A coloração imuno-histoquímica do cérebro de camundongos é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. No entanto, a qualidade, confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados da histologia cerebral podem variar entre diferentes pesquisadores e laboratórios. Apresentamos uma metodologia estabelecida para estudos histológicos de cérebros de camundongos que tem se mostrado reprodutível, confiável e eficiente.
Ajudando a demonstrar o procedimento estará o Dr.Chunmei Wang, professor assistente do meu laboratório Depois de confirmar a anestesia bem sucedida em um rato C57 preto/6J de oito a 16 semanas, fixar o rato em uma placa de espuma e fazer uma incisão superficial longitudinal ao longo da linha média sobre o tórax e abdômen, em seguida, mover a pele de lado para expor a parede muscular do tórax e abdômen. Em seguida, faça uma incisão na camada muscular para expor o fígado e o intestino. Em seguida, usando uma tesoura, corte a caixa torácica para abrir o tórax e expor o coração e os pulmões.
Usando fórceps hemostáticos, puxe a caixa torácica de lado para ampliar a área de trabalho. Próximo. para colocar uma cânula de perfusão, penetrar diretamente no ventrículo cardíaco esquerdo com uma cânula sem corte e inseri-la cuidadosamente na aorta ascendente. Coloque pinos ao redor da conjunção da cânula e tubos acoplados na placa de espuma para fixar a cânula no lugar durante a perfusão, e proceda a cortar o átrio direito para permitir a saída de sangue de circulação.
Para perfusão com soro fisiológico, ligue o interruptor de pressão salina e perfunda o rato transcardialmente com 40 a 60 mililitros de soro fisiológico. Observe a saída do átrio direito e a cor do fígado de perto. Em seguida, para perfuse com formalina, desligue o interruptor de pressão salina e ligue o interruptor de pressão formalina para perfundir o mouse com 40 mililitros de formalina tamponada 10%.
Observe os membros do animal para obter evidências de tremores. Para o isolamento cerebral, use uma tesoura para remover a cabeça e faça uma incisão da linha média ao longo do argumento para expor o crânio, em seguida, corte a pele e o apego muscular. Em seguida, faça um corte no cume orbital e coloque a ponta afiada da tesoura de íris na magnum foramen.
Avance a tesoura ao longo da superfície interna do crânio, mantendo a pressão para cima para evitar danos ao cérebro. Em seguida, remova cuidadosamente os ossos parietal e frontal e meninges antes de remover o cérebro do crânio aberto. Coloque gelo seco em cima da placa de ajuste de altura de um microtome deslizante e espere até que a geada branca seja visível, em seguida, espalhe cuidadosamente cinco mililitros de 30% de sacarose em cima da placa para formar uma camada de base sólida depois que a sacarose tiver congelado.
Em seguida, coloque todas as amostras cerebrais horizontalmente em uma linha em cima da base de sacarose com 500 microlitres de 30% de sacarose. Após cinco a 10 minutos de congelamento, quando o cérebro ficar duro e branco, corte o cérebro até que a camada ou região desejada seja atingida, então, mude do modo de corte para o modo de alimentação e se sectione tecido cerebral para gerar seções de 25 micrômetros de espessura. Em seguida, prepare uma placa de 48 poços cheia de PBS e marque cinco poços para um cérebro de rato.
Usando um pincel, colete uma seção e coloque-a em um poço, em seguida, colete a seção subsequente do mesmo mouse e coloque-a no segundo poço. Repita o procedimento até que o quinto poço seja alcançado colocando seções de seis a 10 no primeiro ao quinto bem, e assim por diante. Coloque um coador de células em um poço de uma placa de cultura celular de seis poços cheia de PBS e, usando um pincel, transfira uma série de seções cerebrais para o coador celular.
Enxágüe estas seções em PBS transferindo o coador de célula para outro bem preenchido com PBS no shaker. Em seguida, transfira as seções cerebrais do coador celular para um tubo de 1,5 mililitro contendo um mililitro de WFA rotulado de biotina e incubar em uma plataforma de balanço a 50 RPM durante a noite. No dia seguinte, enxágue as seções cerebrais com PBS como demonstrado anteriormente, em seguida, transfira as seções para um tubo contendo um mililitro de solução streptavidin-daylight 488 e incubar por duas horas em uma plataforma de balanço.
Depois de enxaguar as seções cerebrais com PBS novamente, incuba-as no buffer de bloqueio por duas horas, seguida de incubação em anticorpos primários durante a noite em uma plataforma de balanço. No dia seguinte, após as lavades da PBS, incubar as seções em anticorpos secundários por duas horas. Encha duas placas de Petri com 100 mililitros de PBS e transfira todas as seções cerebrais de um coador para o primeiro prato.
Alinhe as seções cerebrais na ordem neuroanatomética de caudal a rostral. Em seguida, submergir um slide no segundo prato com uma extremidade ligeiramente inclinada com um suporte, e usando um pincel fino, coloque suavemente uma seção cerebral logo abaixo da interface tampão de ar sobre o slide inclinado. Em seguida, usando uma pipeta de transferência, remova lentamente e suavemente o buffer para baixar seu nível até que a seção do cérebro esteja inteiramente acima da interface do buffer de ar.
Continue a repetir este processo até que a parte inferior do slide seja atingida e todas as seções sejam montadas no slide. Para a imagem, ligue o scanner e o computador e posicione os slides no suporte de slides com o dispositivo de carregamento e insira o suporte no scanner. Abra o software para o scanner e escolha o local de armazenamento apropriado e o perfil de digitalização.
Inicie a verificação de visualização clicando no botão Iniciar a verificação de visualização. Após a varredura, abra o assistente de detecção de tecidos e circule as regiões de interesse para a imagem. Depois de escolher as regiões para imagens, clique no botão Iniciar varredura e aguarde que a máquina termine a digitalização.
Verifique o arquivo de resultado e exporte as imagens. Aqui são mostradas imagens representativas da fluorescência imuno-histoquímica de seções cerebrais de camundongos coronais em Bregma-negativo 0,82 milímetros, exibindo a distribuição de wisteria floribunda agglutinin, vasopressina arginina e DAPI. Os sinais de wisteria floribunda agglutinina são observados na área perifornical do hipotálamo anterior e núcleo reticular, enquanto os sinais de vasopressina arginina são observados no núcleo paraventricular.
Ao tentar este protocolo pela primeira vez, sugerimos realizá-lo sob a supervisão de um pesquisador experiente. O protocolo ajudará a gerar resultados histológicos ótimos e consistentes entre diferentes pesquisadores e laboratórios, e servirá de referência para iniciantes que aprendem essa técnica.
