VN é apoiado pela Royal Society. JPR é um futuro companheiro Australian Research Council (FT0992129). Agradecemos ao Dr. Miriam Gifford pela leitura crítica do manuscrito.

Nota: todas as medidas são feitas em temperatura ambiente, salvo indicação contrária. 1. Preparação de plantas Materiais e amortecedores <ol><li> Para N. benthamiana <ol><li> Crescer a Agrobacterium tumefaciens estirpes de interesse para expressão transiente (neste exemplo Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG e o vector vazio como um controlo) por agitação (200 rpm) em cultura líquida (meio L, com os antibióticos apropriados) em 28 ° C até à fase estacionária. </li><li> Recolha e sedimentar Agrobacteria por centrifugação (3000 xg durante 5 min). Descartar o sobrenadante e ressuspender em tampão de Agrobactérias peletizadas infiltração. </li><li> Medir a quantidade de Agrobacteria por obtenção da densidade óptica (OD) de valor a uma absorvância de 600 nm (Abs 600 nm). Ajuste o OD de bactérias para 0,1-0,8. </li><li> Infiltrar N. 4 semanas de idade plantas benthamiana (22 ° C, 16 horas de luz) com Agrobacteria por hand (com uma seringa sem agulha 1 ml) ou por meio de vácuo (adicionar 0,02% v / v de surfactante). Nota: Use a primeira folha quase totalmente expandido, e as duas folhas imediatamente mais antigos para a expressão da proteína mais eficaz. Para detecção de proteínas ubiquitinados ou acetilados infiltrar folhas com 100 nM de MG-132 ou 100 ng / ml tricostatina A, respectivamente, em 1 e 2 dias após a infiltração. </li><li> Colher as folhas infiltradas 2-5 dias pós-infiltração e congelamento em nitrogênio líquido. Armazenar as amostras em um congelador a -80 ° C. Nota: determinar o melhor nível de expressão da proteína de interesse de antemão por recolha de amostras ao longo de um curso de tempo de 5 dias, e detectar os níveis de proteína por imunotransferência. </li></ol></li><li> Para A. thaliana linhagens transgênicas estáveis <ol><li> Crescer A. thaliana sementes em placas de 6 poços, suplementado com 5 ml de meio MS líquido (1% w / v de sacarose) por poço. Coloque 3-5 sementes (esterilizados e estratificados) da linhagem transgênicade interesse ou a linha de controle não transformada por poço. Agitar a 200 rpm, durante dois dias antes de os transferir a placa para uma sala de crescimento e deixar durante 2 semanas (22 ° C, 10 horas de luz). </li><li> Colheita de amostras e congelamento em nitrogênio líquido. Nota: Você pode usar como um controle de uma linhagem transgênica expressando uma proteína relacionada com a mesma marca como a proteína de interesse. </li></ol></li><li> Amortecedores <ol><li> Preparar tampão A. De-gás do tampão durante 1-2 h (por RLKs, outras proteínas ligadas à membrana e proteínas nucleares, adicionar 1% v / v de IGEPAL CA-630 53). Nota: Você pode manter tampão A, a 4 ° C por tempo indeterminado. É possível utilizar 1% v / v de Triton em vez de IGEPAL CA-360. </li><li> Prepare 80 ml de frio tampão B, pelo menos 1-2 horas antes da extração. Nota: A proporção ideal de tecido contra tampão de extracção é 1:4 (w / v). </li></ol></li></ol> 2. Extração de Proteína <ol><li> Pouco antes da extração de preparar 80 ml de frio Tampão C. <li> Moer 20 g de N. tecido benthamiana (cerca de 15 folhas) ou A. thaliana mudas (2-4 g por 6 bem-placa) em nitrogênio líquido, utilizando um almofariz e pilão. </li><li> Adicionar 80 ml de frio Tampão C a 20 g de tecido solo, misture bem, e descongelar no gelo. Nota: Moer todas as amostras, ao mesmo tempo (proteína de interesse e de controlo). </li><li> Misturar com três explosões de 10 segundos cada à velocidade máxima, com um homogeneizador de tecidos (pré-arrefecido a 4 ° C). Filtrar através de um tecido de 22-25 ^ m e centrifugar a 30000 xg durante 30 min a 4 ° C. Nota: Como alternativa, homogeneizar com um almofariz e pilão prechilled fresco. </li><li> Para os passos de bloqueio e lavagem da matriz de afinidade, preparar 20 ml de Tampão D. </li><li> Bloco 100 ml de matriz de afinidade adequada, utilizando 500 ml de tampão D frio contendo BSA a 1% durante 5 min a 4 ° C. Nota: af preferidomatrizes Finity incluem anti-FLAG M2 de agarose, agarose estreptavidina, GFP-Trap_A e anti-HA de agarose. </li><li> Lavar 3x com 1 ml frio Tampão D. </li><li> Remover o sobrenadante do extracto de folha de filtro e através de um filtro de seringa de 0,45 um para um novo tubo em gelo. Nota: A cor do extrato deve ser verde ou amarelo, se a amostra se tornou marrom, descartar e começar de novo. </li><li> Tome uma alíquota do extrato bruto por immunoblot, adicionar tampão SDS-PAGE