A doença cardiovascular é a principal causa de morte em todo o mundo. Modelos de mouse são ferramentas úteis para estudar esta doença e nosso protocolo pode ser usado para quantificar aterosclerose em camundongos. Usando este protocolo, o tamanho da lesão pode ser medido em três locais vasculares.
A raiz aórtica, o arco aórtico e a artéria braquiocefálica. A quantificação da aterosclerose em camundongos pode ser uma tarefa tediosa. Fornecemos passos detalhados que esperamos que possam acelerar o processo.
Alguns desses passos são difíceis de descrever por escrito. Esperamos que este vídeo o ajude a obter uma análise robusta do tamanho da lesão aterosclerótica. Depois de colher um coração de rato de acordo com os protocolos padrão, coloque o coração em uma cama de cortiça, lado ventral para cima sob um microscópio dissecando e use uma agulha para fixar o coração na rolha através do ápice.
Segurando a base do coração com fórceps anatômicos, use um bisturi mantido em um ângulo de 20 graus caudalmente no plano sagital, e 20 graus cranialmente no plano transversal, para cortar os dois terços apical do coração. Incorpore a raiz aórtica e a base do coração no composto de temperatura de corte ideal, ou OCT, e aperte suavemente o coração com as fórceps para encher a raiz aórtica com composto e remover quaisquer bolhas de ar. Transfira o espécime para o fundo de uma criomoldeada cheia de OCT com a raiz aórtica perpendicular à superfície inferior e congele o composto em gelo seco.
Em seguida, armazene a amostra de tecido em um saco congelador a menos 80 graus Celsius até que a criosectioning. Para preparar uma cama fixa para análise facial, dobre um segmento de filme de cera de parafina oito vezes para fazer uma superfície plana de 25 por 25 mm e enrole fita de isolamento elétrica preta ao redor do filme para fazer um fundo escuro para a aorta. Coloque uma etiqueta na parte de trás da cama de fixação e use um lápis de chumbo para gravar o número de identificação do mouse.
Transfira o arco aórtico para a cama de fixação e adicione uma gota de PBS ao tecido. Usando um microscópio estéreo, limpe a aorta do tecido adiposo periadventicional restante e use tesouras Vannas e fórceps Dumont para descascar suavemente todo o tecido adiposo circundante sem manipular ou danificar a aorta. Em seguida, introduza a tesoura Vannas no lúmen aórtico para expor a superfície intimal.
Comece a cortar a curvatura externa do arco ascendente na direção distal, continuando a cortar os galhos, incluindo a artéria braquiocefálica e poupando a parte dorsal da região torácica descendente. Para exibir a superfície intimal, abra a curvatura menor e abra a aorta. Usando um suporte de agulha micro Castroviejo, fixe o arco aberto na cama de fixação com a extremidade cega dos pinos de insetos minuten sem esticar o espécime, dobrando suavemente os pinos para longe do espécime enquanto o tecido é mantido no lugar.
Em seguida, armazene o arco preso de cara para baixo em uma placa de Petri de PBS a quatro graus Celsius. Para a coloração do Sudão IV, enxágue o espécime por cinco minutos em uma placa de Petri de 70% de etanol com o arco virado para baixo, antes de transferir o espécime para uma placa de solução de trabalho do Sudão IV por sete minutos. No final da incubação, enxágue a amostra com duas lavagens de três minutos em 80% de etanol para desal manchar a superfície intimal normal, seguida de uma lavagem final na PBS antes de devolver o tecido à sua placa de Petri original.
Em seguida, adquira micrografias sob um microscópio estéreo conectado a uma câmera digital em uma ampliação de 10X, obtendo imagens do arco preso submerso na PBS, usando pequenos pesos metálicos para segurar a cama fixando no fundo da placa de Petri. Para obter crioseções da raiz aórtica incorporada, coloque a temperatura criostata para menos 20 graus Celsius e a espessura da seção para 10 micrômetros. Monte o bloco OCT contendo a raiz aórtica no suporte do espécime com o tecido ventricular voltado para fora.
Garanta o posicionamento com algum OCT adicional, se necessário. A raiz aórtica deve agora ser posicionada perpendicular à lâmina da faca. Colete as seções de controle iniciais contendo tecido muscular cardíaco em lâminas de microscópio comuns, verificando a progressão através do tecido a cada 200 micrômetros sob um microscópio leve.
Quando a primeira cústica aórtica aparecer, incline o espécime em direção ao ponto zero para alinhar o plano de seção com as duas outras bordas e conte cada seção de 10 micrômetros que é cortada do ponto zero em diante. Comece a coletar seções para análise a partir de 90 micrômetros e em diante de acordo com o slide planejado, até que 800 micrômetros a partir do ponto zero tenha sido atingido. O cálculo da fração da lesão da área total do vaso da raiz aórtica torna os dados menos sensíveis a possíveis diferenças de ângulo durante a secção.
Além disso, pode ser ilustrativo calcular a área sob a curva ou o tamanho da lesão atheroto por mouse e apresentar os dados em um gráfico de pontos para visualizar ainda mais variações individuais dentro dos grupos. O acúmulo lipídico lesão pode ser quantificado por manchas de óleo vermelhas O áreas positivas da área total da lesão. As artérias coronárias direita e esquerda geralmente divergem da aorta em torno de 250 micrômetros do seio aórtico que muitas vezes coincide com os tamanhos mais proeminentes da lesão.
Remover o fundo escuro em imagens representativas dos arcos aórticos en face pode melhorar a exibição visual. O tamanho da lesão é normalmente distribuído em grupos, permitindo a análise estatística usando o teste t do aluno entre os grupos. Recomendamos praticar com algum material de teste até que você tenha obtido habilidades suficientes para processar suas amostras experimentais.
Se o tamanho da lesão for diferente entre os grupos, você deve determinar o mecanismo, pois uma análise de composição da lesão geralmente é o próximo passo a ser perseguido.
