Este trabalho foi financiado pela Universidade de Calgary, no âmbito de um novo investigador arranque concessão ao Dr. Ungrin.

NOTA: placas de micropoços estão disponíveis em diferentes formatos, dependendo dos resultados desejados. Especificações assim como linhas aproximados para os números mínimos e máximos de células que devem ser utilizados com cada formato são mostrados na Tabela 1. Os micropoços menores diminuir para uma ponta afiada, e, portanto, não há limite de tamanho menor, embora a variabilidade entre esferóides se torna mais significativo em tamanhos menores. Produção de rotina de esferóides de uma média de menos de 20 células de cada um é simples 8. Quanto maior o tamanho de micropoços não é totalmente cónica, por conseguinte, as tentativas para formar esferóides de pequenos números de células pode resultar em múltiplos esferóides menores em cada micropoço. Devido a pequenas diferenças nas propriedades da superfície, a preparação com a solução de surfactante (passo 1.2) não é opcional quando se utiliza placas AggreWell 400EX. Este protocolo baseia-se na utilização de AggreWell 400 placas - por outros formatos contrasult Tabela 1. O número de células a serem carregados em cada poço é determinada multiplicando o número de micropoços que contém pelo número de células para ser agrupados para cada esferóide. Por exemplo, para gerar esferóides de 1000 células cada, cada poço tem de ser carregada com 1200 (esferóides vezes cada 1.000 células) = 1,2 x 10 6 células. A densidade celular deve ser calculada tendo em conta que as células serão carregados em um volume de 0,4 ml. Assim, para o exemplo de esferóides formados a partir de 1000 células cada um, 1,2 x 10 6 células em 0,4 ml traduz para uma densidade de 3 x 10 6 culas por ml. 1. Preparar micropoços para recebimento Células <ol><li> Microplacas são estéreis, como previsto, e só deve ser retirado da sua embalagem em um ambiente estéril, como uma cabine de segurança biológica de fluxo laminar. A esterilidade deve ser mantida durante todo o protocolo. Caso a esterilidade ser comprometida, os poços são novamente esterilizado usando etanol a 70% em água, utilizando oseguindo os passos opcionais. <ol><li> Adicionar 0,5 ml de etanol a 70% a cada poço não utilizado. Alguns micropoços bolhas de ar armadilha, embora este possa ser reduzido pela adição de líquido de um lado, e permitindo que ele se espalhe ao longo da superfície, em vez de deixá-la cair verticalmente sobre a superfície. Substituir tampa. </li><li> Embora o vapor de etanol deve permear rapidamente quaisquer bolhas, se houver um grande número pode ser desejável removê-los. Centrifugar durante 2 minutos a 2.000 x g. Note-se que é importante assegurar que o rotor está adequadamente em relação a esta velocidade. </li><li> Usando uma baixa ampliação microscópio invertido, verificar bolhas foram removidos das cavidades. </li><li> Incubar durante 5 minutos com a tampa colocada à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar etanol. Placa pode agora ser lavada com água ou PBS estéril para utilização imediata, ou ar seco para o armazenamento. </li></ol></li><li> A fim de assegurar que as células não interagem com a superfície do micropoço, que pode ser preparado usando um surfactante. Em geral, éaconselhável realizar esta etapa, inicialmente, e posteriormente comparar esferóides gerados com e sem micropoços revestida de surfactante. <ol><li> Adicionar 0,5 ml de solução de enxaguamento para cada poço. Alguns micropoços bolhas de ar armadilha, embora este possa ser reduzido pela adição de líquido de um lado, e permitindo que ele se espalhe ao longo da superfície, em vez de deixá-la cair verticalmente sobre a superfície. Substituir tampa. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 2000 xg para remover bolhas. Note-se que é importante assegurar que o rotor está adequadamente em relação a esta velocidade. </li><li> Usando uma baixa ampliação microscópio invertido, verificar bolhas foram removidos das cavidades. </li><li> Incubar durante pelo menos trinta minutos, com a tampa sobre a temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C. As placas podem ser armazenadas em quatro graus, com a solução de agente tensioactivo nos poços até ser necessário, se devidamente selados para evitar a secagem. </li><li> Lavar a placa com água estéril ou com PBS imediatamente antes de usar. Não permita que as placaspara secar após o revestimento. </li></ol></li></ol> 2. Preparando Células NOTA: Os detalhes da preparação de células irá variar um pouco com o tipo específico de célula a ser estudada. No entanto, temos observado essas condições para ser eficaz com uma ampla variedade de células, incluindo as linhas discutidos aqui, assim como as células-tronco embrionárias humanas e de ratinho (ESC), células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (IPSC), fibroblastos, endoderme primitiva putativo, e células estromais. Outros grupos têm utilizado este sistema com sucesso para uma ampla gama de aplicações, incluindo condrogênese a partir de células-tronco mesenquimais 9, a geração de precursores neurais padronizado a partir de células-tronco pluripotentes 10, as análises toxicológicas em hepatócitos 11 e avaliação