Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH concede GM055360 para SLB e U54HD068157 a RGM. JMB foi apoiado pelo Training Grant T32 Genética da Universidade da Pensilvânia (GM008216).

O protocolo STA-PUT envolve três etapas: 1) Configure do aparelho e reagentes, 2) Preparação de suspensão de células de testículos inteiros, e 3) carregamento celular, sedimentação, e recolha de fracções. Quando realizada por uma equipe de dois pesquisadores, o protocolo leva oito horas, em média. 1. Configurar o aparelho STA-PUT (Figura 1) *** Aparelho STA-PUT deve ser colocado numa grande frigorífico a 4 ° C ou de um quarto frio que também pode acomodar um colector de fracções, se que o método de recolha é o preferido. <ol><li> Na noite anterior (ou pelo menos algumas horas antes), você executar o método, lavar todo o equipamento (especialmente o de vidro e tubos) e esterilizar com álcool 70%. Vamos equipamento seca completamente, antes de montar o aparelho como ilustrado na Figura 1. </li><li> Fixe os dois cilindros de 2 L (Figuras 1B e C) ea câmara de carga da célula ( <strong&gt; Figura 1A) para a plataforma superior e conectar todos com dois pequenos pedaços de tubos com grampos de tubo. Prenda todos os tubos fechados. Selar o bico sobre o L cilindro mais à direita 2. </li><li> Colocar uma pequena barra de agitação na câmara de carregamento de células (Figura 1A) e uma barra de agitação maior no 2 L cilindro mais à esquerda (Figura 1B) que conterá a BSA a 2%. </li><li> Coloque a câmara de sedimentação de 2 L sobre a plataforma (Figura 1D). Coloque o deflector de metal (Figura 1F) directamente por cima da abertura na parte inferior da câmara de sedimentação (Figura 1D). Isto é crítico, como o deflector impede o vórtice do líquido e perturbação do gradiente de células durante a recolha de fracções. Coloque a tampa na parte superior da câmara de sedimentação. </li><li> Após a aplicação de uma quantidade muito pequena de massa lubrificante de vácuo para a junta de vidro esmerilado de a torneira de três vias (Figura 1G), fixar a torneira de passagem para a parte inferior do sicâmara dimentation, ligando as juntas de vidro da torneira e da câmara de sedimentação. </li><li> Ligue a câmara da célula de carga (Figura 1A) para a saída para a direita da torneira com um tubo. Fechar a torneira. </li><li> Conecte o tubo de fracionamento celular para a tomada esquerda do torneira. O tubo de fraccionamento compreende uma peça de tubo com uma pipeta de Pasteur de vidro, ligado à extremidade aberta. Um pedaço da tubagem de furo menor é ligado à extremidade mais estreita da pipeta de vidro. A pipeta estreita restringe o fluxo da suspensão de células durante a fracção de recolha. Fixe este pequeno tubo na parte inferior. </li><li> Preparar 2 L de Krebs (1x) tamponar o dia da experiência (Tabela 1). Em seguida, preparar 550 ml de 2% de BSA em 1x de Krebs, 550 ml de 4% de BSA em 1x de Krebs, e 50 ml de BSA a 0,5% em 1x de Krebs. Filtra-se e arrefecer as soluções a 4 ° C. </li><li> Verter a solução de BSA a 4% no cilindro direito L 2 (Figura 1C) e BSA a 2%solução em 2 L da esquerda do cilindro (Figura 1B). Certifique-se que não há grandes bolhas na tubulação que conecta esses cilindros. </li><li> Despeje tampão Krebs para a câmara de carga da pilha e encher o tubo que liga esta câmara com a câmara de sedimentação, certificando-se de que não há bolhas grandes, pois estes podem perturbar o gradiente. Apertando ou sacudindo o tubo suavemente ajuda a remover as bolhas. Certifique-se de todo o tampão de Krebs é no tubo e não na câmara de célula. </li><li> Permitir que uma pequena quantidade de solução tampão de Krebs a fluir para dentro da câmara de decantação e depois drenar quase todo o tampão para os tubos de fraccionamento de células, a fim de encher o tubo e remover quaisquer bolhas de grandes dimensões. </li><li> Coloque o coletor de fração diretamente sob a câmara de sedimentação. Certifique-se que todos os tubos de fração estão no lugar e coberta com filme plástico para evitar a contaminação. </li></ol> 2. Isolando espermatogênicas células de testículos inteiros <ol&gt; <li> Dissecar testículos de ca 12 ratos adultos (de preferência pelo menos oito semanas de idade) e coloque em tampão Krebs à temperatura ambiente para lavar qualquer material contaminante. Este protocolo está sendo demonstrada envolve o uso de ratos de laboratório e foi executado em conformidade com as diretrizes da Universidade do Comitê Institucional Animal Care e Use Pensilvânia. </li><li> Adicionar 45 mg de colagenase a 50 ml de tampão Krebs em um tubo cônico de direito antes que você pretende adicionar os túbulos seminíferos. Permitir que a solução aquecer até 33 ° C durante alguns minutos. Divididos igualmente