incubação de acordo com o antigénio e o anticorpo utilizado). </li><li> Conjugados de enzimas e anticorpos que adsorvido inespecificamente as paredes do canal pode conduzir a uma conversão do reagente de detecção, já no interior do reservatório e canais. Para reduzir os riscos de o processo de adsorção, lave um inibidor estável da enzima de detecção utilizado através do chip durante o tempo de incubação (câmaras fechadas, antes da adição do reagente de detecção). Para HRP, use HCl 20 mM em água para inativar as enzimas permanentemente inespecífica adsorvido. </li><li> Após o tempo de incubação, introduzir o reagente de detecção (por exemplo, Vermelho Amplex e peróxido de hidrogénio para HRP) para o chip. Abrir as câmaras logo novamente para lavar o anticorpo secundário nonbound longe e para adicionar o reagente de detecção. Inicie o controlo da cinética da reacção imediatamente. </li><li> Calibração: Imobilizaro anticorpo contra o alvo de interesse. Fechar câmaras. Prepare a diferentes concentrações de analito em tampão ou em lisado de células fora do chip. Aplique uma concentração para o chip e trocar rapidamente o volume dentro das câmaras (500 ms de tempo de abertura). Este tempo de abertura é suficientemente curto para assegurar que não ocorre acumulação adicional de analito de lavagem, e apenas um número específico de moléculas a partir do volume da microcâmara são detectados. A partir da concentração conhecida do antigénio no interior da solução e o volume da câmara (625 pl), calcular a quantidade dentro da câmara. Em seguida, continue com o passo 5.5 e introduzir a porção de detecção. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Tecnologia microfluídica abriu novas e fascinantes possibilidades de análise de uma única célula. Em particular, a possibilidade de capturar e imobilizar células individualmente por ferramentas microfluídicos tem permitido estudos sistemáticos de curto e longo prazo sobre as propriedades de uma única célula e resposta. Além disso, a encapsulação de células em microgotículas de alta frequência, gerados por um circuito integrado, permitiu estudos de secreção de células individuais, que não podem ser rea...