carregamento 5x, vórtice e desnaturar por amostras fervente por 10 min a 80-100 ° C em um bloco de calor. </li></ol> 3. Imunoprecipitação Protein <ol><li> Dividir o extracto de proteína em dois tubos de 50 ml e adicionar 50 ml da matriz de afinidade em suspensão em tampão D para cada tubo. Incubar, com rotação suave, durante 2 horas a 4 ° C. Nota: As incubações mais longas não foram encontradas para aumentar o rendimento. </li><li> Preparar 600 ul (6x volume de cordão de matriz de afinidade) de tampão de eluição por adição deTampão D (concentrações finais): 0,5% de BSA, péptido de 0,25 mg / ml de FLAG (para anti-FLAG M2 de agarose) ou 10 mM de D-biotina (para Estreptavidina de agarose). Nota: eluição não é recomendado no caso de GFP-Trap_A e anti-HA matrizes, assim proceder diretamente à ebulição em tampão SDS-PAGE carregamento 1x, passo 3.11. </li><li> Precipitar a matriz de afinidade através de centrifugação a 4 ° C (5 min a 1000 xg). </li><li> Tomar uma aliquota do extracto não ligada por imunoblot, descartar o resto do sobrenadante, deixando aproximadamente 500 ul no fundo do tubo. </li><li> Ressuspender a solução lama com uma ponta de todo o furo. </li><li> Transferir a solução suspensão mista de ambos os tubos a um único tubo de 1,5 ml. Nota: A partir de agora, use 1,5 ml de baixa proteína tubos de microcentrífuga vinculativo. </li><li> 3x pulso durante 5 segundos usando uma centrífuga de bancada para precipitar a matriz de afinidade e remover o sobrenadante. </li><li> Lave 3-5x com 1 ml de tampão frio D. Entre as lavagens precipitar a matri afinidadex como anteriormente descrito e desprezar o sobrenadante. Na última lavagem remover o excesso de tampão D, com a agulha de uma seringa. Nota: Uma lavagem final utilizando tampão D com 0,1% de IGEPAL pode ser usado para reduzir ainda mais a ligação não específica. </li><li> Eluição com 200 mL do tampão de eluição adequado (para anti-FLAG M2 ou Streptavidin agarose veja o passo 3.2) 3x, 5 min cada vez com agitação constante. </li><li> Reúnem-se os três produtos de eluição em um único tubo. Concentra-se as proteínas por meio de 30 mL de resina de absorção. Vortex, deixar repousar durante 5 min e precipitar a resina (2 min a 10.000 x g). Desprezar o sobrenadante. Nota: Para GFP-Trap_A e anti-HA agarose, ignore as etapas 3.9 e 3.10. </li><li> Adicionar 50 ul de tampão de SDS-PAGE de carga 1x à matriz de afinidade ou uma resina de absorção precipitado. Vortex e deixe ferver por 10 minutos a 80-100 ° C em um bloco de calor. </li><li> Centrifugar a matriz de afinidade ou uma resina fervida durante 2 min a 10.000 x g. Aliquota 5 ul da supernatant por imunotransferência, e executado com outras fracções para um ~ 10 cm de comprimento de gel de SDS-PAGE (Figura 2). </li><li> Para a separação e identificação de proteínas fosforiladas por espectrometria de massa, carregar os restantes 45 mL para uma ~ 19 cm de comprimento de gel de SDS-PAGE se separação adicional é requerido (Figura 2). Nota: Uma pista em branco pode ser incluído entre todas as amostras para reduzir a contaminação de amostras. </li></ol> 4. Digestão de proteínas <ol><li> Corar o gel de SDS-PAGE com Azul Brilhante de Coomassie coloidal (CCBB) mancha. Nota: minimizar a manipulação do gel para reduzir a contaminação por queratinas. Certifique-se de que nenhum equipamento ou ferramentas foram usadas para immunoblotting ou outras atividades que poderiam ter deixado contaminação proteína residual. </li><li> Destain o gel com lavagem copiosa de água, de preferência S / N. Corte a banda de interesse do gel com uma lâmina de barbear limpa. Nota: Alinhar o gel com o imunoblot se necessary para localizar a área correta. Como fosforilação pode retardar a migração da proteína em SDS-PAGE a cortar a área imediatamente acima e abaixo da banda de interesse. </li><li> Cortar a tira de gel em cubos de 2-4 mm (isto garante que o gel vai ser coberta por soluções no tubo, sem bloquear as pontas de pipeta). Coloque em um tubo. </li><li> Estimar o volume necessário para manter o gel bem submersa. Use esse valor para derivação, a incubação com protease e extração de peptídeo, e então usar o dobro de volumes triplos para lavagem. Nota: Em um típico digerir com aproximadamente 100 mL de os pedaços de gel corte, utilize 500 mL solução para lavar, 2 x 180 mL de desidratação, 150 mL de redução, de 120 mL de alquilação, e 120 mL para a digestão. </li><li> Lave os pedaços de gel de 2 x 20 min (ou até descorados) pela adição de 50% de acetonitrilo (em bicarbonato de amónio 50 mM, ABC). Pipeta off a solução tomando cuidado para não