Este protocolo demonstrou um método padronizado de construção de tumores tridimensionais de esferoides. E esta metodologia proporcionou uma análise de alto circuito e alto conteúdo de construções tumorais 3D. Usando um método padrão de construção esferoide tumoral e um sistema de imagem e análise de alto rendimento, a eficácia e a precisão dos testes de drogas formados em esferoides tridimensionais podem ser dramaticamente aumentadas.
Neste protocolo, usamos AMG510 para tratar o esferoide NCI-H23 como exemplo. A partir do experimento, pudemos observar um efeito significativo da droga alvo cancerígena sobre os esferoides tumorais. Para começar, pipete 100 microlitros de reagente antiaderência em cada poço de uma placa de 48 poços com fundo de poço em forma de U e guarde por 10 minutos.
Após 10 minutos, aspirar o reagente de revestimento e lavar duas vezes com PBS esterilizado. Coloque a placa de cultura em uma incubadora a 37 graus Celsius em ar umidificado com 5% de dióxido de carbono até o uso. Observe as células ao microscópio.
Em seguida, lavar as células cultivadas em frasco T25 duas vezes com PBS para remover o meio de cultura e tratar as células expandidas com um mililitro de EDTA de tripsina a 0,25% por um a dois minutos em estufa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono. Confirme a forma da célula ao microscópio. E então interromper o tratamento com tripsina aspirando a suspensão de EDTA de tripsina usada no frasco T25 e lavando as células com quatro mililitros de meio fresco.
Transfira toda a suspensão para um tubo de 15 mililitros e use um mililitro de meio fresco para lavar as células residuais e adicioná-lo ao tubo. Centrifugar as células a 186,48 G durante cinco minutos à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante. Adicione 10 mililitros de meio fresco ao pellet de células e pipete suavemente até que as células estejam em uma suspensão homogênea.
Aspirar 0,1 mililitros de suspensão celular em um novo tubo de centrífuga. Adicione 0,9 mililitros de meio fresco e, em seguida, pipetar bem a suspensão. Extrair 10 microlitros da suspensão celular para contagem celular.
Repita esse processo uma ou duas vezes e obtenha um valor médio. Diluir a suspensão para atingir uma densidade de semeadura final de 50.000 células por mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros da suspensão celular a cada poço de uma placa de fundo em U de 48 poços.
Embrulhe a película de vedação em torno da placa e centrifuja-a a 119,35 G durante cinco minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, retire a película protetora e adicione de cinco a oito mililitros de água esterilizada no canal de água ao redor dos poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius por cinco dias.
Não troque ou suplemente nenhuma água para o canal de água durante este período e observe a agregação celular durante os cinco dias seguintes. Para a incorporação do gel, depois de retirar o gel congelado da geladeira de 20 graus Celsius negativos, coloque-o em uma caixa de gelo durante todo o tempo durante o experimento. Observe os esferoides celulares ao microscópio.
Antes do início da incorporação do gel, o status dos esferoides deve ser verificado novamente. Remova cuidadosamente 150 microlitros do meio e incorpore cada esferoide no gel, adicionando lentamente o gel líquido do lado da parede do poço enquanto move a ponta da pipeta pré-resfriada ao redor e dentro do poço. Aguarde cinco minutos e, se o gel não se espalhar uniformemente, pipetar suavemente o gel com uma ponteira de pipeta de 10 microlitros.
Cada poço contém um esferoide tumoral, 25 microlitros de 3,5 miligramas por mililitro de gel e 50 microlitros de meio de cultura completo. Adicione 75 microlitros de meio aos controles também. Incubar a placa a 37 graus Celsius durante 30 minutos até que a hidrogelificação esteja totalmente concluída.
Confirme o estado de gelificação ao microscópio. Sobreponha 125 microlitros de meio fresco em cada amostra e cultive os esferoides por mais 7 a 10 dias. Prepare grupos de esferoides com quatro a seis poços cada e escolha pelo menos três deles para análise.
Dissolva o medicamento de acordo com as instruções do fabricante e prepare soluções de trabalho 100 vezes com DMSO. Use DMSO 0,1% como controle positivo e adicione 125 microlitros de meio tratado com drogas a cada poço. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 graus Celsius em ar umidificado com 5% de dióxido de carbono.
Nesta fase, cada poço contém um esferoide tumoral, 25 microlitros de 3,5 miligramas por mililitro de gel e 175 microlitros do meio. Os controles contêm 200 microlitros do meio. Meça a viabilidade do esferoide usando um kit de ensaio alamarBlue de acordo com as diretrizes do fabricante.
Aspirar 100 microlitros do meio sobrenadante de cada poço para uma nova placa de teste. Em seguida, medir a viabilidade usando um fotômetro de microplacas. Meça-o no primeiro dia, no quarto dia, no sétimo dia e no 10º dia após a incorporação dos esferoides no gel.
Adicione 80 microlitros de meio fresco a cada poço da placa de cultura. Em seguida, substitua mais 100 microlitros do meio tratado com o medicamento. Certifique-se de que não há restos de alamarBlue no poço.
Aspirar 100 microlitros do meio antes da aquisição de imagens e colocar a placa no palco. Obter imagens digitais dos esferoides usando um microscópio automatizado com uma objetiva dez vezes. O microscópio pode focar e centralizar esses esferoides automaticamente.
Aguarde a imagem automática. São adquiridas quatro imagens para cada esferoide. Uma imagem integrada é formada e processada com o software conectado ao sistema de imagem de alto conteúdo.
Clique no botão de processo de correção de imagem e escolha as imagens integradas no software. Escolha o modelo U net e digite a taxa de conversão. Clique na parte inferior da tela para iniciar o processamento da imagem.
Salve os dados de diâmetro, perímetro e rugosidade no software de planilha. Finalmente, adicione 100 microlitros de meio fresco com a droga e coloque a placa de volta na incubadora a 37 graus Celsius em ar umidificado com dióxido de carbono a 5%. As imagens de campo claro de esferoides celulares NCI-H23 tratados com diferentes concentrações de AMG510 e capturados automaticamente por um microscópio de alto conteúdo são mostradas nesta figura.
As colunas representam dias diferentes e as linhas representam diferentes concentrações de drogas. Os resultados incluem três esferoides para cada condição. A viabilidade esferoide tumoral dos grupos de amostra tratados com AMG510 foi medida no primeiro dia, no quarto dia, no sétimo dia e no 10º dia.
A viabilidade celular terminal das amostras com gradientes de concentração é mostrada nesta figura. Os diâmetros esferoides tumorais foram medidos no primeiro dia, no quarto dia, no sétimo dia e no 10º dia. A razão de crescimento esferoide foi definida como o volume terminal em relação ao volume original e calculada usando os diâmetros esferoides.
A razão de inibição do crescimento esferoide foi definida em relação ao volume e calculada usando os diâmetros esferoides. A rugosidade tumoral foi medida pelo software no primeiro dia, no quarto dia, no sétimo dia e no 10º dia, indicando a invasividade dos esferoides tumorais. O perímetro do esferoide foi localizado e desenhado pelo software utilizando algoritmos de aprendizagem profunda.
As áreas esferoides no plano focal foram então medidas pela imagem J e um índice de excesso de perímetro foi calculado com base nesses dados. Embora essa mensagem seja fácil de seguir, as amostras ainda precisam ser manuseadas com cuidado.