da regeneração da medula espinhal em salamandras 12. O protocolo específico para trabalhar com células HT29 é mostrado aqui. <ol><li> Comece com um frasco T75 de células HT29, cultivadas em DMEM+ 10% de FBS </li><li> Aspirar o meio de crescimento do balão, e adicionar 3 ml de tripsina. </li><li> Incubar as células durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Parar a digestão de tripsina por adição de 3 ml de meio de crescimento. Tomar uma aliquota para contagem de células e transferir o restante para um tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 200 x g. </li><li> Enquanto a centrifugação está em andamento, a contagem das células. </li><li> Aspirar tripsina / mistura de meio e substituir com meio de crescimento fresco, o volume determinado pela densidade celular necessária como calculado acima. </li><li> (OPCIONAL) Passe a suspensão de células através de um filtro para remover quaisquer aglomerados. NOTA: as condições de colheita de células irá variar um pouco entre linhas. Se um protocolo de dissociação por exemplo passagem das células de interesse está disponível, que deve ser usada como um ponto de partida. Com linhas de células sensíveis a utilização de tripsina pode resultar em morte celular excessiva. Nestes casos temos observado bons resultados usando TrypLE como uma alternativa dissociatiem 8 de reagente. Se as células tornam-se agregada durante dissociação e perder a viabilidade, a adição de DNAse para a solução de enzima pode resolver este problema. A redução dos tempos de dissociação e empregando uma etapa de trituração para quebrar aglomerados de células também pode aumentar a viabilidade. </li></ol> 3. Formação esferóide NOTA: esferóides podem ser gerados numa grande variedade de formulações de meios, no entanto, os ensaios iniciais deve ser efectuada utilizando o meio em que as células foram cultivadas, para distinguir as consequências da transição para um sistema de cultura de 3-dimensional a partir de consequências de alterar a composição do meio. <ol><li> Adicionar 0,4 ml de meio de crescimento em cada poço. </li><li> Centrifugar durante 2 minutos a 2000 xg para remover bolhas. Note-se que é importante assegurar que o rotor está adequadamente em relação a esta velocidade antes da centrifugação. </li><li> Usando uma baixa ampliação microscópio invertido, verificar bolhas foram removidos das cavidades. </li><li> Adicionar 0,4 mlsuspensão de células, a uma densidade requerida (calculado acima). Misture suavemente pipetando cima e para baixo, sem a introdução de bolhas de ar nas cavidades. É importante assegurar que as células são distribuídos uniformemente ao longo do poço, a fim de obter esferóides consistentes. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 200 x g. Se a placa não auto-nível, durante a centrifugação, as correntes de convecção que podem surgir em resultado de distribuição desigual de células entre os micropoços. Portanto, a chapa deve ser equilibrado internamente, bem como contra a outra placa, de modo que o peso é distribuído de forma uniforme para ambos os lados da placa transportadora. </li></ol> NOTA: Se a evidência da distribuição desigual de células é visto, pode ser necessário aplicar uma pequena quantidade de lubrificação para os pontos de articulação no suporte da placa - consulte o fabricante centrífuga para obter instruções. NOTA: Uma vez que as células foram centrifugadas em micropoços, eles são razoavelmente resistante para lavagem de movimentos da placa de menores. Movimentos bruscos que resultem em chapinha do meio devem ser evitados, mas a transferência da placa de centrífuga para microscópio ou incubadora não deve resultar em deslocamento celular significativa. <ol start="6"><li> Utilizando um microscópio invertido, verificar que as células foram agrupadas dentro dos micropoços, e que estão distribuídos uniformemente ao longo do poço. </li><li> Incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Utilizando um microscópio invertido, observar o processo de formação de esferóides. Algumas linhas de células irão formar esferóides compactos dentro de 24 horas, outros podem demorar mais tempo. A progressão do aglomerado para agregar em células HT29 é mostrado na Figura 2. </li><li> Recuperar esferóides de micropoços e transferir para cultura de suspensão por gentilmente jorrando-los com uma pipeta. Como alternativa, manter esferóides in situ com a substituição média 8 - a duração depende do seu tamanho inicial e taxa de crescimento, que define o tempo até que eles superam os micropoços em que foram formados. <ol><li> Para substituir o meio, sem a perda de esferóides, meio aspirado na extremidade do poço com uma pipeta de Pasteur. Lentamente traga a ponta para baixo até que comece a desenhar o líquido do menisco, e siga o menisco para baixo como ele cai. Em seguida, adicionar meio fresco, contra a parede do poço, no mesmo local. Algumas esferóides podem ser perdido, no entanto se o meio é aspirado e substituído sempre na mesma posição, este permanecerá número pequeno em comparação com o grande número de poço. </li></ol></li></ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr. Ungrin tem um interesse financeiro na tecnologia AggreWell como um inventor.