retirar pedaços de gel. </li><li> Desidratar com 100% de acetonitrilo durante 5 min e remover o líquido livre. Nota: O gel deve aparecer encolhido e branco. Se a cor azul persistir, incubar mais em acetonitrilo / ABC e / ou a temperatura elevada (45-55 ° C). </li><li> Reduzir pontes dissulfeto de proteína pela adição de 10 mM DTT em água e incubar por 30-45 min a 56 º C com agitação. Remover líquido livre. </li><li> Resíduos de cisteína alquilados de por adição de 55 mM de cloroacetamida (ABC em 50 mM) durante 20-30 minutos (a temperatura ambiente, luz). Remover líquido livre. </li><li> Lavar as peças de gel de 2 x 10 min, com 50% de acetonitrilo (em ABC 50 mM). Remover líquido livre. </li><li> Desidratar pedaços de gel com 100% de acetonitrila por 5 minutos e retire líquido livre. </li><li> Para a digestão tríptica, adicionar 40 ul de solução de trabalho de tripsina (100 ng de tripsina em tampão de digestão: ABC 50 mM, 5% de acetonitrilo para uma banda corada com Coomassie média). Permitir pedaços de gel para hidratar por 10 min. Adicionar suficiente de tampão de digestão para cobrir pedaços de gel se necessário. Incubar a 37 º CS / N. </li><li> Para parar a digestão e extrair os péptidos a partir dos pedaços de gel, adicionam-se 5% de ácido fórmico (a 50% de acetonitrilo) (adicionar o mesmo volume que o volume de digestão). Sonicar por 5-10 min. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Repetir a extracção de 3x. </li><li> Secam-se os péptidos por liofilização (preferido) ou um concentrador de vácuo (como Speed-Vac ou Savant). Armazenar a -20 º C. </li><li> Envie o seu exemplo para espectrometria de massa. Nota: Submetemos nossa amostra à facilidade de espectrometria de massa em O Laboratório Sainsbury (Norwich, Reino Unido). Protocolos para instalações de espectrometria de massa variar consideravelmente, mas tipicamente péptidos serão dissolvidos em 0,2% de ácido trifluoroacético com acetonitrilo a 2% antes do carregamento para um sistema de cromatografia líquida acoplada ao electro-spray de espectrometria de massa em tandem. </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes (financeiros ou outros).

Elucidar o mecanismo de ativação do receptor por PAMPs e processadores de efeitos pode contribuir muito para a nossa compreensão da imunidade da planta. Nos últimos 20 anos, as telas de dois híbridos genéticos e leveduras têm sido fundamentais para a descoberta de PRRs e proteínas NB-LRR. Mais recentemente, foram estabelecidos protocolos baseados em espectrometria de massa para a identificação de proteínas diferencialmente regulados durante imunológico sinalização 55-58, suas PTMs 11,33,59,60, a composição dos complexos imunes efetoras 61 e tem como alvo 62. Aqui, descrevemos um protocolo simples para a identificação de PTMs que regulam a activação dos complexos imunes. Em comparação com os protocolos descritos anteriormente, este protocolo permite a identificação detalhada das mudanças dinâmicas de PTMs. Protocolos de abordagens proteômicas em larga escala pode identificar PTMs de proteínas, mas não são capazes de revelar a plasticidade local de PTMs devido ao limiteed quantidades de proteína. No caso de fosforilação da proteína em larga escala proteómica abordagens tipicamente apenas identificar os locais de fosforilação predominantes 11,33,59. A caracterização detalhada de um estado de fosforilação de proteínas requer uma quantidade substancial de proteína que pode ser obtida por meio de purificação parcial da proteína alvo 47. O protocolo aqui descrito casais uma abordagem de purificação de proteína que gera uma quantidade substancial da proteína alvo, com a análise de espectrometria de massa de proteína purificada. Seguindo esse protocolo, o evento fosforilação único de Pto foi atribuído principalmente a Ser-198, como descrito anteriormente 52 mas alguns espectros de espectrometria de massa também apoiou um único evento de fosforilação em Tre-195 ou Tre-199. Quando foram observados eventos de fosforilação duplas de Pto, a combinação predominante de aminoácidos fosforilados foi Ser-198 e Thr-199 embora também se observou combinações de outros sites (Tabela 1). Estes resultados demonstram claramente a plasticidade local de fosforilação de proteína-quinases e a capacidade de o protocolo descrito em detalhes para caracterizar todos os possíveis locais de fosforilação. Os passos mais críticos deste protocolo são: 1) a extração suficiente de proteínas, 2) protecção de PTMs, e 3) uma quantidade suficiente de proteína alvo. Em primeiro lugar, para a extracção suficiente de proteínas, é importante