em dois tubos de 50 ml cônico. </li><li> Decapsulate os testículos em um prato separado, contendo 8 ml de tampão Krebs, descartando a túnica albugínea e liberando os túbulos seminíferos. A túnica albugínea é a fina membrana que envolve os túbulos seminíferos. Os túbulos deve prontamente separar da túnica albugínea. Para fazer isso, fazer uma incisão na túnica albugínea, segure esta membrana com um pair de uma pinça, e empurrar os túbulos de fora e para longe da membrana com o outro par de fórceps. </li><li> Adicionar 4 ml de tampão de Krebs contendo os túbulos de cada tubo cónico contendo 25 ml de solução de colagenase e incubar, sob agitação, à 33 ° C durante 10 min. No final, os túbulos deve ter uma aparência de &quot;spaghetti-like&quot;. </li><li> Permitir que os túbulos que se contentar com ~ 5 min para o fundo do tubo. Derrama-se o sobrenadante e lavar 2x em 25 ml de tampão de Krebs (à temperatura ambiente), permitindo que os túbulos para assentar no fundo do tubo de cada vez. Deixar ~ 5 ml de tampão de Krebs, em cada tubo. </li><li> Enquanto a lavagem, adicionar 30 mg de tripsina a 50 ml de tampão Krebs em um tubo falcon direito antes que você pretende adicionar os túbulos seminíferos. Permitir que a solução aquecer até 33 ° C durante alguns minutos. Divididos igualmente em dois tubos de 50 ml cônico. </li><li> Adicionar 25 ml de solução de tripsina a cada um dos dois tubos contendo os túbulos. Adiciona-se 3 ug de DNAse (1 μg/10ml) a cada tubo para prevenir a células de aglomeração. Incubar, sob agitação, à 33 ° C durante 10 min. </li><li> Usar uma pipeta de orifício largo para agitar a solução contendo os túbulos, pipetando-os dentro e para fora aproximadamente 10x. A solução deve começar a olhar mais como uma suspensão única célula. </li><li> Incubar, sob agitação, à 33 ° C durante 10 min adicionais. Use uma pipeta de diâmetro grande para dispersar os túbulos em uma suspensão única célula, pipetando-los dentro e fora aproximadamente 25x. Se você ainda ver um monte de túbulos ou aglomerados de células, dispersar mais com a pipeta e / ou adicionar outro DNAse 3 mg a cada tubo (concentração inicial duplo). </li><li> Filtra-se a suspensão de células individuais através de um filtro de células de malha 100 um (uma para cada tubo de 30 ml de suspensão de células). Combina-se as suspensões de células e contagem do número total de células (deve estar entre 7-8 x 10 8 células). *** NÃO carregar mais de 800 milhões de células para o gradiente. </li><li> Com base na contagem das células obtidas na etapa 2.10, sedimentar a aproprvolume de iate de células filtradas em 450 rcf durante 5 min e lava-se com 30 ml de tampão de Krebs. Repetir. Normalmente *** 22 testículos vai render mais de 800 milhões de células, mas não coloque mais do que esse número de células. </li><li> Ressuspender cuidadosamente as células em 25 ml de BSA a 0,5%, contendo entre 2,5 e 5 ug de DNAse (dependendo do grau de agregação celular), sem criar bolhas. Certifique-se que as células não se aglutinar. Filtra-se a suspensão de células individuais através de um filtro de células de malha 100 um. As células estão agora prontos para carregar. Misture bem antes do carregamento, invertendo o tubo várias vezes. </li></ol> 3. Célula de carga e Sedimentação <ol><li> Certifique-se de que a torneira é fechada, mas na posição em que irá permitir que o líquido flua da câmara da célula (Figura 1A) para a câmara de sedimentação (Figura 1D). </li><li> Vire ambas as placas barra de agitação para um nível baixo (cerca de 70 rpm) para permitir que as barras de agitação para se mover continuamente, mas lentamente. </li><li> Despeje a suspensão de células para dentro da câmara de células (Figura 1A) e abrir a torneira de modo a que as células fluem lentamente para dentro da câmara de sedimentação, a uma taxa de 10 ml / min (Figura 1D). Fechar a torneira. Taxa de fluxo pode ser determinada por marcação intervalos de volume na câmara de sedimentação. </li><li> Despeje 5 ml de solução de BSA a 0,5% para a câmara de célula e drene para a câmara de sedimentação, a uma taxa de 10 ml / min. Fechar a torneira. Este passo irá lavar as células para fora da câmara de célula. Repita 4x. </li><li> Prepare o gradiente: Abra os grampos entre a câmara da célula (Figura 1A) e os dois cilindros de 2 L (Figura 1B e C), e começar a escoar o líquido para dentro da câmara de decantação a uma taxa de 40 ml / min (Figura 1D) imediatamente. Ajustar o fluxo de modo que leva cerca de 20-30 minutos para carregar o gradiente de BSA para a câmara de sedimentação. Uma camada fina, sem perturbações de células encontra-se na parte superior doGradiente BSA deve ser visível. Uma vez que a maior parte da BSA é carregado, feche a torneira e coloque-o na