Nós estabelecemos um sistema em que um grande número de esferóides uniformes podem ser gerados a partir de múltiplas linhagens de células de diferentes fontes. Temos ainda encontrar uma linha de células aderentes que não formam esferóides sob estas condições. Nós já observamos perda de células em populações sujeitas a anoikis 5,8, no entanto até o momento esta questão não surgiu com linhagens tumorais. O sistema é escalonável arbitrariamente com a área de superfície, com o comportamento consistente em micropoços de 24 poços e formato de 6 poços, bem como bioreactores protótipo contendo 50.000 micropoços cada actualmente em desenvolvimento. Deve esferóides assimetria ser uma preocupação, o tempo de incubação no passo 4.8 pode ser aumentada para dois ou três dias. Esferóides também pode ser incubada por um período de, após extracção a partir dos micropoços, para aumentar a simetria, no entanto, neste caso, deve ser tomado cuidado para manter as densidades de cultura suficientemente baixo, como esferóides em contacto um com o outro will muitas vezes se fundem em estruturas maiores. Por este motivo, já anteriormente mantidas culturas dentro dos micropoços em que foram formados os agregados, com a principal limitação é o tamanho do esferóide. Este por sua vez é uma função tanto da taxa de crescimento e o tamanho inicial 8, e se a cultura alargada dentro da microplaca está prevista, esta deve ser considerada com antecedência. Opções para evitar crescimento excessivo, se ocorrer, incluir ou começando com esferóides menores, ou empregando os micropoços maiores da placa AggreWell 800. Deve esferóides não conseguem aumentar a coerência ao longo do tempo, uma causa potencial pode ser a morte da célula. Particularmente em grandes agregados de células altamente metabolicamente ativas, as limitações de transporte de massa sobre o fornecimento de oxigênio e nutrientes essenciais pode resultar em um núcleo necrótico 2 - portanto, um esferóide não coeso pode ser simplesmente uma conseqüência da morte excessiva de células. Alternativamente, medições da coesão mecânicação de esferóides foram usadas para avaliar a forças de ligação intercelular, em relação com o potencial metastático de uma dada linha de células 13. Seria interessante investigar a relação entre a forma esferóide e potencial metastático, talvez usando parâmetros morfométricos como arredondamento e perímetro para razão de área. Além de investigar as propriedades mecânicas e morfométricas de esferóides, a montagem do sistema de micropoços permite a produção em larga escala de esferóides mista de composição, que consiste em combinações de vários tipos e / ou de biomateriais 6,7 celulares. As interacções de células tumorais com outros tipos de células é importante para modelar mais de perto o comportamento de tumores in vivo 14, por isso, pode ser de interesse para gerar esferóides de células tumorais em combinação com os fibroblastos e células endoteliais, por exemplo. As micropartículas de vários biomateriais também pode ser incorporado, e pode afectar a esfPropriedades eroid tanto directamente, através das suas interacções com células 7,15, e também como reservatórios para a libertação controlada de factores de crescimento e citocinas para o interior do esferóide 16. Se houver qualquer preocupação com a esterilidade, por exemplo quando se trabalha com uma microplaca em que alguns poços já foram usados, que podem ter passado algum tempo em uma incubadora, como parte de um experimento anterior, os poços podem ser reesterilizado com etanol 70% na água. Uma vez que os esferóides foram formadas, elas podem também ser separadas das células não incorporados residuais por passagem da suspensão ao longo de um filtro de células. As células individuais vai passar, enquanto os esferóides será retida. Se o esferóide é suspeito de derramamento de células potencialmente metastático ao longo do curso da cultura, pode ser desejável para realizar este procedimento várias vezes - inicialmente para remover as células não incorporados, e subsequentemente para isolar purified populações das células fora dado por esferóides.

