The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

1. Preparação de polimérica aquosa sistema de duas fases (SADF) <ol><li> Pesar 0,5 g de polietileno glicol (PEG) (PM: 35.000) e adicioná-lo a 9,5 ml de meio de crescimento completo numa cónico de 15 ml estéril para preparar 10 ml de 5% (w / v) de PEG fase aquosa. Nota: A adição de metade do meio com o primeiro cónica seguido pela adição do polímero e, em seguida, a quantidade remanescente de forma minimiza a adesão do polímero às paredes cónicas e ajuda o polímero dissolver-se mais rapidamente. </li><li> Pesar 0,128 g de dextrano (DEX) (MW: 500.000) e adicioná-lo a 0,872 ml de meio de crescimento completo num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril para preparar a 1 ml de 12.8% (w / v) de fase aquosa DEX. </li><li> Vortex tanto soluções durante cerca de 1 min para dissolver os polímeros na forma. </li><li> Mantenha as duas soluções num banho de água a 37 ° C durante 1 hora para assegurar a dissolução e misturas homogéneas. Manter as tampas acima do nível de água para evitar a possibilidade de contaminação das soluções do banhoágua. </li><li> Carregar a solução em uma fase de PEG estéril, uma seringa de plástico e passá-la através de um filtro de seringa de 0,2 um de tamanho dos poros para remover as impurezas. Nota: Encher a seringa com a solução de PEG, colocá-lo na inserção do filtro no topo de um tubo cónico e utilizar a força, empurrar lentamente a solução através do filtro. É normal a ocorrência de resistência contra o movimento do êmbolo da seringa. Menor perda da solução de polímero ocorre como parte da solução permanece no filtro, mas a concentração de polímero não irá mudar. </li><li> Pipetar 10 ml da solução da fase de DEX e dilui-lo em 10 ul de meio em um tubo separado para resultar em 6,4% (w / v) de fase DEX. Aspirar 100 ul da solução da fase de PEG e fornecê-las a uma placa de Petri. <ol><li> Dispensar a 0,5 ul de 6,4% (w / v) de fase DEX na solução de fase de PEG. Confirme visualmente formação ATPS sucesso observando uma queda DEX sob um microscópio. O limite gotadeve permanecer visível, indicando presença de duas fases aquosas estáveis, separados. </li></ol></li><li> Guarde o estoque aquoso PEG e soluções fase DEX em 4 ° C até o uso. Nota: Recomenda-se que as soluções de polímeros são preparados fresco antes de cada experiência e utilizada dentro de 24 horas de armazenamento. </li></ol> 2. Preparação para a Impressão de Câncer Spheroids Celulares <ol><li> Crescer as células cancerosas de interesse (por exemplo, células MDA-MB-157 de cancro da mama) com um 90% -100% monocamada confluente. Para MDA-MB-157 células, utilizar um meio composto por DMEM contendo 10% de FBS, 1% de glutamina, e 1% de antibiótico. <ol><li> Células colheita, usando um tampão de dissociação celular (de acordo com o protocolo do fabricante) e carregar a suspensão para um cónico de 15 ml. Centrifuga-se que durante 5 min a 173,3 xg, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio de crescimento completo. </li></ol></li><li> As células de carga em um hemocitômetro e contá-los para calcular o número necessáriode células para uma densidade de células desejada esferóide. Uma monocamada confluente de células MDA-MB-157 células cultivadas em um frasco T75 geralmente dá ~ 7 x 10 6 células. Recomenda-se a densidade celular Requerida para um volume de gota para gerar um único esferóide dependerá do tipo de célula 22 Por exemplo, uma densidade de 1,5 x 10 4 ou maior para MDA-MB-157 células por 0,3 ul de fase gota a DEX: Nota. assegurar a formação de um único esferóide. </li><li> Centrifugar células para uma segunda vez durante 5 min a 173,3 x g e ressuspender-los num volume apropriado de meio de crescimento para concentrar a suspensão até uma densidade de células desejada. Nota: Por exemplo, se 7 x 10 6 células cancerosas foram colhidas, o volume total de suspensão de células necessário para formar um esferóide de densidade de 1,5 x 10 células em 4 ul de 0,3 DEX gota fase será de 140 ul. No entanto, devido à diluição com a solução da fase de DEX no passo seguinte, utilizar apenas 70 ul de meio de cultura celular para ressuspender as células. </li><li&gt; Adicionar a suspensão de células resultante num volume igual de 12,8% (w / v) de solução aquosa de fase DEX preparado em 1.2. Para o exemplo de densidade esferóide 1,5 x 10 4 células, 70 ul da solução da fase de DEX é adicionado