posição que irá permitir que o líquido escorra da câmara de sedimentação no tubo de fracionamento. </li><li> Desligue as placas de agitação. </li><li> Permitir que as células sedimentar durante uma hora e 45 minutos. Não perturbem o aparelho durante este tempo. Qualquer agitação mecânica poderia perturbar o gradiente. </li></ol> 4. O fraccionamento e Análise de fracções *** Como você execute os seguintes passos, tenha cuidado para não perturbar o gradiente. Se o gradiente de BSA é perturbado, o procedimento não vai funcionar! <ol><li> Uma vez que as células tiverem sedimentado, escorrer lentamente 50 ml da câmara de sedimentação em um tubo cônico de 50 ml e reserve. Esta fracção contém geralmente aglomerados indesejados das células e detritos. </li><li> Fixe o tubo fração para o coletor de fração. *** Também é possível coletar as frações à mão, se um colle fraçãoctor não está disponível. </li><li> Colete frações: Ajustar a taxa de fluxo com a torneira para que 10 ml (enchendo um tubo de coleta) é coletada a cada 45 seg. </li><li> Tapar os tubos de recolha de fracção e girar durante 5 minutos a 450 rcf a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante cuidadosamente, ressuspender as células em líquido restante, e manter as células no gelo. </li><li> Uma vez que todas as frações são coletadas, microscopicamente analisar as frações para as populações de células diferentes. Diferentes tipos de células podem ser distinguidas com base no tamanho e morfologia celular nuclear 8,15. Figura 2 ilustra os resultados representativos &quot;&quot; para as três fracções reunidas que são enriquecidas para as células (uma) somáticas e meiose e espermatogónios, (b), e Espermátides arredondadas (c) alongando e condensação espermatídeos. <ul><li> Tipo A espermatogônias são 12 14μm ca. de diâmetro e têm núcleos redondos que são homogêneos em composição da cromatina. </li><li> Tipo B espermatogônias são 8-9μm ca. em diâmetro e têm round núcleos que mostram heterocromatina mais densa ao longo da periferia nuclear. </li><li> Espermatócitos Pré-leptotênicos são 7.5-8.2μm ca. de diâmetro, têm menos citoplasma de espermatogônias do tipo B, e têm núcleos que se assemelham às de Tipo B espermatogônias. </li><li> Espermatócitos primários leptotênicos são 8-10 mM ca. em diâmetro e têm núcleos que se assemelham às de espermatócitos pré-leptotênicos, mas parecem ter mais densa da cromatina na membrana nuclear. </li><li> Zigóteno espermatócitos primários são 10-12 mM ca. em diâmetro e têm núcleos que se assemelham às de espermatócitos primários leptotênicos. </li><li> Espermatócitos Paquíteno estão em qualquer lugar 12-18 mM ca. de diâmetro e são constituídos por uma borda fina de citoplasma em torno de um núcleo grande. Mais aglomerados de cromatina densa pode ser visto no núcleo. </li><li> Espermátides redondas são 10 m ca. em diâmetro e têm um núcleo redondo com um cromocentro densamente coloração no meio. </li><li> Residualcorpos são ~ 6,5 m de diâmetro, são redondos, e carecem de um núcleo. </li><li> Alongamento e condensação espermatídeos são semelhantes em tamanho a espermatídeos redondas, mas têm, de um núcleo em forma de foice única. </li></ul><ol><li> Comece com a fração de 15 e analisar cada cinco frações de até 85. Normalmente, as frações inferiores a 15 vai ser muito misturado e agrupado, e as frações superiores a 85 irá conter poucos ou nenhum células utilizáveis. </li><li> Para analisar uma fracção, tomar 5ul de líquido a partir do tubo de recolha de fracções (uma vez que as células foram ressuspensas após centrifugação) e adicionar a 5ul de 8% de formaldeído em tampão de Krebs. Permitir que as células fixas para descansar em temperatura ambiente por cinco minutos. </li><li> Adicionar 5 ul de 0,1% de Triton e DAPI (5 μ / ml de tampão de Krebs) para as células fixadas. Permitir que as células para descansar em temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Coloque 10 ml da solução resultante sobre uma lâmina, cubra com uma lamínula, e analisar com um microscópio de fluorescência para determinar a pureza de cada fração. </li><li> Combine frações que são semelhantes em tamanho e morfologia nuclear (ver &quot;Os resultados representativos&quot;) para criar os seguintes populações de células: células diploides meiose e somáticos, espermátides redondas e condensação / alongando espermátides. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Este protocolo está sendo demonstrada envolve o uso de ratos de laboratório e foi executado em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras. Animais utilizados neste protocolo são mantidos sob a orientação e aprovação da Universidade do Comitê Animal Care e Use Institucional Pensilvânia (IACUC o protocolo n º 804284).