Existe um crescente corpo de evidências de que as células tumorais se comportam de forma diferente em três culturas tridimensionais do que quando cultivadas em plástico, e que os agentes terapêuticos identificados em plataformas de cultura de tecidos convencionais podem perder eficácia quando a transição para um sistema mais fisiologicamente relevantes 1. É desejável, portanto, para estudar o comportamento de células cancerosas sob estas condições, ambos os a perceber melhor a sua biologia subjacente, e também para aumentar a taxa de sucesso de transição de novos agentes terapêuticos a partir da instalação de rastreio para a clínica. Um sistema de modelo de utilidade, com uma longa história emprega aglomerados tridimensionais das células cancerosas conhecidas como esferóides tumorais 1,2. Idealmente, as técnicas para formação de esferóide iria permitir a produção de grandes números de esferóides uniformes, cuja dimensão e composição são controladas pelo experimentador. Enquanto pendurado soltar e bem-plate aproxima 3,4 são capazes de cumprir algumas dessas resitos, o rendimento é geralmente limitado, e geração de um grande número de esferóides se torna uma tarefa trabalhosa. Recentemente, desenvolveu um sistema para resolver desafios semelhantes no campo da medicina regenerativa 5. Empregando agregação forçada dentro de uma série de poços em escala mícron densamente compactados (ver Figura 1), esta abordagem permite a produção de esferóides de números arbitrários de células, incluindo misturas de vários tipos de células 6, bem como a incorporação de vários biomateriais 7. Esferóides são formados em grande número - milhares de centenas de milhares ou mais - e pode ser extraído imediatamente ou mantidas nos micropoços em que foram formados com troca de meio por pelo menos um 8 a dois (observação não publicada) semanas. Este sistema é, portanto, bem adequado para a geração de um grande número de uniforme e esferóides tumorais reprodutíveis para a avaliação da effectiveness de novos agentes antitumorais ou investigações biológicas básicas.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

Esferóides de tumor são cada vez mais reconhecido como uma importante modelo in vitro para o comportamento de células de tumor em três dimensões. Mais fisiologicamente relevante do que as culturas convencionais aderente folhas, eles recapitular com mais precisão a complexidade e as interações presentes em tumores reais. A fim de utilizar este modelo para avaliar melhor a biologia do tumor, ou a eficácia de novos agentes terapêuticos, é necessário ser capaz de gerar esferóides de forma reprodutível, de uma maneira controlada e em números significativos. O sistema AggreWell consiste de uma matriz de alta densidade de micropoços em forma de pirâmide, em que uma suspensão de células isoladas é centrifugado. Os números de células de agrupamento, na parte inferior de cada micropoço, e o número e proporção de diferentes tipos de células envolvidas dependem apenas das propriedades da suspensão introduzida pelo experimentador. Assim, somos capazes de gerar esferóides tumor de tamanho e composição arbitrária coma necessidade de modificar a tecnologia de plataforma subjacente. As centenas de micropoços por centímetro quadrado de superfície da cultura, por sua vez garantir que os níveis de produção extremamente elevados podem ser alcançados através de um processo intensivo de nonlabor simples. Esperamos, portanto, que este protocolo será de grande utilidade para pesquisadores da área esferóide tumor.