a 70 uL de suspensão de células. </li><li> Misture bem a suspensão de células para garantir a distribuição uniforme de células e mistura de solução DEX. A pipetagem para cima e para baixo deve ser feito com cuidado para evitar a formação de bolhas. </li></ol> 3. Preparação para a Impressão de Spheroids Co-cultura <ol><li> Crescer as células cancerosas (por exemplo, MDA-MB-157 células de cancro da mama humano) e células de suporte (por exemplo, fibroblastos humanos) para um de 90% -100% monocamada confluente. Colheita de cada tipo celular utilizando um tampão de dissociação de células (de acordo com o protocolo do fabricante). <ol><li> Carregar cada suspensão numa cónico de 15 ml e centrifugar para clarificação durante 5 min a 173,3 x g, e a partir de cada sobrenadante aspirado cónica. Ressuspender as células de cada cónica em 1 ml de completa gmédio rescimento. Nota: corantes fluorescentes tais como Calceina AM (mancha de células vivas) e corantes nucleares (Hoechst) pode ser utilizada para distinguir os dois tipos de células. </li></ol></li><li> Carregar cada tipo de célula separadamente para um hemocitómetro e contá-las para calcular o número necessário de cada tipo de célula para uma proporção desejada de células cancerosas para células de suporte em esferóides co-cultivadas. As monocamadas confluentes de células MDA-MB-157 e as células fibroblastos cultivadas em frascos T75 geralmente dar 7 x 10 ~ 6 e 10 ~ 6 x 6 células, respectivamente. </li><li> Adicionar o volume correcto a partir da suspensão de células de suporte para as células cancerosas suspensão para dar uma proporção desejada dos dois o número de tipos de células. Por exemplo, usar uma proporção de 50 células cancerosas para 1 célula de fibroblasto. </li><li> Centrifugar a cónico contendo a suspensão celular misturada durante 5 min a 173,3 xg células e ressuspender em um volume apropriado para resultar na densidade final compreendendo de volumes iguais de meio de crescimento e a 12,8% (w / v) aquosa DEXem fase de solução (preparado em 1.2). </li><li> Pipeta suavemente a suspensão de células resultante para cima e para baixo para assegurar a homogeneidade da suspensão. </li></ol> 4. Impressão de esferóides de Tumor em uma placa de 96 poços <ol><li> Um dia antes das experiências, revestimento, de fundo redondo de placas de 96 poços não tratados com 1% (w / v) de Pluronic a 37 ° C durante 24 horas. Este revestimento impede a fixação das células durante o período de cultura. </li><li> Dispensar a 50 ul de filtrado 5% (w / v) de fase aquosa de PEG em cada poço de uma placa de 96 poços (placa de destino). </li><li> Usando uma pipeta, mistura da suspensão de células (preparado no passo 2 passo 3 ou para mono- e co-cultura, respectivamente) e adicionar 20 ul da suspensão a cada poço de uma outra coluna de uma placa de 384 poços (placa de fonte) . </li><li> Ligue o manipulador de líquidos e &quot;casa&quot; a cabeça de pipetagem para registrar as coordenadas. Em seguida, elaborar um protocolo previamente definido (abaixo de 4.6) para garantir material de laboratório e os parâmetros são definidos corretaly. Este &quot;homing&quot; passo pode ser diferente para manipuladores de líquidos diferentes. Nota: O fluxo do protocolo, mostrado passo-a-passo abaixo em 4.6, será semelhante independentemente do manipulador de líquidos robótico usado; no entanto, a interface de programação podem ser diferentes, devido à utilização de software diferente. </li><li> Colocar a placa de fonte, a placa de destino, e caixas de ponta da pipeta em posições definidas na estação de trabalho do manipulador de líquidos, tal como mostrado na Figura 1. </li><li> Executar o protocolo que inclui os seguintes passos: <ol><li> Coloque uma coluna de barris de cabeça pipetagem do manipulador líquido com mistura pontas de pipeta (8 pontas) da estação de trabalho (Figura 1). </li><li> Misture a suspensão de células em cavidades da placa de fonte (Figura 1). Escolher um volume de mistura menor do que o volume de suspensão de células em poços para evitar a formação de bolhas. </li><li> Ejetar dicas em uma caixa de aterros vazio (Figura 1). </li&gt; <li> Carregar uma coluna de barris de a cabeça de pipetagem com 10 ul de distribuição de pontas de pipetas (Figura 1). </li><li> Aspirar 0,3 ul da suspensão de células a partir da placa de fonte (Figura 1) em cada ponta de pipeta. </li><li> Dispensar a suspensão de células em