Aqueles que estudam a espermatogênese confiar em modelos animais para amostras de células de espermatogénese, como um sistema de cultura de células confiável ainda não existe para gerar todos os tipos celulares espermatogênicas 3. Embora as células espermatogênicas são facilmente coletadas de testículos inteiros, apenas uma população mista resulta. Isto coloca um problema para aqueles que desejam estudar subtipos específicos dessas células, como as células meióticas, espermátides redondas e ...

Espermatogénese mamífero é um processo de diferenciação complexo que ocorre em várias etapas, os túbulos seminíferos dos testículos 1. Resumidamente, células-tronco como espermatogônias que residem perto do epitélio da divisão dos túbulos seminíferos e se diferenciam em espermatócitos, que, em seguida, passam por divisões meióticas. Após a meiose é completa, as células haplóides resultantes, ou espermátides arredondadas, são submetidos a espermiogênese, um processo de diferenciação que envolve o derramamento de citoplasma e compactação do núcleo. Espermátides gradualmente desenvolver um flagelo e submetidos a alongamento e condensação do núcleo, produzindo alongamento e, em seguida, condensando espermatídeos, respectivamente. Os produtos finais são os espermatozóides, que são liberados no lúmen do túbulo seminífero e, finalmente, para o epidídimo, onde eles amadurecem mais. Como o processo de espermatogênese depende de condições hormonais e moleculares especiais emos testículos, um sistema in vitro de cultura de confiança para todo o processo de espermatogénese ainda não foi desenvolvido 2,3. Métodos de cultura têm sido desenvolvidos para a criação de &quot;células-como células germinativas primordiais&quot; e, &quot;espermátides-como a volta&quot; haplóides a partir de células-tronco, mas estes métodos ainda não são capazes de gerar um grande número dessas células e não conseguem produzir células espermatogênico mais tarde tipos 4,5. Felizmente, os tipos de células espermatogénicas diferem significativamente de tamanho, que permite a uma suspensão de uma única célula obtidos a partir de testículos inteiras sejam separadas com um gradiente de líquido. O método STA-PUT, demonstrado aqui, usa um gradiente linear BSA e sedimentação simples para separar células espermatogênicas com base no tamanho e massa 6-9. O método STA-PUT tem várias vantagens sobre os outros dois métodos mais amplamente utilizados para separar os tipos de células espermatogénicas: FACS e elutriação 10-13. O aparelho STA-PUT requer only vários pedaços de vidro especializada montado em uma sala fria ou geladeira grande. Assim, é menos dispendioso do que o uso de um separador de células ou um elutriator. O método STA-PUT produz quantidades elevadas de células, por tipo de célula e os testículos do que pode ser classificada por FACS num período de tempo comparável, embora a pureza de cada população de células não é tão elevada quanto as obtidas com FACS 11. Células de triagem utilizando esferas magnéticas (triagem magnético ativado celular, MACS), recentemente tem sido empregada com sucesso para o enriquecimento das espermatogônias a partir de uma população de células dos testículos mista, mas de momento inadequado para separar espermatócitos ou espermátides, devido à falta de conhecimento da superfície apropriada marcadores 14. Uma vantagem adicional do método de STA-PUT sobre FACS ou MACS é a capacidade para isolar células viáveis ​​adequados para a cultura subsequente, porque, em contraste com a maioria dos protocolos de FACS, que não requer qualquer ADN ou outros tipos de coloração. Para os estudos que requerem lrendimentos ARGE, de espermatogênicas tipos de células em ~ 90% de pureza, o STA-PUT é um método ideal.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10857 100MG</td><td>Alternate can be used.</td></tr><tr><td>0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td><td>Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td><td>To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (10x)</td><td>3.26 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Autoclave/filter and store at 4 &amp;deg;C for several months.</td><td></td></tr><tr><td>KREBS (1x)</td><td>Dissolve 4.24 g NaHCO&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;in 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0.</td><td>To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>C9891-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DNEP-5MG</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T9201-1G</td><td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde (~37%)</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TABLE 2: EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td>Company</td><td>Catalog #</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Complete STA-PUT apparatus</td><td>ProScience Glass Shop</td><td>STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td><td>Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;m mesh filter</td><td>Fisherbrand</td><td>22363549</td><td> </td></tr><tr><td>Mouse dissection tools</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Need approximately 100 tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fraction collector</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td><td>Alternate can be used.</td></tr><tr><td>Microscope slides, cover glass</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light/Fluorescent Microscope</td><td>Preference of researcher</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

