Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH concede GM055360 para SLB e U54HD068157 a RGM. JMB foi apoiado pelo Training Grant T32 Genética da Universidade da Pensilvânia (GM008216).

O protocolo STA-PUT envolve três etapas: 1) Configure do aparelho e reagentes, 2) Preparação de suspensão de células de testículos inteiros, e 3) carregamento celular, sedimentação, e recolha de fracções. Quando realizada por uma equipe de dois pesquisadores, o protocolo leva oito horas, em média. 1. Configurar o aparelho STA-PUT (Figura 1) *** Aparelho STA-PUT deve ser colocado numa grande frigorífico a 4 ° C ou de um quarto frio que também pode acomodar um colector de fracções, se que o método de recolha é o preferido. <ol><li> Na noite anterior (ou pelo menos algumas horas antes), você executar o método, lavar todo o equipamento (especialmente o de vidro e tubos) e esterilizar com álcool 70%. Vamos equipamento seca completamente, antes de montar o aparelho como ilustrado na Figura 1. </li><li> Fixe os dois cilindros de 2 L (Figuras 1B e C) ea câmara de carga da célula ( <strong&gt; Figura 1A) para a plataforma superior e conectar todos com dois pequenos pedaços de tubos com grampos de tubo. Prenda todos os tubos fechados. Selar o bico sobre o L cilindro mais à direita 2. </li><li> Colocar uma pequena barra de agitação na câmara de carregamento de células (Figura 1A) e uma barra de agitação maior no 2 L cilindro mais à esquerda (Figura 1B) que conterá a BSA a 2%. </li><li> Coloque a câmara de sedimentação de 2 L sobre a plataforma (Figura 1D). Coloque o deflector de metal (Figura 1F) directamente por cima da abertura na parte inferior da câmara de sedimentação (Figura 1D). Isto é crítico, como o deflector impede o vórtice do líquido e perturbação do gradiente de células durante a recolha de fracções. Coloque a tampa na parte superior da câmara de sedimentação. </li><li> Após a aplicação de uma quantidade muito pequena de massa lubrificante de vácuo para a junta de vidro esmerilado de a torneira de três vias (Figura 1G), fixar a torneira de passagem para a parte inferior do sicâmara dimentation, ligando as juntas de vidro da torneira e da câmara de sedimentação. </li><li> Ligue a câmara da célula de carga (Figura 1A) para a saída para a direita da torneira com um tubo. Fechar a torneira. </li><li> Conecte o tubo de fracionamento celular para a tomada esquerda do torneira. O tubo de fraccionamento compreende uma peça de tubo com uma pipeta de Pasteur de vidro, ligado à extremidade aberta. Um pedaço da tubagem de furo menor é ligado à extremidade mais estreita da pipeta de vidro. A pipeta estreita restringe o fluxo da suspensão de células durante a fracção de recolha. Fixe este pequeno tubo na parte inferior. </li><li> Preparar 2 L de Krebs (1x) tamponar o dia da experiência (Tabela 1). Em seguida, preparar 550 ml de 2% de BSA em 1x de Krebs, 550 ml de 4% de BSA em 1x de Krebs, e 50 ml de BSA a 0,5% em 1x de Krebs. Filtra-se e arrefecer as soluções a 4 ° C. </li><li> Verter a solução de BSA a 4% no cilindro direito L 2 (Figura 1C) e BSA a 2%solução em 2 L da esquerda do cilindro (Figura 1B). Certifique-se que não há grandes bolhas na tubulação que conecta esses cilindros. </li><li> Despeje tampão Krebs para a câmara de carga da pilha e encher o tubo que liga esta câmara com a câmara de sedimentação, certificando-se de que não há bolhas grandes, pois estes podem perturbar o gradiente. Apertando ou sacudindo o tubo suavemente ajuda a remover as bolhas. Certifique-se de todo o tampão de Krebs é no tubo e não na câmara de célula. </li><li> Permitir que uma pequena quantidade de solução tampão de Krebs a fluir para dentro da câmara de decantação e depois drenar quase todo o tampão para os tubos de fraccionamento de células, a fim de encher o tubo e remover quaisquer bolhas de grandes dimensões. </li><li> Coloque o coletor de fração diretamente sob a câmara de sedimentação. Certifique-se que todos os tubos de fração estão no lugar e coberta com filme plástico para evitar a contaminação. </li></ol> 2. Isolando espermatogênicas células de testículos inteiros <ol&gt; <li> Dissecar testículos de ca 12 ratos adultos (de preferência pelo menos oito semanas de idade) e coloque em tampão Krebs à temperatura ambiente para lavar qualquer material contaminante. Este protocolo está sendo demonstrada envolve o uso de ratos de laboratório e foi executado em conformidade com as diretrizes da Universidade do Comitê Institucional Animal Care e Use Pensilvânia. </li><li> Adicionar 45 mg de colagenase a 50 ml de tampão Krebs em um tubo cônico de direito antes que você pretende adicionar os túbulos seminíferos. Permitir que a solução aquecer até 33 ° C durante alguns minutos. Divididos igualmente