cavidades de uma coluna da placa de destino (Figura 1). Utilize uma altura de distribuição de 0,5 mm e um caudal de distribuição de menores do que 1? L / seg. </li><li> Repita os passos 4.6.1 4.6.6 através de impressão até a coluna-a-coluna para a totalidade da placa de destino é completa. </li></ol></li><li> Remover cuidadosamente a placa de destino a partir da superfície da estação de trabalho e colocá-lo numa incubadora húmida a 37 ° C e 5% de CO 2. Manter a placa horizontal quando o levar para a incubadora para evitar prejudicar o de gotas de fase DEX contendo células. </li><li> Incubar a placa durante 24 h, para permitir a agregação de células num esferóide dentro da gota fase DEX. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Drug Treatment of Cancer Spheroids Celulares Note-se que o protocolo seguinte é para um tratamento medicamentoso de 4 dias e inclui uma renovação com droga fresca após dia 2. Ela pode ser modificado para outros períodos de tratamento. <ol><li> Confirmar visualmente a formação de esferóides, em placas de 96 poços depois de 24 horas. Se necessário, poços de imagem para medição do tamanho de esferóides pela média das menores e maiores diâmetros de cada esferóide. </li><li> Preparar a solução de stock de um medicamento desejado, dissolvendo-o num solvente recomendado pelo fabricante, a uma concentração pré-determinada a solubilidade. Por exemplo, dissolve-se a cisplatina em água a 2 mg / ml. Nota: Proteja a solução estoque da droga da luz, se a droga é sensível à luz. </li><li> Usando a técnica de diluição em série, preparar as concentrações de droga diluídas com meio de cultura de células a partir da solução preparada no passo anterior. Cada diluição deve ser feita duas vezes a concentração desejada. Dilrácios ution irá variar dependendo da concentração do material de partida desejado e concentrações de trabalho. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de droga foi preparada na etapa anterior a cada poço. Isto pode ser realizado roboticamente ou por pipetagem manual. Nota: Cada concentração de droga será diluído para metade, para a concentração desejada por 50 ul da fase aquosa PEG já em cada poço. <ol><li> Use esferóides de duas colunas de uma placa de 96 poços (n = 16) para cada concentração. </li><li> Em cavidades de controlo, adicionar apenas 50 ul de meio de cultura fresco aos 50 ul existentes da fase aquosa PEG. </li></ol></li><li> Incubar esferóides com o fármaco durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2, protegido da luz. </li><li> Após 48 horas de incubação, preparar diluições frescas de droga em concentrações desejadas e renovar droga por adição de 50 uL de solução de droga fresco a cada poço. Nota: Os poços já conter a concentração da droga desejada a partir da primeira droga tratamento. Por conseguinte, nesta fase renovação, cada concentração é preparada na concentração desejada, desde que não irá ocorrer a diluição. </li><li> Incubar esferóides com a droga durante mais 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2, protegido da luz. </li></ol> 6. Análise de Viabilidade Celular em esferóides <ol><li> Após 48 horas de incubação com renovada droga (isto é, o tempo total de tratamento de esferóides com um fármaco é de 4 dias), medir o volume total do meio de um bem por pipetagem manual. Nota: O volume típica em um poço é de ~ 140 mL (uma pequena diminuição ocorre devido à evaporação). </li><li> Calcular o volume de reagente a viabilidade das células (por exemplo, PrestoBlue) como a concentração de 10% do volume total do bem. Adicionar o volume de reagente a viabilidade das células para cada poço. Nota: Com um volume de suporte existente de 140 pi de um poço, num volume de 15,6 uL é necessária para dar uma concentração de 10% do total bem. Este valor é calculadodividindo o volume de mídia existente por 9 (140 l / 9 = 15,6 ul). </li><li> Incubar a placa, com o reagente de viabilidade celular adicionada a cada poço, durante 6 h a 37 ° C, protegida da luz. </li><li> Colocar a placa num leitor de micro-placa e ler o sinal de fluorescência a 560 nm e 590 nm de excitação e de emissão de comprimentos de onda, respectivamente. </li><li> Calcula-se a percentagem de viabilidade de células em esferóides com a normalização do sinal fluorescente de poços tratados para os poços de controlo de que a média dos valores depois de as mesmas condições de tratamento. </li></ol>