Espermatogénese mamífero é um processo de diferenciação complexo que ocorre em várias etapas, os túbulos seminíferos dos testículos. Atualmente, não existe um sistema de cultura de células confiável permitindo a diferenciação da espermatogênese in vitro, ea maioria dos estudos biológicos das células espermatogênicas requerem colheita de tecidos a partir de modelos animais, como ratos e ratinhos. Porque o testículo contém numerosos tipos de células - tanto não-espermatogênico (Leydig, Sertoli, mielóides e células epiteliais) e espermatogênicas (espermatogônias, espermatócitos, espermátides redondas, condensando espermátides e espermatozóides) - estudos dos mecanismos biológicos envolvidos na espermatogênese requer o isolamento e o enriquecimento destes tipos de células diferentes. O método STA-PUT permite a separação de uma população heterogénea de células - neste caso, a partir de testículos - por meio de um gradiente linear de BSA. Tipos de células individuais sedimentar com velocidade de sedimentação de acordo com a diferente cetamanho ll, e fracções enriquecidas com diferentes tipos de células pode ser recolhido e utilizado em análises posteriores. Enquanto o método de STA-PUT não resulta em fracções de elevada pureza de tipos de células, por exemplo, como pode ser obtido com determinados métodos de classificação celular, que faz prever um rendimento muito maior do total de células em cada fracção (~ 1 x 10 8 células / tipo de célula espermatogênico de uma população inicial de 7-8 x 10 8 células). Este método de alto rendimento exige apenas vidraria especializada e pode ser realizada em qualquer sala fria ou geladeira grande, tornando-se um método ideal para laboratórios que têm acesso limitado aos equipamentos especializados como uma fluorescência ativada classificador de células (FACS) ou elutriator.

