Este protocolo ajuda a analisar quantitativamente a estrutura 3D das junções neuromusculares em uma resolução próxima à microscopia eletrônica usando um procedimento simples. A principal vantagem deste protocolo é que as amostras musculares são processadas de forma semelhante e imunomarcadas para microscopia confocal e STED, reduzindo o tempo para avaliação precisa da estrutura da junção neuromuscular em modelos animais. A quantificação morfológica que desenvolvemos pode ser facilmente adaptada para analisar outras estruturas subcelulares.
Tenho o prazer de apresentar a Dra. Martina Marinello, uma cientista da minha equipe que mostrará como são realizadas provocações musculares e imunocolorações e dará algumas recomendações para a aplicação bem-sucedida deste protocolo. Tenho o prazer de apresentar o Dr. Jeremie Cosette, da plataforma de imagem da Genethon, que mostrará a aquisição e análise de imagens usando microscópios confocais e STED. Após a eutanásia, comece a provocar os músculos tibiais anteriores em pequenos feixes de fibras de cerca de um milímetro de largura usando duas pinças serrilhadas finas.
Em seguida, transfira esses feixes musculares para uma placa de 24 poços contendo 1% de Triton X-100 preparado em PBS e permita que ele agite suavemente por uma hora à temperatura ambiente ou cinco horas a quatro graus Celsius. Após lavar as amostras três vezes por cinco minutos com PBS à temperatura ambiente, incubar as amostras com uma solução de bloqueio composta de BSA a 4% preparada em PBS com 1%Triton X-100 por quatro horas a quatro graus Celsius sob agitação suave. Em seguida, incubar as amostras durante a noite com a mesma solução de bloqueio contendo anticorpos monoclonais primários contra o neurofilamento M ou a glicoproteína 2 da vesícula sináptica para rotular terminais axônicos pré-sinápticos ou zonas ativas, respectivamente.
No dia seguinte, lave os feixes musculares rotulados três vezes por cinco minutos com PBS sob agitação suave. Em seguida, incube-os com anticorpos secundários apropriados, colocando-os em um agitador por duas horas à temperatura ambiente. Depois de lavar os feixes musculares novamente, coloque-os em um slide com meio de montagem.
Em seguida, coloque uma tampa de vidro de 1,5 grau na parte superior, seguida por ímãs cilíndricos em ambos os lados da lâmina para aplicar pressão e achatar os músculos. Para adquirir imagens usando o microscópio confocal, inicie o software do microscópio e escolha a máquina como modo de configuração e colete pilhas de imagens das junções neuromusculares em cada grupo experimental, de acordo com as configurações mencionadas no manuscrito do texto. No final da sessão, clique em Abrir no visualizador 3D e escolha uma junção neuromuscular representativa de um grupo experimental para visualizar a rotulagem 3D.
Para calcular a junção neuromuscular pós-sináptica e o volume da placa, a área de projeção de intensidade máxima e a tortuosidade relativa, arraste e solte a macro para quantificação do volume da junção neuromuscular na janela da Imagem J e, quando a macro abrir em uma segunda janela, clique em Macros e Executar macro. Selecione a pasta nativa que contém as subpastas de junção a serem analisadas e clique em Selecionar. Em seguida, no menu pop-up da pasta de salvamento, selecione a pasta de armazenamento e clique em Selecionar.
No novo menu pop-up chamado Tipo de imagem, selecione o formato das aquisições da pilha Z. Selecione o canal RGB correspondente à coloração de interesse e indique X, tamanho de pixel Y e etapa Z. Se os formatos de arquivo proprietários forem selecionados, a macro lerá diretamente o tamanho do pixel e a etapa Z.