para moer o tecido em azoto líquido e subsequentemente para usar um homogeneizador de tecido, tal como descrito no protocolo. Se um homogeneizador de tecido não está disponível, um almofariz e pilão pode ser usado. É também importante a utilização de uma proporção de 02:59 (ou quatro) de gramas de tecido de volume de tampão de extracção. Este tecido para tampão rácio e o tampão de elevada força que sugerimos que irá assegurar que o pH vai ficar neutro, durante o processo de extracção. Descobrimos que isso é de particular importância para A. thaliana e tomate adicionalCÇÕES 52. Protecção de PTMs pode ser conseguido através da inclusão de todos os tampões adequados os inibidores de enzimas que podem remover PTMs. Também é crítico para executar todas as etapas, a 4 ° C e a prechill tampões e instrumentos. Rendimentos mais altos de proteína alvo pode ser conseguida através da utilização de plantas que expressam a proteína em quantidades suficientes e de utilizar grandes quantidades de tecido (aproximadamente 20 g). O passo mais importante para a obtenção de uma quantidade suficiente de proteína alvo é concentrar a proteína alvo por imunoprecipitação direta. A importância deste passo é destacado por nossa incapacidade de identificar PTMs de Pto após uma imunoprecipitação Prf devido à quantidade limitada de coimmunoprecipitated Pto (Figura 2B). Em contraste, a imunoprecipitação directa de Pto produziram péptidos substancialmente mais mensuráveis ​​(Figura 2C), que conduzem a uma cobertura de aproximadamente 80% da sequência da proteína e a identificação de PTMs (Tabela 1). Também ruarongly recomendam o uso de epítopos-tags para imunoprecipitação de proteínas. Em comparação com os anticorpos produzidos contra as proteínas da matriz de epitopo-tags de afinidade nativa podem produzir quantidades mais elevadas de proteína parcialmente purificada. Ao utilizar um anticorpo criado contra a proteína nativa Pto 51 (Figura 2A) para imunoprecipitação, fomos capazes de identificar apenas fosforilação único dos dois locais de fosforilação predominantes de Pto. Este protocolo foi principalmente desenvolvido para a purificação parcial de N. benthamiana proteína citoplasmática e subsequente identificação dos seus sítios de fosforilação. No entanto, usando as modificações aqui descritas, este protocolo pode ser facilmente adaptado para a A. thaliana proteínas e proteínas de membrana ligada. O principal objectivo do presente protocolo é a produzir quantidades suficientes da proteína alvo para a identificação de PTMs e não para atingir a maior pureza do complexo. Se maior purezado complexo é necessário um segundo passo de purificação pode ser adicionado a este protocolo 52. Neste caso, um primeiro passo irá permitir a eluição da proteína alvo a partir da matriz de afinidade, sem o uso de sais de ácido e elevadas ou o passo subsequente pode implicar uma matriz, o que requer condições de eluição duras. É importante destacar que só testei este protocolo para a identificação de sítios de fosforilação e que estamos atualmente testando a sua capacidade para a identificação detalhada de PTMs adicionais. Os nossos resultados demonstram claramente representativos da plasticidade local de fosforilação de proteína-quinases e a capacidade de o protocolo descrito para caracterizar locais de fosforilação. Mais importante, eles destacam que a identificação de sítios de fosforilação que confiam em baixa quantidade de proteínas por espectrometria de massa e por mutações de um único ponto de sites auto-fosforilação pode dar resultados confusos. Mostramos aqui e anteriormente 47 </sup&gt; Que a dupla fosforilação de Pto em Ser-198 e Thr-199 está associada com a ativação do complexo Prf / Pto. Em contraste, os resultados anteriormente publicados 47,63 mostraram que as mutações pontuais individuais de Ser-198 e Thr-199 para alanina, o que impede a fosforilação destes locais, são capazes de sinalização, sugerindo que a fosforilação destes locais é não um pré-requisito para a activação complexo . Estes resultados podem ser explicados por fosforilação do local secundário Thr-195. Visão semelhante à plasticidade local de fosforilação da outra proteína quinase pode ser obtido seguindo este protocolo. Além disso, uma abordagem combinada utilizando sítios de fosforilação mutações pontuais, as proteínas que podem inibir quinases específicas (efetoras) juntamente com a imunoprecipitação da proteína e análise por espectrometria de massa irá conduzir a uma melhor compreensão do significado evolutivo da plasticidade local de fosforilação de proteína-quinases.