Esferóides de várias linhas tumorais de origens anatómicas diferentes pode facilmente ser gerada e extraiu-se em cultura em suspensão. Figura 3 ilustra o controlo de tamanho consistente obtidas através deste método, com populações de esferóides altamente uniformes sob cada condição. Limpar as diferenças inter-linha de comportamento também são visíveis, com células de câncer de cólon HT29 e células cancerosas do esôfago TE6 formando esferóides densamente com fronteiras bem definidas, enquanto as células de câncer de próstata LNCaP deu origem a esferóides menos coerentes com limites irregulares (ver discussão para possíveis razões ). As forças internas mais fortes nos agregados mais coerentes também resultou em colapso para uma forma mais simétrica, mesmo enquanto ainda nos micropoços em que foram formados, enquanto que os agregados LNCaP, particularmente no tamanho maior, visivelmente reter a geometria quadrado-piramidal do micropoços. A relação entre o número de células de entrada e os phys<html> ical tamanho do esferóide resultante irá depender de um número de variáveis. Volumes teóricos baseados no produto do volume de cada célula e o número de células utilizadas pode ser reduzida pela perda de células, o que por sua vez podem incluir perda de células durante a fase de suspensão de células individuais, bem como a perda de demasiado pequenos agregados devido Números insuficientes de vizinhos e de excessivamente grandes agregados devido a limitações de transporte e necrose no núcleo. Tamanho também será influenciada por qualquer proliferação que pode ocorrer durante o processo de agregação. À medida que estes parâmetros irão variar de linha celular para linha celular, se esferóides de dimensões físicas específicas são desejados do número correcto de células para introduzir deve ser determinada experimentalmente. Como uma primeira aproximação, diâmetro esferóide deverá aumentar com a raiz cúbica do número de células incorporadas - por exemplo, um aumento de 8-vezes no número de células deverá resultar na duplicação de diâmetro esferóide. <html> _content &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de produção esferóide. O sistema consiste de micropoços de uma matriz de quadrados micropoços-piramidal embaladas apertadamente (625 por cm 2 para a 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m de tamanho), em que as células podem ser centrifugadas. As células são reunidas pelas paredes laterais inclinadas, e do tamanho do esferóide resultante é controlada pela variação da densidade da suspensão celular empregue. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Assembléia de células agrupadas em esferóides. Spheroids foram formados a partir de setecentos HT29 células cada. Imediatamente após a centrifugação (A), as células são fracamente aglomeradas no fundo de cada micropoço. Note-se que os aglomerados estão uniformemente deslocamento para a direita inferior, neste caso. Isto é aceitável, desde tamanhos de cluster permanecem consistentes em toda a matriz. Se as diferenças de tamanho significativo conjunto são vistos de um lado da matriz para o outro, ver a Nota no passo 3.5. Após incubação durante 24 horas (B), as forças de adesão intercelular causaram os aglomerados para agregar e formar esferóides coerentes, que podem então ser extraídos (C). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Figura 3. Esferóides gerados em placas de microcavidades. Esferóides foram formados a partir de setecentos (A, C, E) ou mil e quinhentos (B, D, F), as células de cancro do cólon HT29 (A, B), células de cancro da próstata LNCaP (C, D) ou TE6 células cancerosas do esôfago (E, F). Note-se a consistência de esferóides no interior de uma preparação, bem como a variação entre as linhas de células, em particular - os agregados LNCaP soltas em comparação com o HT29 mais densamente compactados e células TE6. A barra de escala representa 200 fim. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Formato Microwell </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> Largura Microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Micropoços por cm2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156,25 </td></tr><tr><td> Micropoços por poço </td><td> 1200 </td><td> 4700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Células mínimos por micropoços * </td><td> N / D </td><td> N / D </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Células máximas por micropoços * </td><td> 2000 </td><td> 2000 </td><td> 10.000 </td></tr><tr><td> Células mínimos por bem * </td><td> N / D </td><td> N / D </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Células máximas por bem * </td><td> 2,4 x 10 6 </td><td> 9,4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70% do volume de etanol (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Lavar volume de solução (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2.0 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 3.2 - O volume de pré-carga Médio (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> 3.5 - O volume de carga celular (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * Os números de células por micropoço são somente uma aproximação, como este valor pode variar com o tamanho das células específicas empregues, e devem ser determinadas empiricamente </td></tr></tbody></table> Tabela 1. AggreWell opções e modificações do protocolo.