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Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li><li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate.">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li><li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Spheroids apresentar um modelo realista para compreender melhor a fisiologia tumor e eficácia da droga e fornecer uma ferramenta útil para anti-câncer de descoberta de drogas. Tais aplicações iria beneficiar muito de técnicas simples de geração e manutenção esferóide que exigem apenas o material de laboratório padrão, ferramentas de manipulação de líquidos e equipamentos de rastreio. O uso de um sistema aquoso de duas fases nas células cancerosas, espontaneamente agregados dentro da fase gota permite a ...

Ensaios baseados em células fornecer uma ferramenta importante para o desenvolvimento e descoberta de novos fármacos anti-cancro. 1,2 Historicamente, culturas em monocamada de células de cancro têm sido utilizados para investigar a eficácia dos compostos candidatos em relação a determinados tipos de células cancerosas. A facilidade de manutenção das culturas em monocamada em placas de cultura padrão, o grau de compatibilidade de placas padrão com ferramentas comerciais robóticos para a adição de reagentes, e com equipamentos de controlo para análise de respostas celulares a jusante para os compostos químicos são os principais benefícios que tornam culturas 2D uma ferramenta atraente para testes de drogas 3. Infelizmente, os ensaios em monocamada de células muitas vezes não conseguem prever a eficácia de compostos in vivo, tornando o desenvolvimento de drogas e descoberta de um processo extremamente caro. 4,5 Apesar de investimento e esforço significativo por empresas farmacêuticas e unidades acadêmicas, apenas cerca de 1% de anti-câncer drogas em ensaios clínicos foram aprovadospelo FDA nos últimos duas décadas. 6 Disparidade entre as culturas em 2D e 3D ambiente complexo de células cancerosas in vivo é uma grande falha dos sistemas de cultura em monocamada. 7 Portanto, a triagem de compostos candidatos contra células tumorais em um cenário que mais se assemelha o ambiente tumor 3D pode acelerar o desenvolvimento de novas drogas de quimioterapia. 8 Esferóides de células de cancro apresentar um modelo de tumor in vitro 3D relevante. 9,10 esferóides compactos são aglomerados que se formam através da montagem espontânea ou induzida de células cancerosas em superfícies não-aderentes ou em suspensão, utilizando técnicas tais como balão giratório, sobreposição de líquido, microbiologia microfabricado . bem arrays, microfluídica, e gotas de suspensão 11-16 Spheroids imitar características-chave de tumores sólidos, incluindo geometria e limitado de transporte de oxigênio, nutrientes e compostos de drogas na zona central; Assim, eles se regenerar mais de perto respon drogase de tumores sólidos, em comparação com as culturas de monocamada 17-19 Apesar deste benefício marcado., esferóides não são rotineiramente utilizados para o rastreio de compostos químicos contra as células cancerosas. Dificuldade de produzir esferóides tamanho uniforme em um cenário de alta taxa de transferência padrão que é compatível com a robótica comercialmente disponíveis e ferramentas de triagem / imagem impede a incorporação da cultura esferóide em pipeline de desenvolvimento de medicamentos. Embora os materiais e placas personalizadas tornaram-se recentemente disponível no mercado para atender a essa necessidade, considerações de custo dissuadir a sua utilização generalizada. Duas importantes técnicas com a capacidade de produzir esferóides porte consistentes em alto rendimento utilizar uma nova plataforma de gota suspensa e micro-poços microfabricados 13,16,20. No entanto, ambas as abordagens requerem placas e dispositivos que são caros para fabricar e inconveniente para os usuários de endpoint especiais em centros de pesquisa do núcleo e indústrias farmacêuticas, onde o mais importante de effortes para a descoberta de novas drogas anti-cancerosas são feitos. Apesar de algumas melhorias na estabilidade de gotas contendo células com um projeto recente de pendurar placas de queda, apenas um ou outro buraco da placa ainda é usado durante a cultura para evitar a propagação / fusão de gotas. 16 Isto diminui significativamente o rendimento experimental. Adição da droga e de renovação é difícil com o manual ou pipetagem robotizada esferóides e precisam de ser transferidos para uma placa padrão para a análise bioquímica porque esta configuração placa não é facilmente compatível com o equipamento de rastreio convencionais, tais como leitores de placas. 