Vias imunitárias dependem de várias modificações pós-traducionais (PTMs) de proteínas de transdução de sinais rapidamente e activar as respostas imunes 1. PTMs são alterações químicas rápidas, reversíveis e altamente específicos da estrutura de proteínas que podem afetar a conformação da proteína, atividade, estabilidade, localização e interações proteína-proteína 2-4. Nas plantas, a mais de 300 tipos de PTMs foram identificadas incluindo ubiquitinação, sumoilação, sulfatação, glicosilação, fosforilação e 2,5. Um crescente corpo de evidência ressalta a importância de PTMs em diferentes aspectos da planta imunidade 1,5,6. A fosforilação de proteínas, a fixação reversível de um grupo fosfato para uma serina, treonina ou resíduo de tirosina é um regulador de muitas funções celulares e não é de surpreender o mais altamente estudada PTM em defesa da planta cascatas de sinalização 5-11. Sinalização dependente de fosforilação é uma parte integrante da planta defeativação nse iniciada após a percepção extra-celular de micróbios por receptores transmembrana, ou reconhecimento intracelular por proteínas de resistência de vários domínios 5,8. Após a invasão de plantas, micróbios são detectados por receptores de membrana do plasma chamados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) 12. PRRs conhecidos são proteínas ambos receptores-like (LPR) ou quinases de receptores-like (RLKs), ambos carregando um ectodomain-ligação do ligante e um domínio transmembrana de passagem única. Em contraste com a LPR, RLKs têm um domínio de quinase intracelular 13-15. O ectodomínio de PRRs se liga às moléculas do micróbio elicitores conservadas chamados padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs) principais, no caso de RLKs, a autofosforilação e a transfosforilação dentro do domínio intracelular de 6, 16. A jusante da fosforilação induzida pela percepção de PRRs, fosforilação subseqüente de proteínas citoplasmáticas, incluindo quinases 17, </sup&gt; 18, E3 ligases 19, proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs) 20, 21, proteínas quinases dependentes de cálcio (CDPK) 22, 23, e fatores de transcrição 24, 25 leva à imunidade PAMP-triggered (PTI). Para além da percepção extracelular por PRRs, reconhecimento intracelular de patógenos é conseguido através dos receptores citoplasmáticos. Estes resistência de vários domínios (R) as proteínas contêm um domínio variável N-terminal, uma ligação de nucleotídeos (NB) motivo central, e repetições ricas em leucina C-terminal (LRR) e, por conseguinte, o nome de proteínas NB-LRR 26, 27. Proteínas R directa ou indirectamente reconhecer moléculas derivadas de virulência de organismos patogénicos chamados efectores, também conhecidos por alvejar PRRs e outros nodos do sistema imunológico. Reconhecimento induz defesas fortes que levam a disparada efetuador imunidade (ETI) 28-31. Proteínas NB-LRR tem um requisite motivo de ligação a ATP no domínio NB 30, 32, mas falta-lhes um domínio quinase. A fosforilação de domínios conservados de NB-LRRs tem sido relatado em uma pesquisa proteômica em larga escala 33, mas a sua relevância para a ETI não é clara. À semelhança do PTI, ativação de proteínas NB-LRR leva a fosforilação de proteínas citoplasmáticas, incluindo MAPKs 34-37 e 38-40 CDPKs. Mais importante ainda, o reconhecimento efector pode conduzir à fosforilação de proteínas acessórias que interagem directamente com as proteínas de NB-LRR 41. Alguns exemplos incluem RIN4 (Arabidopsis thaliana) e Pto (tomate, Solanum lycopersicum) proteínas que interagem com as proteínas NB-LRR, RPM1 42, 43 e Prf 44, respectivamente. Durante a infecção por bactérias de Pseudomonas syringae, a proteína efectora AvrB induz RIN4 fosforilação, muito provavelmente pela quinase do tipo receptor RIPK 45, <sup&gt; 46. Da mesma forma, no tomate a P. syringae efetores AvrPto e AvrPtoB induzir fosforilação de Pto 47. Em contraste com RIN4 qual falta um domínio cinase e devem ser trans-fosforilado, Pto é uma cinase activa capaz de auto-fosforilação 48 e trans-fosforilação de substratos 49, 50. Enquanto Pto requer sua atividade quinase para a iniciação dependente efetuador de sinalização, os mutantes Pto quinase mortos ainda são capazes de sinalizar de forma independente efetuador 51. Recentemente, explicou estas observações, demonstrando que o complexo Prf / Pto é oligomérica, contendo vários Prf e Pto moléculas 52 e que as moléculas Pto dentro do mesmo complexo pode trans-fosforilar o outro 47. Propusemos um modelo em que uma molécula de Pto (sensor) interage com a proteína efectora, causando uma mudança de conformação para a proteína NB-LRR (FRP) que por sua vez, activa uma segunda molécula Pto (helper) within o complexo. Subsequentemente, a molécula auxiliar Pto trans-fosforilação do sensor Pto conduzindo a activação completa do complexo de resistência 47. Estes exemplos demonstram que a identificação de componentes de complexos imunes e seus PTMs potenciais no reconhecimento efector pode conduzir a uma melhor compreensão de como os sinais são transduzidos de percepção efector para alvos a jusante. Aqui nós descrevemos um método de purificação de proteínas para as proteínas NB-LRR-interagindo ea posterior identificação de suas PTMs. Usamos Nicotiana benthamiana e o complexo de tomate Prf / Pto como um modelo, mas o mesmo protocolo pode ser facilmente aplicado a partir de N. RLKs benthamiana e A. thaliana 53 com pequenas modificações, como descrevemos no âmbito do protocolo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1108">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:296px;">MgCl2</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:181px;">M8266</td>
			<td style="width:436px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetosyringone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D134406</td>
