O método simples e barato que chamamos de MDR permite isolar populações enriquecidas de espermatos pachytene, espermatóides redondos e espermatização alongadora de testículos de camundongos. A principal vantagem do método MDR é sua simplicidade. Você precisa apenas de equipamentos de laboratório padrão que estão disponíveis na maioria dos laboratórios de pesquisa biomédica.
O protocolo MDR é ótimo para pesquisadores que fazem estudos funcionais sobre células germinativas masculinas. Por exemplo, grupos que estudam a espermatogênese, fatores que afetam a fertilidade masculina, bem como a herança epigenética paterna. É necessário um material inicial mínimo para o método MDR.
E, na verdade, nós rotineiramente obtemos uma boa quantidade de células usando apenas um rato masculino adulto. Comece montando os equipamentos e reagentes necessários. Coloque um banho de água a 37 graus Celsius e uma incubadora de cultura celular de 34 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade.
Coloque uma rotadora de tubos dentro da incubadora. Prepare e rotule a quantidade apropriada de lâminas de vidro microscópia, em seguida, desenhe um anel de cerca de um centímetro de diâmetro com uma caneta de graxa, e deixe a graxa secar. Quando estiver pronto para dissecar o animal, pulverize o abdômen ventral do camundongo com 70% de etanol e use uma tesoura para fazer uma abertura em forma de V na cavidade pélvica abdominal.
Puxe a almofada de gordura epidídica com fórceps, localize os testículos e remova-os com uma tesoura, certificando-se de evitar perturbar a tunica albuginea. Coloque os testículos em uma placa de Petri de seis centímetros contendo 1X KREBS. Descapsular os testículos e descartar a tunica albuginea, em seguida, dispersar ligeiramente os túbulos seminiferos, provocando-os suavemente com fórceps.
Transfira-os para um tubo cônico de 50 mililitros contendo dois mililitros de solução de colagem recém-preparada. Incubar os túbulos no banho de água Celsius de 37 graus por três minutos, agitando-os suavemente balançando. Em seguida, adicione pelo menos 40 mililitros de 1X KREBS quentes e deixe os túbulos sedimentarem à temperatura ambiente.
Retire o supernatante e repita a lavagem mais uma vez. Adicione 25 mililitros de solução de trippsina recém-preparada. Coloque o tubo no rotador dentro da incubadora de cultura celular, e deixe-o lá por 15 a 20 minutos, girando a aproximadamente 15 rpm.
Verifique esporadicamente os túbulos. Uma vez que a solução fique nublada e apenas pequenos pedaços dos túbulos permaneçam, coloque o tubo no gelo e prossiga para o próximo passo. Filtre a solução através de um filtro de célula de 40 micrômetros em um novo tubo cônico de 50 mililitros no gelo.
Em seguida, centrifuá-lo a 600 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius para pelotar as células. Despeje cuidadosamente o supernasciente e bata na pelota celular para resuspensar as células no restante do 1X KREBS. Adicione pelo menos 40 mililitros de KREBS frios 1X às células resuspended e repita a centrifugação.
Resuspend as células tocando o tubo. Em seguida, monte uma ponta de pipeta sobre uma pipeta de um mililitro e corte-a de modo que a abertura tenha cerca de três milímetros de diâmetro. Adicione até três mililitros de 0,5% BSA no KREBS.
Resuspengem as células pipetando para cima e para baixo, certificando-se de evitar bolhas. Filtre a suspensão da célula através de um filtro de 40 micrômetros e prossiga imediatamente para carregar as células no gradiente BSA. Você deve obter uma suspensão celular única homogênea antes de carregar as células no gradiente.
Células agrupadas irão sedimentar mais rápido, interrompendo seu gradiente e contaminando as frações. Configure um tubo de 50 mililitros verticalmente no gelo, certificando-se de que é possível ver um lado do tubo. Em seguida, corte cerca de cinco a dez milímetros da ponta de uma pipeta sorológica de dez mililitros e monte-a em um controlador de pipeta.
Pipeta cinco mililitros da solução 5%BSA na parte inferior do tubo de 50 mililitros. Toque suavemente a superfície da solução de 5% com a ponta cortada da pipeta e lentamente coloque cinco mililitros de solução 4%BSA em cima da solução de 5%. Repita este procedimento com outras soluções BSA para obter um gradiente de 5% a 1%BSA.
Uma linha clara deve ser visível entre as camadas. Em seguida, carregue cuidadosamente a suspensão de célula única em cima do gradiente sem perturbá-lo. Deixe as células sedimentarem através do gradiente por uma hora e meia.
Usando uma ponta de pipeta cortada, colete cuidadosamente as frações de um mililitro em tubos separados de 1,5 mililitro e armazene-os no gelo, certificando-se de numerar os tubos na ordem em que foram coletados. Centrifugar as frações de células germinativas a 600 x g por dez minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, tomando cuidado para não perturbar a pelota, descartar a maior parte do supernante e resuspend as células piscando o tubo.
Adicione um mililitro de tampão KREBS frio de 1X a cada tubo e repita a centrifugação. Descarte a maior parte do supernascer, deixando cerca de 100 microliters e resuspenque a pelota celular cuidadosamente. Para analisar as frações celulares, comece por tubos de 20 microlitrais de 4% paraformaldeído dentro de cada anel de caneta graxa em um slide de microscopia numerada.
Adicione imediatamente dois microliters das células resuspended da fração correspondente. Em seguida, seque os slides à temperatura ambiente por pelo menos uma hora. Enxágüe os slides uma vez com PBS e use um meio de montagem com DAPI para montar os slides.
Analise cada slide sob um microscópio de fluorescência para estimar qual tipo de célula germinacionária específica é enriquecido em cada fração. Uma vez que uma amostra de cada fração tenha sido colhida para microscopia, adicione um mililitro de KREBS 1X frio gelado a cada fração e centrifugar as células a 600 a 13000 x g por dez minutos a quatro graus Celsius. Remova e descarte o supernatante e continue com a análise a jusante preferida.
Este protocolo funciona particularmente bem para enriquecer espermatozoides redondos. O enriquecimento acima de 90% foi alcançado nas frações dois, três e quatro. Espermicas alongadoras tendem a ficar em cima do gradiente e foram coletadas com a primeira fração.
Devido ao seu grande tamanho, os espermatocitotas de paquiteno sedimentam mais rápido e foram coletados por último. O enriquecimento foi de cerca de 75% nas frações 14 e 15. O RNA total obtido da maioria das frações variou de 0,5 a 2,5 microgramas, o suficiente para análises de RNA a jusante.
A quantidade de proteína obtida de cada fração tipicamente variou de 20 a 140 microgramas, o que é suficiente para várias manchas ocidentais. Neste protocolo, 10% dos lises proteicos derivados de frações únicas foram suficientes para detectar claramente proteínas DDX4, PIWIL1 e PIWIL2 em uma mancha ocidental padrão. A quantidade de proteína em uma fração também foi suficiente para a imunoprecipitação usando um anticorpo contra PIWIL1, bem como para a detecção de PIWIL2 coimmunoprecipitado.
Mesmo para uma primeira vez, este protocolo funciona muito bem desde que você certifique-se de que o pré-tratamento de suas células é bom, e nada perturba seu gradiente durante a sedimentação. A partir de um único mouse, você tem células altamente enriquecidas, que podem ser usadas para diferentes análises a jusante, como RT-PCR, sequenciamento de RNA, imunoprecipitação e mancha ocidental. Embora o MDR não seja o único método para enriquecer células germinativas masculinas, é uma ferramenta muito conveniente porque não requer equipamentos especializados ou treinamento extensivo.