em dois tubos de 50 ml cônico. </li><li> Decapsulate os testículos em um prato separado, contendo 8 ml de tampão Krebs, descartando a túnica albugínea e liberando os túbulos seminíferos. A túnica albugínea é a fina membrana que envolve os túbulos seminíferos. Os túbulos deve prontamente separar da túnica albugínea. Para fazer isso, fazer uma incisão na túnica albugínea, segure esta membrana com um pair de uma pinça, e empurrar os túbulos de fora e para longe da membrana com o outro par de fórceps. </li><li> Adicionar 4 ml de tampão de Krebs contendo os túbulos de cada tubo cónico contendo 25 ml de solução de colagenase e incubar, sob agitação, à 33 ° C durante 10 min. No final, os túbulos deve ter uma aparência de &quot;spaghetti-like&quot;. </li><li> Permitir que os túbulos que se contentar com ~ 5 min para o fundo do tubo. Derrama-se o sobrenadante e lavar 2x em 25 ml de tampão de Krebs (à temperatura ambiente), permitindo que os túbulos para assentar no fundo do tubo de cada vez. Deixar ~ 5 ml de tampão de Krebs, em cada tubo. </li><li> Enquanto a lavagem, adicionar 30 mg de tripsina a 50 ml de tampão Krebs em um tubo falcon direito antes que você pretende adicionar os túbulos seminíferos. Permitir que a solução aquecer até 33 ° C durante alguns minutos. Divididos igualmente em dois tubos de 50 ml cônico. </li><li> Adicionar 25 ml de solução de tripsina a cada um dos dois tubos contendo os túbulos. Adiciona-se 3 ug de DNAse (1 μg/10ml) a cada tubo para prevenir a células de aglomeração. Incubar, sob agitação, à 33 ° C durante 10 min. </li><li> Usar uma pipeta de orifício largo para agitar a solução contendo os túbulos, pipetando-os dentro e para fora aproximadamente 10x. A solução deve começar a olhar mais como uma suspensão única célula. </li><li> Incubar, sob agitação, à 33 ° C durante 10 min adicionais. Use uma pipeta de diâmetro grande para dispersar os túbulos em uma suspensão única célula, pipetando-los dentro e fora aproximadamente 25x. Se você ainda ver um monte de túbulos ou aglomerados de células, dispersar mais com a pipeta e / ou adicionar outro DNAse 3 mg a cada tubo (concentração inicial duplo). </li><li> Filtra-se a suspensão de células individuais através de um filtro de células de malha 100 um (uma para cada tubo de 30 ml de suspensão de células). Combina-se as suspensões de células e contagem do número total de células (deve estar entre 7-8 x 10 8 células). *** NÃO carregar mais de 800 milhões de células para o gradiente. </li><li> Com base na contagem das células obtidas na etapa 2.10, sedimentar a aproprvolume de iate de células filtradas em 450 rcf durante 5 min e lava-se com 30 ml de tampão de Krebs. Repetir. Normalmente *** 22 testículos vai render mais de 800 milhões de células, mas não coloque mais do que esse número de células. </li><li> Ressuspender cuidadosamente as células em 25 ml de BSA a 0,5%, contendo entre 2,5 e 5 ug de DNAse (dependendo do grau de agregação celular), sem criar bolhas. Certifique-se que as células não se aglutinar. Filtra-se a suspensão de células individuais através de um filtro de células de malha 100 um. As células estão agora prontos para carregar. Misture bem antes do carregamento, invertendo o tubo várias vezes. </li></ol> 3. Célula de carga e Sedimentação <ol><li> Certifique-se de que a torneira é fechada, mas na posição em que irá permitir que o líquido flua da câmara da célula (Figura 1A) para a câmara de sedimentação (Figura 1D). </li><li> Vire ambas as placas barra de agitação para um nível baixo (cerca de 70 rpm) para permitir que as barras de agitação para se mover continuamente, mas lentamente. </li><li> Despeje a suspensão de células para dentro da câmara de células (Figura 1A) e abrir a torneira de modo a que as células fluem lentamente para dentro da câmara de sedimentação, a uma taxa de 10 ml / min (Figura 1D). Fechar a torneira. Taxa de fluxo pode ser determinada por marcação intervalos de volume na câmara de sedimentação. </li><li> Despeje 5 ml de solução de BSA a 0,5% para a câmara de célula e drene para a câmara de sedimentação, a uma taxa de 10 ml / min. Fechar a torneira. Este passo irá lavar as células para fora da câmara de célula. Repita 4x. </li><li> Prepare o gradiente: Abra os grampos entre a câmara da célula (Figura 1A) e os dois cilindros de 2 L (Figura 1B e C), e começar a escoar o líquido para dentro da câmara de decantação a uma taxa de 40 ml / min (Figura 1D) imediatamente. Ajustar o fluxo de modo que leva cerca de 20-30 minutos para carregar o gradiente de BSA para a câmara de sedimentação. Uma camada fina, sem perturbações de células encontra-se na parte superior doGradiente BSA deve ser visível. Uma vez que a maior parte da BSA é carregado, feche a torneira e coloque-o