O resultado ideal do processo de STA-PUT é uma separação bastante perceptível de células dos testículos com base no tamanho de célula e a densidade. Enquanto as células isoladas a partir dos testículos são sedimentando através do gradiente de BSA, várias bandas distintas de células pode ser observada. Quaisquer aglomerados de células tendem a afundar-se para o fundo do gradiente e não contaminam as outras fracções. Um pouco mais acima do gradiente será o grande somáticas e células meióticas. Mais ac...

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Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

O método STA-PUT permite a separação das diferentes populações de células espermatogénicas com base no tamanho e densidade.

A separação de tipos de células espermatogênicas Usando STA-PUT velocidade de sedimentação

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Research

JoVE Journal

Biology

25.7K visualizações.  University of Pennsylvania.  O método STA-PUT permite a separação das diferentes populações de células espermatogénicas com base no tamanho e densidade. 

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Biologia do Desenvolvimento

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during meiosis can lead to infertility, pregnancy loss or genetic defects. Commencing at the onset of puberty and continuing throughout adulthood, continuous semi-synchronous waves of spermatocytes undergo spermatogenesis and ultimately form haploid sperm. The first wave of mouse spermatocytes undergoing meiotic initiation appear at day 10 post-partum (10 dpp) and are released into the lumen of seminiferous tubules as mature sperm at 35 dpp. Therefore, it is advantageous to utilize mice within this developmental time-window in order to obtain highly enriched populations of interest. Analysis of rare cell stages is more difficult in older mice due to the contribution of successive spermatogenic waves, which increase the diversity of the cellular populations within the tubules. The method described here is an easily implemented technique for the cytological evaluation of the cells found within the seminiferous tubules of mice, including spermatogonia, spermatocytes, and spermatids. The tubule squash technique maintains the integrity of isolated male germ cells and allows examination of cellular structures that are not easily visualized with other techniques. To demonstrate the possible applications of this tubule squash technique, spindle assembly was monitored in spermatocytes progressing through the prophase to metaphase I transition (G2/MI transition). In addition, centrosome duplication, meiotic sex chromosome inactivation (MSCI), and chromosome bouquet formation were assessed as examples of the cytological structures that can be observed using this tubule squash method. This technique can be used to pinpoint specific defects during spermatogenesis that are caused by mutation or exogenous perturbation, and thus, contributes to our molecular understanding of spermatogenesis.