21 As micro-poços fabricados utilizando litografia macia também permitir tamanho controlado produção esferóide. 13,20 No entanto, a incompatibilidade desta plataforma com ferramentas de pipetagem padrão impede o tratamento de esferóides individuais com diferentes compostos de drogas / concentrações, expondo todos os esferóides a uma condição de tratamento individual. Assim, este método não é apropriado para elevadorastreio de compostos caudal que requer o teste simultâneo de vários compostos / concentrações. Para superar estes obstáculos, uma nova técnica de alto rendimento de produção de esferóides de células de cancro tamanho consistente em placas de 96 poços padrão foi desenvolvido. 22,23 A abordagem baseia-se num sistema de duas fases aquosa polimérica (SAB) com polietileno-glicol ( PEG) e dextrano (DEX) como polímeros de formação de fases. 24 ATPSs foram recentemente utilizado em uma variedade de aplicações biológicas romance celulares que permitam micropatterning célula e entrega localizada de reagentes biológicos para as células em meios aquosos altamente 25-32. Para formar uma esferóide, as células cancerosas são misturados com a fase aquosa DEX e uma gota de sub-microlitros da suspensão resultante é pipetada para dentro de uma solução aquosa de fase de PEG contendo a imersão bem. A queda continua a fase imiscível de imersão e confina células para facilitar a formação de um esferóide. Diabinhoortantly, a fase de imersão altamente aquoso fornece os nutrientes para as células do esferóide e minimiza o problema bem conhecido de evaporação meios comum para alguns outros ensaios que causa mudanças na osmolalidade meios e flutuações de concentrações de droga. Esta técnica permite a produção esferóide e tratamento de drogas só utilizando reagentes comercialmente disponíveis e as ferramentas de pipetagem em placas de 96 poços convencionais. É importante notar que a análise de respostas celulares de esferóides é realizada na mesma placa por meio de ensaios bioquímicos convencionais e leitores de placas. A facilidade de trabalhar com ATPS e adaptabilidade da abordagem para manipulação de líquidos robótico faz geração de alto rendimento de ambos mono-cultura e co-cultura esferóides uma técnica de laboratório simples. Esta nova abordagem será um grande passo à frente em direção à integração de esferóides de células cancerosas em processos de desenvolvimento de drogas e de descoberta com melhor rendimento testes e custo-efetividade (aumento do número de compostos testados e reduconsumo ced reagente) e eficiência (reduzindo mãos no tempo). Um protocolo detalhado para produção robótico de esferóides de células de cancro em placas de 96 poços utilizando a abordagem APTS é descrito abaixo. Além disso, os detalhes do tratamento medicamentoso de esferóides resultantes e análise de respostas celulares a jusante utilizando um ensaio bioquímico comercial são apresentados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mw: 35,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Mw: 500,000</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>5510 0500 9007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clacein AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>15663-27-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-13261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-108</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>542342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (10 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P10V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (70 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P70V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Handler</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SRT Bravo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments</td>
			<td>Synergy H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A estação de trabalho do manipulador de líquidos robótico é mostrado na Figura 1. A cabeça de pipetagem e todas as estações utilizadas na impressão robótico de esferóides na secção 4.6 são rotulados. A imagem mostra a utilização de duas estações diferentes para caixas de ponta (um conjunto de dicas para a mistura e o segundo conjunto para aspiração / dispensação de mistura fase DEX suspensão aquosa de células). Toda a configuração está alojado dentro de um armário de norma de...