na posição que irá permitir que o líquido escorra da câmara de sedimentação no tubo de fracionamento. </li><li> Desligue as placas de agitação. </li><li> Permitir que as células sedimentar durante uma hora e 45 minutos. Não perturbem o aparelho durante este tempo. Qualquer agitação mecânica poderia perturbar o gradiente. </li></ol> 4. O fraccionamento e Análise de fracções *** Como você execute os seguintes passos, tenha cuidado para não perturbar o gradiente. Se o gradiente de BSA é perturbado, o procedimento não vai funcionar! <ol><li> Uma vez que as células tiverem sedimentado, escorrer lentamente 50 ml da câmara de sedimentação em um tubo cônico de 50 ml e reserve. Esta fracção contém geralmente aglomerados indesejados das células e detritos. </li><li> Fixe o tubo fração para o coletor de fração. *** Também é possível coletar as frações à mão, se um colle fraçãoctor não está disponível. </li><li> Colete frações: Ajustar a taxa de fluxo com a torneira para que 10 ml (enchendo um tubo de coleta) é coletada a cada 45 seg. </li><li> Tapar os tubos de recolha de fracção e girar durante 5 minutos a 450 rcf a 4 ° C. Deitar fora o sobrenadante cuidadosamente, ressuspender as células em líquido restante, e manter as células no gelo. </li><li> Uma vez que todas as frações são coletadas, microscopicamente analisar as frações para as populações de células diferentes. Diferentes tipos de células podem ser distinguidas com base no tamanho e morfologia celular nuclear 8,15. Figura 2 ilustra os resultados representativos &quot;&quot; para as três fracções reunidas que são enriquecidas para as células (uma) somáticas e meiose e espermatogónios, (b), e Espermátides arredondadas (c) alongando e condensação espermatídeos. <ul><li> Tipo A espermatogônias são 12 14μm ca. de diâmetro e têm núcleos redondos que são homogêneos em composição da cromatina. </li><li> Tipo B espermatogônias são 8-9μm ca. em diâmetro e têm round núcleos que mostram heterocromatina mais densa ao longo da periferia nuclear. </li><li> Espermatócitos Pré-leptotênicos são 7.5-8.2μm ca. de diâmetro, têm menos citoplasma de espermatogônias do tipo B, e têm núcleos que se assemelham às de Tipo B espermatogônias. </li><li> Espermatócitos primários leptotênicos são 8-10 mM ca. em diâmetro e têm núcleos que se assemelham às de espermatócitos pré-leptotênicos, mas parecem ter mais densa da cromatina na membrana nuclear. </li><li> Zigóteno espermatócitos primários são 10-12 mM ca. em diâmetro e têm núcleos que se assemelham às de espermatócitos primários leptotênicos. </li><li> Espermatócitos Paquíteno estão em qualquer lugar 12-18 mM ca. de diâmetro e são constituídos por uma borda fina de citoplasma em torno de um núcleo grande. Mais aglomerados de cromatina densa pode ser visto no núcleo. </li><li> Espermátides redondas são 10 m ca. em diâmetro e têm um núcleo redondo com um cromocentro densamente coloração no meio. </li><li> Residualcorpos são ~ 6,5 m de diâmetro, são redondos, e carecem de um núcleo. </li><li> Alongamento e condensação espermatídeos são semelhantes em tamanho a espermatídeos redondas, mas têm, de um núcleo em forma de foice única. </li></ul><ol><li> Comece com a fração de 15 e analisar cada cinco frações de até 85. Normalmente, as frações inferiores a 15 vai ser muito misturado e agrupado, e as frações superiores a 85 irá conter poucos ou nenhum células utilizáveis. </li><li> Para analisar uma fracção, tomar 5ul de líquido a partir do tubo de recolha de fracções (uma vez que as células foram ressuspensas após centrifugação) e adicionar a 5ul de 8% de formaldeído em tampão de Krebs. Permitir que as células fixas para descansar em temperatura ambiente por cinco minutos. </li><li> Adicionar 5 ul de 0,1% de Triton e DAPI (5 μ / ml de tampão de Krebs) para as células fixadas. Permitir que as células para descansar em temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Coloque 10 ml da solução resultante sobre uma lâmina, cubra com uma lamínula, e analisar com um microscópio de fluorescência para determinar a pureza de cada fração. </li><li> Combine frações que são semelhantes em tamanho e morfologia nuclear (ver &quot;Os resultados representativos&quot;) para criar os seguintes populações de células: células diploides meiose e somáticos, espermátides redondas e condensação / alongando espermátides. </li></ol></li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes. Este protocolo está sendo demonstrada envolve o uso de ratos de laboratório e foi executado em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras. Animais utilizados neste protocolo são mantidos sob a orientação e aprovação da Universidade do Comitê Animal Care e Use Institucional Pensilvânia (IACUC o protocolo n º 804284).