			<td>toxic - 1 M stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe 1mL sterile</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2525R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silwet L-77 (surfactant)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2211</td>
			<td>1 M stock in DMSO, store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MS salts</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td>oxidizing, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>16104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>adjust pH with 1 N HCl to make 1 M Tris-HCl buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td>toxic - 0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>EC-606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td>corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PVPP (polyvinylpolypyrrolidone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5288</td>
			<td>do not confuse with PVP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DTT (DL-dithiothreitol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>toxic - 1 M stock, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plant protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>do not freeze/thaw too many times</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>corrosive, toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calyculin A</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Fluoride (NaF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7920</td>
			<td>toxic - 1 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Molybdate (Na2MoO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>0.5 M stock</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;">Sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>450243</td>
			<td>toxic - Prepare a 200 mM solution of sodium orthovanadate. Adjust the pH to 10.0 using either 1N NaOH or 1N HCl. The starting pH of the sodium orthovanadate solution may vary with lots of the chemical. At pH 10.0 the solution will be yellow. Boil the solution until it turns colorless (approximately 10 minutes). Cool to room temperature.Readjust the pH to 10.0 and repeat steps 3 and 4 until the solution remains colorless and the pH stabilizes at 10.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kinematica Polytron tissue homogeniser</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-451-320&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855-1R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-FLAG M2 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2220</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-agarose</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td>20347</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GFP-Trap_A</td>
			<td>Chromotek</td>
			<td>gta-20</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-HA-Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2095</td>
			<td>this matrix is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>513-1902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLAG peptide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47868</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">StrataClean resin</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714</td>
			<td>this absorption resin is recommended for protein precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PROTEAN II XL Cell</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>this stain is recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein low-binding tubes (LoBind)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 108.116</td>
			<td>these tubes are recommended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium bicarbonate (ABC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9830</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83639</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-chloroacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>22790</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>irritant, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14265</td>
			<td>toxic, corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water-bath sonicator</td>
			<td>Ultravawe</td>
			<td>Ultra BT Ultrasonic Bath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LTQ-Orbitrap XL</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trichostatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8552</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of post-translational modifications of plant protein complexes

As plantas se adaptar rapidamente às mudanças no ambiente, devido à elaboração de percepção e sistemas de sinalização. Durante o ataque de patógenos, as plantas respondem rapidamente a infecção através do recrutamento e ativação de complexos imunes. A activação dos complexos imunes é associado com modificações pós-traducionais (PTMs) de proteínas, tais como fosforilação, glicosilação, ubiquitinação ou. Compreender como esses PTMs são coreografadas levará a uma melhor compreensão de como a resistência é alcançada. Aqui nós descrevemos um método de purificação de proteínas para repetições ricas em leucina de ligação de nucleotídeos (NB-LRR)-interagindo proteínas ea posterior identificação de suas modificações pós-traducionais (PTMs). Com pequenas modificações, o protocolo pode ser aplicado para a purificação de outros complexos de proteínas de plantas. O método baseia-se na expressão de uma versão com etiquetas-epitopo da proteína de interesse, a qual é subsequentemente parcialmente purificado by imunoprecipitação e submetido a espectrometria de massa para a identificação de proteínas que interagem e PTMs. Este protocolo demonstra que: i). Estas alterações dinâmicas em PTMs tais como a fosforilação pode ser detectado por espectrometria de massa; ii). É importante ter quantidades suficientes da proteína de interesse, e este pode compensar a falta de pureza do imunoprecipitado, iii). A fim de detectar PTMs de uma proteína de interesse, esta proteína tem de ser imunoprecipitada a obter uma quantidade suficiente de proteína.

