Esta metodologia combina a melhoria do protocolo de limpeza com a capacidade ocular de seccionamento óptico da tecnologia Mesos PIM, permitindo-nos realizar reconstruções meso scópicas em resolução micrométrica. Ele fornece a possibilidade de visualizar tecidos cardíacos maciços ou toda a solução de corações de camundongos inteiros em uma única varredura sem perder a organização tridimensional original do tecido. Após o coração ter sido canulado por aorta proximal lavada em solução de tiro e fixada em aldeído 4% Paraform em PBS molar 0,01, está pronto para iniciar o protocolo de limpeza.
Lave o coração três vezes em 0,01 molar PBS a quatro graus Celsius por 15 minutos. Após esta etapa, o coração pode ser armazenado em PBS e 0,01% de azida de sódio a quatro graus Celsius por vários meses. Incubar o coração em 20 mililitros de solução de hidrogel em condição de agitação a 15 RPM durante três dias a quatro graus Celsius.
Desengaseifique a amostra à temperatura ambiente usando um secador, uma bomba de vácuo e um sistema de tubos que conecta o secador à banda da bomba e à tubulação de nitrogênio. Coloque a amostra no secador e abra o frasco para injetáveis mantendo a tampa sobre ele. Feche o secador e remova o oxigênio do tubo abrindo a tubulação de nitrogênio.
Ligue a bomba de vácuo para remover o oxigênio do secador por 10 minutos. Desligue a bomba e abra o botão do secador para a tubulação de nitrogênio. Em seguida, abra a torneira de nitrogênio.
Uma vez que a pressão seja igual à pressão atmosférica, abra cuidadosamente o secador e feche rapidamente o frasco para injetáveis. Mantenha o coração na solução de hidrogel desgaseificado a 37 graus Celsius por cerca de três horas em repouso. Quando o hidrogel estiver devidamente polimerizado e parecer inteiramente gelatinoso, retire cuidadosamente o coração dele e coloque-o numa solução de limpeza no frasco para injetáveis com solução de limpeza.
Troque a solução de depuração no frasco para injetáveis uma vez de três em três dias para acelerar o procedimento de clarificação. Uma vez que o coração pareça completamente clarificado, retire-o do frasco para injetáveis e lave-o em 50 mililitros de PBS aquecido durante 24 horas em condições de agitação. Lave novamente em 50 mililitros de um X PBS T por 24 horas em condições de agitação.
Incubar a amostra em 0,01 miligramas por mililitros de gérmen de trigo aglutinina Alexa piso 633 em três mililitros de um X PBS T em condição de agitação a 50 RPM à temperatura ambiente durante sete dias. Após a incubação de sete dias, lavar a amostra em 50 mililitros de um X PBS T à temperatura ambiente em agitação por 24 horas. Incubar a amostra em PFA a 4% durante 15 minutos e, em seguida, lavá-la três vezes em PBS 0,01 molar durante cinco minutos cada.
Incubar o coração sucessivamente em 20 e 47%TDE em 0,01 molar PBS por oito horas cada. E, finalmente, a 68%TDE em 0,01 molar PBS para fornecer o índice de refração necessário de 1,46. Encha suavemente cerca de 80% do quvet de quartzo externo com o meio de índice de refração.
Encha o quvet de quartzo interno com o mesmo meio de índice de refração. Mergulhe a amostra dentro do quvet interno. Mova suavemente a amostra para o fundo do quvet usando pinças finas e organize o coração com seu eixo longitudinal paralelo ao eixo principal do quvet para minimizar o caminho da luz de excitação através do tecido durante a digitalização.
Fixe cuidadosamente o plugue sob medida acima do quvet interno com dois parafusos. Monte a amostra no estágio do microscópio usando ímãs. Traduza o estágio de amostra vertical manualmente para imergir o quvet interno no externo.
Ligue a fonte de luz de excitação com um comprimento de onda de 638 nanômetros e defina-a em baixa potência na ordem de três miliwatts. Mova a amostra usando o tradutor motorizado para iluminar uma placa interna do tecido. Ligue o software da câmera ao vivo de imagem HC e defina o gatilho da câmera no modo de folha de luz do gatilho de borda externa para acionar o gatilho de aquisição da câmera pelo software personalizado que controla toda a configuração.
Habilite o salvamento automático no software da câmera e defina a pasta de saída onde as imagens precisam ser salvas. Ajuste manualmente a posição da amostra no plano X Y com os tradutores lineares para mover a amostra para o centro do campo de visão do sensor da câmera. Mova a amostra ao longo do eixo Z usando o tradutor motorizado linear para identificar as bordas do coração para reconstrução tomográfica.
Aumente a potência do laser para aproximadamente 20 miliwatts antes de começar a sessão de imagem. Inicie a aquisição tomográfica clicando no botão Iniciar no painel de captura do software de imagem e, ao mesmo tempo, comece a mover a amostra ao longo do eixo Z na velocidade constante de seis micrômetros por segundo usando o tradutor motorizado. A combinação da metodologia de clareza com TDE como meio de índice de refração não altera significativamente o volume final da amostra nem leva a uma deformação isotrópica do espécime.
A óptica de excitação produziu uma folha de luz com um desperdício mínimo de cerca de seis micrômetros que divergiram até 175 micrômetros na borda do campo de visão. A sincronização do obturador de rolamento da câmera com a varredura axial dos resíduos da folha de luz garantiu a coleta do sinal de emissão apenas na porção da amostra excitada com o desperdício da folha de luz, resultando em uma média F W H M de cerca de 6,7 micrômetros ao longo de todo o campo de visão. A função de espalhamento do ponto Z do microscópio também foi estimada por uma reconstrução tomográfica da nanoesfera fluorescente e um F W H M de 6,4 micrômetros foi estimado pelo ajuste.
A potencialidade do sistema para resolver membranas celulares únicas em três dimensões com uma relação sinal/ruído suficiente em todo o órgão também foi confirmada. O procedimento de desgaseificação é a etapa mais crítica do protocolo. Se não for realizado corretamente, o tecido pode encontrar danos indicando durante a incubação em uma solução de limpeza.
O protocolo apresentado pode ser combinado com um protocolo de coloração múltipla para alcançar uma reconstrução de todo o órgão integrando diferentes estruturas biológicas e pode ser aplicado ao estudo de modelos patológicos.