Aqueles que estudam a espermatogênese confiar em modelos animais para amostras de células de espermatogénese, como um sistema de cultura de células confiável ainda não existe para gerar todos os tipos celulares espermatogênicas 3. Embora as células espermatogênicas são facilmente coletadas de testículos inteiros, apenas uma população mista resulta. Isto coloca um problema para aqueles que desejam estudar subtipos específicos dessas células, como as células meióticas, espermátides redondas e ...

Espermatogénese mamífero é um processo de diferenciação complexo que ocorre em várias etapas, os túbulos seminíferos dos testículos 1. Resumidamente, células-tronco como espermatogônias que residem perto do epitélio da divisão dos túbulos seminíferos e se diferenciam em espermatócitos, que, em seguida, passam por divisões meióticas. Após a meiose é completa, as células haplóides resultantes, ou espermátides arredondadas, são submetidos a espermiogênese, um processo de diferenciação que envolve o derramamento de citoplasma e compactação do núcleo. Espermátides gradualmente desenvolver um flagelo e submetidos a alongamento e condensação do núcleo, produzindo alongamento e, em seguida, condensando espermatídeos, respectivamente. Os produtos finais são os espermatozóides, que são liberados no lúmen do túbulo seminífero e, finalmente, para o epidídimo, onde eles amadurecem mais. Como o processo de espermatogênese depende de condições hormonais e moleculares especiais emos testículos, um sistema in vitro de cultura de confiança para todo o processo de espermatogénese ainda não foi desenvolvido 2,3. Métodos de cultura têm sido desenvolvidos para a criação de &quot;células-como células germinativas primordiais&quot; e, &quot;espermátides-como a volta&quot; haplóides a partir de células-tronco, mas estes métodos ainda não são capazes de gerar um grande número dessas células e não conseguem produzir células espermatogênico mais tarde tipos 4,5. Felizmente, os tipos de células espermatogénicas diferem significativamente de tamanho, que permite a uma suspensão de uma única célula obtidos a partir de testículos inteiras sejam separadas com um gradiente de líquido. O método STA-PUT, demonstrado aqui, usa um gradiente linear BSA e sedimentação simples para separar células espermatogênicas com base no tamanho e massa 6-9. O método STA-PUT tem várias vantagens sobre os outros dois métodos mais amplamente utilizados para separar os tipos de células espermatogénicas: FACS e elutriação 10-13. O aparelho STA-PUT requer only vários pedaços de vidro especializada montado em uma sala fria ou geladeira grande. Assim, é menos dispendioso do que o uso de um separador de células ou um elutriator. O método STA-PUT produz quantidades elevadas de células, por tipo de célula e os testículos do que pode ser classificada por FACS num período de tempo comparável, embora a pureza de cada população de células não é tão elevada quanto as obtidas com FACS 11. Células de triagem utilizando esferas magnéticas (triagem magnético ativado celular, MACS), recentemente tem sido empregada com sucesso para o enriquecimento das espermatogônias a partir de uma população de células dos testículos mista, mas de momento inadequado para separar espermatócitos ou espermátides, devido à falta de conhecimento da superfície apropriada marcadores 14. Uma vantagem adicional do método de STA-PUT sobre FACS ou MACS é a capacidade para isolar células viáveis ​​adequados para a cultura subsequente, porque, em contraste com a maioria dos protocolos de FACS, que não requer qualquer ADN ou outros tipos de coloração. Para os estudos que requerem lrendimentos ARGE, de espermatogênicas tipos de células em ~ 90% de pureza, o STA-PUT é um método ideal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:109px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:255px;">10857 100MG</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="91">
			<td height="91" style="height:91px;width:311px;">KREBS (10x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20</td>
			<td style="width:183px;">Autoclave/filter and store at 4 &#176;C for several months.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">KREBS (1x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Collagenase</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">C9891-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">DNAse</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">DNEP-5MG</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Trypsin</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">T9201-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Triton-X100</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Formaldehyde (~37%)</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">TABLE 2: EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:255px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:311px;">Complete STA-PUT apparatus</td>
			<td style="width:109px;">ProScience Glass Shop</td>
			<td style="width:255px;">STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td>
			<td style="width:183px;">Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10 &#956;m mesh filter</td>
			<td style="width:109px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:255px;">22363549</td>
			<td style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mouse dissection tools</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:311px;">14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:547px;">Need approximately 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Fraction collector</td>
			<td style="width:109px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:255px;">Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Microscope slides, cover glass</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Light/Fluorescent Microscope</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