Muitos estudos no passado revelaram diferenças célula-a-célula dentro de uma população de células grandes 1-3, em particular os processos de sinalização 4, ou as quantidades de biomoléculas intracelulares, tais como proteínas, metabolitos 5,6, 7,8 e cofactores. Estas heterogeneidades são considerados fundamentalmente importante para a adaptação e evolução de 9 células, mas também desempenham um papel chave na emergência e tratamento de doenças como o cancro 10-13. Portanto, os estudos sobre o nível de uma única célula são de grande interesse na pesquisa biológica e farmacológica, principalmente se esses estudos revelam as diferentes respostas de células após o tratamento com substâncias químicas bioativas. Nos últimos anos, muitas plataformas de análise foram desenvolvidos para facilitar a análise de células vivas individuais ou a composição química do conteúdo da célula. Embora células fluorescentes ativadas (FACS) é o ouro ruaandard para análise muito maior taxa de transferência de células vivas individuais, o método não pode ser utilizado para a quantificação de compostos intracelulares ou segregadas. O surgimento de plataformas microfluídicos prometeu novas estratégias analíticas de posicionamento, tratamento e observação de células individuais. Um marco na microfluídica foi alcançado com a integração das válvulas PDMS flexíveis realizados por Quake e colegas de trabalho 14,15. Estas válvulas são úteis, pois podem isolar regiões no chip, por exemplo, separar duas culturas 16. Além disso, são especialmente aplicável para a análise de uma única célula e, portanto, ajudar a reduzir os problemas de diluição de analitos. O poder desta abordagem para a análise de uma única célula foi recentemente demonstrado por Hansen e colegas de trabalho, que analisou a expressão gênica de centenas de células individuais em paralelo 17. Ao alvejar proteínas e metabolitos, a análise é muito difícil devido à falta de uma adequadamétodos mplification, o grande número de compostos diferentes presentes, e suas variações de natureza química. Além disso, a maioria das biomoléculas intracelulares espera-se estar presente em número de cópias baixo, na ordem de algumas dezenas de milhar de 18, portanto, o método analítico utilizado deve possuir uma sensibilidade elevada. Os ensaios mais potentes, tais como imunoensaios e ensaios imunológicos ligados a enzimas (ELISA), são difíceis de integrar em dispositivos de microfluidos, uma vez que requerem vários passos de lavagem e de incubação, assim como a imobilização de superfície. Devido a estes desafios, não é surpreendente que apenas alguns exemplos em que foram reportados foram quantificadas proteínas ou metabolitos no nível de uma única célula. Por exemplo, estudos sobre a secreção de compostos fluorescentes têm sido relatados 19,20. Recentemente, a aplicação de ELISA, foi apresentado para a análise de secretadas (não fluorescentes) proteínas de uma cultura de células (células THP-1) 21 e único (immune) células 10. Segmentação de proteínas intracelulares, Shi et al. Desenvolvido um dispositivo de microfluidos, que facilitou a identificação de proteínas intracelulares para a análise das vias de sinalização nas células tumorais por meio de um imunoensaio 11. No entanto, apenas as quantidades relativas de proteínas foram determinadas e sem amplificação enzimática foi utilizada para aumentar o sinal para as proteínas de baixa abundância. Recentemente, fomos capazes de combinar uma microdispositivo trapping de uma única célula com ensaios de fluorescência 8 e imunoensaios 22 (Figura 1). As células são passivamente preso em estruturas obstáculo micronizada, o que permite a oferta ea (rápida) troca de médio e outros agentes químicos, sem qualquer movimento das células. Uma válvula em forma de anel em torno de cada armadilha permite o isolamento da célula em um volume muito pequeno (&quot;microcâmara&quot;). Esta válvula é acionada imediatamente após a introdução de um tampão de lise celular (hypoosmolar), eledno impedindo moléculas intracelulares ou moléculas secretadas para difundir para longe. Mais importante, devido ao pequeno tamanho do volume (625 pl) grande diluição das moléculas é evitado. Além disso, uma vez que a lise e de análise são realizadas no na mesma posição no chip, não há qualquer perda de substância a analisar devido ao transporte. O design de chips aqui descrito compreende 8 linhas alternadas de ambos os 7 ou 8 microchambers, totalizando 60 microchambers. As câmaras são acionados em linhas, de modo que a contaminação cruzada ao longo de uma linha está impedida. A plataforma pode ser utilizada em combinação com ensaios de fluorescência, bem como ensaios imunológicos (Figura 1d). Para este último, que estabeleceu protocolos para a imobilização dos anticorpos, que são compatíveis com a produção de chips e processo de montagem. Daí a plataforma abre o caminho para ensaios sensíveis, confiáveis ​​e quantificáveis ​​ao nível de célula única. Até agora, temos usado o dispositivo para a análise de ienzimas ntracellular e secretadas (quantificação relativa por ensaios enzimáticos), co-fatores intracelulares, proteínas e pequenas moléculas (quantificação absoluta por ensaios de ponto de extremidade ou ELISA). No que se segue, descreve-se o processo de fabricação de chips por meio de litografia suave multicamadas e os protocolos para a modelação dos anticorpos por meio de impressão microcontact e química de superfície. Além disso, alguns exemplos de utilização e as operações de chip são dadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:344px;">REAGENTS:</td>
			<td style="width:284px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Name of the Reagent</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">SU-8 2015</td>
			<td style="width:284px;">MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane</td>
			<td style="width:284px;">ABCR (Karlsruhe, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">AB103608</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">4-Methylumbelliferyl &#946;-D-N,N&#8242;-diacetylchitobioside hydrate</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">M9763</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Acetone</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">100014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Avidin</td>
			<td style="width:284px;">AppliChem (Axon Lab AG)</td>
			<td style="width:103px;">A-2568</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 1518</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">AZ 726 developer</td>
			<td style="width:284px;">AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-4503</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Bovine serum albumin, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">A-8549</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell dissociation buffer</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">13151-014</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hexamethyldisilazane (HDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:103px;">40215</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">84422</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:284px;">Merck VWR (Darmstadt, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">109634</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">63068</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MR developer 600</td>
			<td style="width:284px;">Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PBS</td>
			<td style="width:284px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">10010-031</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">PLL-g-PEG grafted biotin</td>
			<td style="width:284px;">SuSoS, (D&#252;bendorf, Switzerland)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:284px;">Fluka</td>
			<td style="width:103px;">60132</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Protein G, biotin</td>
			<td style="width:284px;">Sigma Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">41624</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Silicon wafer</td>
			<td style="width:284px;">Si-Mat (Kaufering, Germany)</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td style="width:284px;">Dow Corning</td>
			<td>39100000</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tris(hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1610716</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Tween 20</td>
			<td style="width:284px;">Biorad</td>
			<td style="width:103px;">1706531</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:344px;">Material Name</td>
			<td style="width:284px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:153px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">0.22 &#181;m PES syringe filter</td>
			<td style="width:284px;">TRP</td>
			<td style="width:103px;">99722</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">1/1.5 mm biopsy puncher</td>
			<td style="width:284px;">Miltex, York PA</td>
			<td style="width:103px;">33-31AA/33-31A</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Cell Trics filter 20 &#181;m</td>
			<td style="width:284px;">Partec</td>
			<td style="width:103px;">04-004-2325</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Centrifuge Sigma 3-18K</td>
			<td style="width:284px;">Kuehner</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Hotplate HP 160 III BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">MA-6 mask aligner</td>
			<td style="width:284px;">Karl Suess</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Multizoom AZ100M microscope</td>
			<td style="width:284px;">Nikon Corporation</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Photomask</td>
			<td style="width:284px;">Microlitho, Essex, U.K.</td>
			<td style="width:103px;">n.a</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Plasma Cleaner PDC-32G</td>
			<td style="width:284px;">Harrick</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td>
			<td style="width:284px;">Laurell</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Spin Modules SM 180 BM</td>
			<td style="width:284px;">Sawatec, Sax, Switzerland</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Step profiler Dektak XT Advanced</td>
			<td style="width:284px;">Bruker</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:344px;">Syringe pump neMESYS</td>
			<td style="width:284px;">Cetoni</td>
			<td style="width:103px;">n.a.</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells

Apresenta-se um dispositivo de microfluidos, que permite a determinação quantitativa de biomoléculas intracelulares em várias células individuais em paralelo. Para este efeito, as células são passivamente preso no meio de uma microcâmara. Após a activação da camada de controlo, a célula é isolado a partir do volume em torno de uma pequena câmara. O volume circundante podem ser trocados sem afetar a célula isolada. No entanto, aquando da abertura e fecho curto da câmara, a solução na câmara pode ser substituído dentro de algumas centenas de milisegundos. Devido à reversibilidade das câmaras, as células podem ser expostas a soluções diferentes sequencialmente, de uma forma altamente controlável, por exemplo por incubação, lavagem, e finalmente, a lise celular. Microchambers hermeticamente seladas permitir a retenção do ligado, minimizar e controlar a diluição após a lise celular. Uma vez que a lise e análise ocorrer no mesmo local, de alta sensibilidade é mantida porque não mais dilution ou perda dos analitos ocorre durante o transporte. Por isso, o projeto MicroChamber permite a análise confiável e reprodutível de números muito pequenos de cópia de moléculas intracelulares (atomoles, zeptomoles) liberadas a partir de células individuais. Além disso, muitos microchambers podem ser dispostos num formato de matriz, permitindo a análise de muitas células de uma só vez, uma vez que os instrumentos ópticos adequados são usadas para a monitorização. Nós já usou a plataforma para estudos de prova de conceito para analisar proteínas intracelulares, enzimas, cofatores e segundos mensageiros em forma quantificável relativo ou absoluto.

Nossa plataforma é capaz de analisar uma variedade de intracelular, bem como moléculas segregadas presentes em ou produzidos por células individuais. Aqui, nós gostaríamos de apresentar diferentes estudos exemplo para sublinhar a variedade de possíveis ensaios. Vamos dar um exemplo, para uma enzima secretada (Figura 5a), bem como uma enzima intracelular (Figura 5b) e de proteína (Figuras 5c e d). Para mais exemplos, como cofatores ou pequenas mol...

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A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K visualizações.  ETH Zurich, Switzerland.  Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios. 

Vídeo: A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Bioengenharia

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

A Armadilha hidrodinâmica microfluídicos baseados em partículas individuais

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Um chip microfluídico para ICPMS Amostra Introdução

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

O Chip Multi-organ - Uma plataforma microfluídica para longo prazo Coculture Multi-tecidos

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

Electrotaxis Estudos de pulmão células de câncer usando um Multichannel Dual-elétrico-campo Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

Projetando microfluídicos para Estudar respostas celulares Sob único ou coexistindo Chemical / Elétrica / tensão de cisalhamento Estímulos

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Um método versátil de padronização proteínas e células

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...