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Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K visualizações.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Padronização de células co-cultura Usando duas fases aquosas Sistemas

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Bioengenharia

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is conducted by eliciting an illusion through use of a mirror as if the hemiplegic arm is moving in real-time while moving the healthy arm. It can facilitate brain neuroplasticity through activation of the sensorimotor cortex. However, conventional mirror therapy has a critical limitation in that the hemiplegic arm is not actually moving. Thus, we developed a real-time 2-axis mirror robot system as a simple add-on module for conventional mirror therapy using a closed feedback mechanism, which enables real-time movement of the hemiplegic arm. We used 3 Attitude and Heading Reference System sensors, 2 brushless DC motors for elbow and wrist joints, and exoskeletal frames. In a feasibility study on 6 healthy subjects, robotic mirror therapy was safe and feasible. We further selected tasks useful for activities of daily living training through feedback from rehabilitation doctors. A chronic stroke patient showed improvement in the Fugl-Meyer assessment scale and elbow flexor spasticity after a 2-week application of the mirror robot system. Robotic mirror therapy may enhance proprioceptive input to the sensory cortex, which is considered to be important in neuroplasticity and functional recovery of hemiplegic arms. The mirror robot system presented herein can be easily developed and utilized effectively to advance occupational therapy.

We developed a real-time mirror robot system for functional recovery of hemiplegic arms using automatic control technology, conducted a clinical study on healthy subjects, and determined tasks through feedback from rehabilitation doctors. This simple mirror robot can be applied effectively to occupational therapy in stroke patients with a hemiplegic arm.

Robotic Espelho Sistema de Terapia de recuperação funcional de hemiplégicos Braços

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabricação e validação de um sistema de órgãos-em-microplaqueta com eléctrodos integrados para quantificar diretamente a resistência elétrica de Transendothelial

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimir a transcrição do Gene redirecionando maquinaria celular com modificadores epigenéticas químicas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Uso do elevado-Throughput Microbioreactor sistema automatizado para produção de IgG1 modelo em células CHO

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

Purificação e análise de um anticorpo monoclonal de células de ovário de hamster chinês usando um sistema de Microbioreator automatizado

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

Esclarecimento Primário do Fluido de Cultura Celular Colhida cho usando um separador acústico

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Produção automatizada em larga escala de esferoides de células-tronco derivados de adiposo para bioimpressão 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Geração escalável de esferoides de células uniformes usando um dispositivo de montagem acústica 3D

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

Autor em destaque: Desenvolvimento de um método de montagem acústica sem andaimes para cultura de esferóides de células 3D de alta qualidade 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

Dispositivo de Montagem Acústica Tridimensional para Fabricação em Massa de Células Esferoides

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...