Espermatogénese mamífero é um processo de diferenciação complexo que ocorre em várias etapas, os túbulos seminíferos dos testículos. Atualmente, não existe um sistema de cultura de células confiável permitindo a diferenciação da espermatogênese in vitro, ea maioria dos estudos biológicos das células espermatogênicas requerem colheita de tecidos a partir de modelos animais, como ratos e ratinhos. Porque o testículo contém numerosos tipos de células - tanto não-espermatogênico (Leydig, Sertoli, mielóides e células epiteliais) e espermatogênicas (espermatogônias, espermatócitos, espermátides redondas, condensando espermátides e espermatozóides) - estudos dos mecanismos biológicos envolvidos na espermatogênese requer o isolamento e o enriquecimento destes tipos de células diferentes. O método STA-PUT permite a separação de uma população heterogénea de células - neste caso, a partir de testículos - por meio de um gradiente linear de BSA. Tipos de células individuais sedimentar com velocidade de sedimentação de acordo com a diferente cetamanho ll, e fracções enriquecidas com diferentes tipos de células pode ser recolhido e utilizado em análises posteriores. Enquanto o método de STA-PUT não resulta em fracções de elevada pureza de tipos de células, por exemplo, como pode ser obtido com determinados métodos de classificação celular, que faz prever um rendimento muito maior do total de células em cada fracção (~ 1 x 10 8 células / tipo de célula espermatogênico de uma população inicial de 7-8 x 10 8 células). Este método de alto rendimento exige apenas vidraria especializada e pode ser realizada em qualquer sala fria ou geladeira grande, tornando-se um método ideal para laboratórios que têm acesso limitado aos equipamentos especializados como uma fluorescência ativada classificador de células (FACS) ou elutriator.

O resultado ideal do processo de STA-PUT é uma separação bastante perceptível de células dos testículos com base no tamanho de célula e a densidade. Enquanto as células isoladas a partir dos testículos são sedimentando através do gradiente de BSA, várias bandas distintas de células pode ser observada. Quaisquer aglomerados de células tendem a afundar-se para o fundo do gradiente e não contaminam as outras fracções. Um pouco mais acima do gradiente será o grande somáticas e células meióticas. Mais ac...

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Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

O método STA-PUT permite a separação das diferentes populações de células espermatogénicas com base no tamanho e densidade.

A separação de tipos de células espermatogênicas Usando STA-PUT velocidade de sedimentação

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Research

JoVE Journal

Biology

25.5K visualizações.  University of Pennsylvania.  O método STA-PUT permite a separação das diferentes populações de células espermatogénicas com base no tamanho e densidade. 

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

Medição Exocitose em Neurônios Usando Labeling FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Biologia

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separação eletroforética de proteínas

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

Acasalamento e separação da Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Para análise genética

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

Dois tipos de ensaios para detecção de quimiotaxia Sapo Sperm

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

Electroforese em gel de agarose para separação dos fragmentos de DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

A Novel Bayesiana Algoritmo de Mudança-ponto para Genome-wide Análise de tipos de dados ChIPseq Diversos

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

Separação de Ectoderma embrionárias de camundongos Facial e mesênquima

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

Comparação de tabaco métodos de remoção de células hospedeiras de proteínas por descascamento plantas intactas ou por tratamento térmico de extratos

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...