Descrevemos aqui um protocolo para a purificação de proteínas marcadas de estável transgênico A. thaliana linhas ou após a expressão transitória de proteínas em N. benthamiana. Tal como ilustrado na Figura 1 a purificação da proteína alvo é acoplado com espectrometria de massa para permitir a identificação de proteínas que interagem e os PTMs da proteína alvo. O protocolo foi concebido para purificação de proteínas envolvidas na imunidade da planta e a identificação dos seus PTMs, mas pode ser aplicado para a purificação de qualquer proteína de plantas com etiquetas. Como um exemplo, usamos a purificação do complexo Prf / Pto de N. benthamiana. N. O transgênico linha benthamiana 38-12 54, expressando 35S: Pto, foi temporariamente transformado com 35S: Prf-FLAG eo complexo foi imunoprecipitado com anti-FLAG M2 agarose (Figura 2A). As imunomarcações (IB) na Figura 2Ailustram que a maior parte da proteína alvo (Prf) foi imunoprecipitada. Pto e da proteína efectora interage AvrPtoB foram copurified com Prf e detectada utilizando anticorpos e análise de espectrometria de massa (Figuras 2A e 2B). Descobrimos que o Pto que copurified com Prf migraram mais lento em gel SDS-PAGE, quando co-expressos com o efetor constrói 35S: AvrPto e 35S: AvrPtoB (Figura 2A). Ambas as proteínas efectoras induzida migração mais lenta do Pto Prf-interagindo (Figura 2A). Este efectoras dependente de reconhecimento lenta migração de Pto foi anteriormente atribuído à fosforilação uma vez que podia ser removido por tratamento com fosfatase 44. Para detectar os locais de fosforilação que contribuem para a migração lenta do Pto, que submetido a copurifying Prf Pto para análise por espectrometria de massa. Apesar da alta expressão do Pto e sua detecção fácil com immunoblots poderíamos recuperar peptídeos cOvering apenas 57% da seqüência Pto e não conseguimos identificar quaisquer sítios de fosforilação (Figura 2B). Posteriormente, mudou as estratégias para atingir a proteína Pto com anti-FLAG. N. plantas benthamiana WT foram transitoriamente transformado com 35S: Prf-3HA e 35S: Pto-bandeira, com ou sem 35S: AvrPto e 35S:. AvrPtoB A quantidade total de proteína Pto, compreendendo tanto o Prf-complexado e as formas livres, foi imunoprecipitado com anti-FLAG M2 de agarose e submetido a fraccionamento por SDS-PAGE, em gel de digestão tríptica e análise de espectrometria de massa (Figura 2C). Com esta abordagem foram identificados peptídeos Pto abrangendo cerca de 80% de sua seqüência e um desconhecido 100 proteína interagindo kDa. Identificamos um conjunto de sítios de fosforilação individuais e duplos para tomada de força peptídeos 187-202 e 188-202 (Tabela 1). Ser-198 e Thr-199 foram os locais de fosforilação predominantes, mas outros phosítios sphorylation também foram detectadas (Tabela 1). O mais importante é a fosforilação dupla na Ser-198 e Thr-199 foi identificado apenas na presença de qualquer uma das proteínas efectoras (Tabela 1). Recentemente, identificou um conjunto semelhante de sítios de fosforilação Pto e ilustrou a importância do evento para a sinalização dupla fosforilação 47. Seguindo o protocolo descrito aqui, fomos capazes de identificar as mudanças dinâmicas no estado de fosforilação da proteína alvo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" /> Figura 1. Delineamento experimental Geral. A proteína alvo para imunoprecipitação (IP) é marcado e expressa em planta, Nicotiana benthamiana transitoriamente em forma estável ou em Arabidopsis thaliana. Após a extracção de proteínas doproteína alvo é imunoprecipitada com uma matriz de afinidade. As proteínas são separadas num gel de acrilamida por electroforese. Bandas de gel são excisadas. As proteínas são extraídas das bandas do gel e submetido a espectrometria de massa. Sítios de fosforilação e proteínas que interagem são identificados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" /> Figura 2. Prf e Pto imunoprecipitação. UM). A construção 35S: Prf-FLAG foi transitoriamente expressa em 38-12 linha (35S: PTO), juntamente com vetor vazio (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB. Três dias após a infiltração Prf foi imunoprecipitou usando matriz de afinidade anti-FLAG. Immunoblots (IB) para Prf, AvrPtoB e Pto foram realizados. Como apontado por setas na parte inferior do painel de immunoblot Pto, AvrPto e AvrPtoB induzir uma migração mais lenta de Pto. B). A construção 35S: Prf-FLAG foi transitoriamente expressa em 38-12 linha (35S: PTO), juntamente com vetor vazio (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB. Três dias após a infiltração Prf foi imunoprecipitado usando agarose de anti-FLAG e separadas em SDS-PAGE. O gel foi corado com Azul Brilhante de Coomassie coloidal (CCBB) e o Prf visível, Pto e AvrPtoB proteínas bandas foram excisadas do gel e analisados ​​por espectrometria de massa. A cobertura percentual de sequências de péptido Pto e Prf identificadas por espectrometria de massa é indicado. C). As construções 35S: Prf-3xHA e 35S: Pto-FLAG foram transitoriamente expressa juntamente com 35S: AvrPtoB, 35S: AvrPto ou vetor vazio (EV) em N. benthamiana. Três dias após a infiltração da quantidade total dePto-FLAG foi imunoprecipitado usando