Para quantificar o acúmulo de neurofilamentos pré-sinápticos, arraste e solte a macro para quantificação da acumulação de junção neuromuscular na janela Imagem J e clique em Macros e Executar macro. Selecione as subpastas de junção, a pasta de armazenamento e o formato das aquisições de pilha Z, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, no pop-up Informações de Mancha, indique o rótulo e a cor pré-sinápticos e pós-sinápticos e clique em OK.In pop-up Tamanho do Pixel, indique o tamanho do pixel X, Y como 0,072 micrômetros, o passo Z como 0,5 micrômetros e clique em OK. Se os formatos de arquivo proprietários forem selecionados, a macro lerá diretamente o tamanho do pixel e a etapa Z.
Para calcular a distância entre as listras do receptor de acetilcolina, selecione o menu Quantificar na parte superior da janela central. Clique na guia Ferramentas, selecione intensidade e clique no ícone de perfil de linha. Defina Oversampling como um e marque Classificar canais.
Clique na guia Abrir Projetos e selecione a imagem filtrada a ser analisada. Em seguida, clique no ícone de linha de desenho e trace uma linha cruzando perpendicularmente várias listras ou dobras juncionais. Clique na parte superior do primeiro pico e mova o ponteiro do mouse enquanto pressiona o botão esquerdo do mouse até que o próximo pico máximo seja atingido.
Observe o valor DX, que corresponde à distância entre os dois picos. Clique com o botão direito do mouse enquanto estiver na imagem da janela direita e selecione Salvar ROIs. Depois de clicar no ícone de seta, clique no ROI e exclua-o clicando no ícone da lixeira.
Para calcular a largura da faixa do receptor de acetilcolina, selecione a intensidade no painel superior esquerdo sob a guia ferramentas, clique no ícone determinar FWHM e marque os canais de classificação. Em seguida, clique na guia Abrir Projetos e selecione a imagem filtrada a ser analisada. Em seguida, clique no ícone de retângulo de desenho no menu superior da janela direita.
Selecione uma faixa horizontal ou vertical e desenhe um retângulo perpendicularmente à listra. Um perfil aparece na janela central. Clique na vertical ou horizontal do menu Projeção média localizado no painel esquerdo, dependendo se a orientação da faixa é vertical ou horizontal.
Clique nas Estatísticas na janela central para ler o valor FWHM e, em seguida, salve e exclua os ROIs, conforme demonstrado anteriormente. A placa final motora pós-sináptica, marcada com alfa-bungarotoxina fluorescente, mostrou-se menor e fragmentada nos mutantes de duas linhagens de camundongos. A quantificação das pilhas Z da junção neuromuscular usando as macros personalizadas da Imagem J revelou uma diminuição acentuada no volume da placa final, projeção de intensidade máxima e tortuosidade relativa em ambos os modelos de camundongos com doença em comparação com os controles, indicando defeitos de maturação da junção neuromuscular.
A quantificação da distribuição do ramo terminal axônico pré-sináptico utilizando a macro personalizada da Imagem J revelou um padrão alterado na distribuição do neurofilamento M nos dois modelos animais com aumento da imunomarcação. Através da coloração da glicoproteína 2 da vesícula sináptica, foi observada uma redução de 43% na razão de ocupação das regiões contendo receptores de acetilcolina com zonas ativas terminais nervosas adjacentes em camundongos Smn 2B/camundongos. O aspecto das placas finais pós-sinápticas da junção neuromuscular foi claramente visualizado pela marcação fluorescente de alfa-Bungarotoxina e análise do perfil de intensidade.
A avaliação dos parâmetros da junção neuromuscular revelou um aumento na distância da prega juncional e na largura das listras receptoras de acetilcolina no músculo gastrocnêmio dos mutantes. Para obter resultados confiáveis, é crucial provocar os músculos adequadamente, prestando uma atenção especial à força aplicada para separar os feixes musculares. Esse protocolo pode ajudar a obter uma caracterização morfológica mais aprofundada da junção neuromuscular, que antes era contabilizada apenas por procedimentos complexos e demorados, como a microscopia eletrônica de transmissão.
O procedimento de imagem STED abriu caminho para a investigação de novos insights sobre marcadores pré e pós-sinápticos, que contribuem para a fisiopatologia de doenças que afetam a junção neuromuscular.