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Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Nós introduzimos um protocolo para a geração de um grande número (milhares a centenas de milhares) de tamanho-e esferóides uniformes tumor controlado por composição, usando placas de micropoços disponíveis no mercado.

Produção de grande número de controladas pelo tamanho Spheroids tumorais usando placas de micropoços

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.3K visualizações.  University of Calgary.  Nós introduzimos um protocolo para a geração de um grande número (milhares a centenas de milhares) de tamanho-e esferóides uniformes tumor controlado por composição, usando placas de micropoços disponíveis no mercado. 

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Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Bioengenharia

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nutrient regulamento, a alimentação contínua de Expansão em grande escala de células de mamíferos em Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Clonagem e produção em larga escala de alta capacidade vetores adenovirais com base no tipo adenovírus humano 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Montagem e Rastreamento do Desenvolvimento de Comunidade Microbiana em uma Plataforma Microwell Array

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was pretreated with NaOH and washed to a neutral pH. Cellulase was added to the pretreated bamboo powder to generate the hydrolysate, which contained 30 g/L glucose and 15 g/L xylose and was used as the carbon source to prepare a medium for chemical production. When cultured in microaerobic conditions, 12.7 g/L 2,3-butanediol was produced by wildtype K. pneumoniae. In aerobic conditions, 13.0 g/L R-acetoin was produced by the budC mutant of K. pneumoniae. A mixture of 25.5 g/L 2-ketogluconic acid and 13.6 g/L xylonic acid was produced by the budA mutant of K. pneumoniae in a two-stage, pH-controlled fermentation with high air supplementation. In the first stage of fermentation, the culture was maintained at a neutral pH; after cell growth, the fermentation proceeded to the second stage, during which the culture was allowed to become acidic.

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo powder was pretreated with NaOH and enzymatically hydrolyzed. The hydrolysate of bamboo was used as the feedstock for 2,3-butanediol, R-acetoin, 2-ketogluconic acid, and xylonic acid production by Klebsiella pneumoniae.

Produção de produtos químicos por<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Usando o hidrolisado de bambu como matéria-prima

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, chitosan microgels are commonly fabricated using emulsion methods that require organic solvent rinses, which are toxic and harmful to the environment. The present protocol presents a rapid, non-cytotoxic, non-emulsion-based method for fabricating chitosan-genipin microgels without the need for organic solvent rinses. The microgels described herein can be fabricated with precise size control. They exhibit sustained release of biomolecules, making them highly relevant for tissue engineering, biomaterials, and regenerative medicine. Chitosan is crosslinked with genipin to form a hydrogel network, then passed through a syringe filter to produce the microgels. The microgels can be filtered to create a range of sizes, and they show pH-dependent swelling and degrade over time enzymatically. These microgels have been employed in a rat growth plate injury model and were demonstrated to promote increased cartilage tissue repair and to show complete degradation at 28 days in vivo. Due to their low cost, high convenience, and ease of fabrication with cytocompatible materials, these chitosan microgels present an exciting and unique technology in tissue engineering.

The present protocol describes a non-emulsion-based method for the fabrication of chitosan-genipin microgels. The size of these microgels can be precisely controlled, and they can display pH-dependent swelling, degrade in vivo,&#160;and be loaded with therapeutic molecules that release over time in a sustained manner, making them highly relevant for tissue engineering applications.

Fabricação de microgéis chitosan-genipin controlados por tamanho e sem emulsão para aplicações de engenharia de tecidos

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...