The goal of this tubule squash technique is to rapidly assess cytological features of developing mouse spermatocytes while preserving cellular integrity. This method allows for the study of all stages of spermatogenesis, and can be easily implemented alongside other biochemical and molecular biological approaches for the study of mouse meiosis.

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Enrichment of Pachytene Spermatocytes and Spermatids from Mouse Testes Using Standard Laboratory Equipment

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete populations is challenging, because the adult testis contains a complex mix of germ cells from all steps of spermatogenesis along with certain populations of somatic cells. Over the past few decades, different techniques such as centrifugal elutriation, fluorescence-activated cell sorting (FACS), and STA-PUT have been successfully applied to the isolation of germ cells. A drawback is that they all require dedicated devices and specialized training. Following principles underlying the STA-PUT method, a simple protocol has been developed for the isolation of pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from mouse testes. After preparing a single cell suspension of testicular cells, specific cell populations are enriched by gravity sedimentation through a discontinuous bovine serum albumin (BSA) density gradient. The cell fractions are then manually collected and microscopically analysed. This modified density gradient for round spermatids (MDR) sedimentation protocol can be widely applied, because it requires only standard laboratory equipment. Furthermore, the protocol requires minimal starting materials, reducing its cost and use of laboratory animals.

Presented here is a protocol for enriching pachytene spermatocytes, round spermatids, and elongating spermatids from adult mouse testes using a discontinuous bovine serum albumin density gradient with standard laboratory equipment.

Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

To characterize each step of spermatogenesis, researchers must separate different subpopulations of germ cells from testes. However, isolating discrete ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established cell isolation protocols using Hoechst 33342 staining in combination with fluorescence-activated cell sorting, it requires cell sorters equipped with an ultraviolet laser. Here we describe a cell isolation protocol using the DyeCycle Violet (DCV) stain, a low cytotoxicity DNA binding dye structurally similar to Hoechst 33342. DCV can be excited by both ultraviolet and violet lasers, which improves the flexibility of equipment choice, including a cell sorter not equipped with an ultraviolet laser. Using this protocol, one can isolate three live-cell subpopulations in meiotic prophase I, including leptotene/zygotene, pachytene, and diplotene spermatocytes, as well as post-meiotic round spermatids. We also describe a protocol to prepare single-cell suspension from mouse testes. Overall, the procedure requires a short time to complete (4-5 hours depending on the number of needed cells), which facilitates many downstream applications.

Here we present a simple and efficient method to isolate live meiotic and post-meiotic germ cells from adult mouse testes. Using a low-cytotoxicity, violet-excited DNA binding dye and fluorescence-activated cell sorting, one can isolate highly enriched spermatogenic cell populations for many downstream applications.

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biologia

<meta charset="utf8"></head><body>Procedimento de injeção de espermátides redondas murinas para estudar o desenvolvimento embrionário

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Injeção de espermátide redonda em camundongo

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

A separação de tipos de células espermatogênicas Usando STA-PUT velocidade de sedimentação

Resumo

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Passo-específico Seleção de mouse Espermátides por citometria de fluxo

Uma abordagem padronizada para a purificação multiespecífica de células germinais masculinas de mamíferos por dissociação mecânica do tecido e citometria de fluxo

Uma técnica de Squash do tubo seminífero para a análise citológica da espermatogênese usando o modelo de Mouse

Enriquecimento de espermatócitos de Pachytene e Spermatids de testes de camundongo usando equipamento de laboratório padrão

Isolamento de células spermatogênicas murinas usando um corante de ligação de DNA permeável celular-permeável violeta

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Injeção de espermátide redonda em camundongo

Técnica simples e eficiente para a preparação de suspensões de células testiculares