anti-FLAG de agarose e resolvidas em SDS-PAGE. O Pto Pto-visível e interagindo bandas de proteína foram excisadas do gel e analisados ​​por espectrometria de massa. Pto e a banda de proteína de 100 kDa Pto-interagindo são claramente visíveis na coloidal de Coomassie Brilliant Blue (CCBB)-gel corado, enquanto Prf é ligeiramente menos visível (como indicado pelas setas). IP: Immunoprecipitation; IB: Imunoblot; CBB: Coomassie coloração azul brilhante; CCBB: coloração Coomassie Brilliant Blue coloidal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Prf </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> EV </td><td rowspan="2"> AvrPto </td><td rowspan="2"> AvrPtoB </td></tr><tr><td> Peptídeo Pto 188-202 </td></tr><tr><td> GTELDQ [p T 195] HLSTVVK </td><td&gt; 1 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [p S 198] TVVK </td><td> 10 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLS [p T 199] VVK </td><td> 8 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> G [p T 190] ELDQTHLS [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> GTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 8 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTELDQTHLSTVVK </td><td> 46 </td><td> 26 </td><td> 48 </td></tr><tr><td> Peptídeo Pto 187-202 </td><td colspan="3"></td></tr><tr><td> KGTELDQ [p T 195] HLS TVVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [p S 198] TVVK </td><td> 17 </td><td> 17 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLS [p T 199] VVK </td&gt; <td> 4 </td><td> 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> KGTELDQ [p T 195] HLS [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHL [p S 198] [p T 199] VVK </td><td> 0 </td><td> 7 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> KGTELDQTHLSTVVK </td><td> 21 </td><td> 37 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> Peptídeos 187-202 e 188-202 </td><td> 83 </td><td> 88 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> Percentagem de péptidos com dois eventos de fosforilação </td><td> 0% </td><td> 26,9% </td><td> 11,2% </td></tr><tr><td> Pto Sequence Cobertura </td><td> 78% </td><td> 79% </td><td> 82% </td></tr></tbody></table> Tabela 1 fosforilação dobro de um peptídeo Pto após a ativação da sinalização: 35S. Prf. 3xHA e-35S: Pto-FLAG foram transitoriamente expressa juntamente com emvetor pta (EV), 35S: AvrPto ou 35S: AvrPtoB em N. benthamiana. Três dias após a infiltração da quantidade total de proteína Pto-FLAG foi imunoprecipitou usando matriz de afinidade anti-FLAG e resolvidas em SDS-PAGE. As bandas visíveis de Pto na Coomassie brilhante gel manchado azul coloidal foram excisadas e analisadas com espectrometria de massa. É indicado o número de peptídeos Pto identificados com 0, 1 e 2 eventos de fosforilação. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tabela de buffers </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Médio L </td><td> Tryptone </td><td> 10 g / L </td></tr><tr><td></td><td> O extrato de levedura </td><td> 5 g / L </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 5 g / L </td></tr><tr><td></td><td> D-glicose </td><td> 1 g / L </td></tr><tr><td> Agro-tampão infiltração </td><td> MgCl2 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> MES &lt;/ Td&gt; <td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Ajustar a pH 5,5 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Acetoseringona (opcional) </td><td> 150 uM </td></tr><tr><td> Tampão A </td><td> Tris-HCl pH 7,5 </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> NaCl </td><td> 150 mM </td></tr><tr><td></td><td> EDTA </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td></td><td> EGTA </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td></td><td> Glicerina </td><td> 5% (v / v) </td></tr><tr><td> Tampão B </td><td> Tampão A </td><td></td></tr><tr><td></td><td> PVPP </td><td> 2% (w / v) </td></tr><tr><td> Tampão C </td><td> Tampão B </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Planta de Inibidor de Protease Cocktail </td><td> 1% (v / v) </td></tr><tr><td></td><td> Fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) </td><td> 0,5 mM </td&gt; </tr><tr><td></td><td> A caliculina </td><td> 50 nM </td></tr><tr><td></td><td> Fluoreto de sódio (NaF) </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td></td><td> Molibdato de sódio (Na 2 MoO 4) </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td></td><td> Ortovanadato de sódio </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td></td><td> Ácido Okadaic </td><td> 100 nM </td></tr><tr><td> Tampão D </td><td> Tampão C sem PVPP </td><td></td></tr><tr><td> 5x tampão de carga de SDS-PAGE </td><td> Tris-HCl pH 6,8 </td><td> 60 mM </td></tr><tr><td></td><td> SDS </td><td> 2% </td></tr><tr><td></td><td> Glicerina </td><td> 0,15% </td></tr><tr><td></td><td> Azul de bromofenol </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td></td><td> DTT (adicionar imediatamente antes da utilização) </td><td> 50 mM </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Buffer e receitas de mídia.

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Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Descrevemos aqui um protocolo para a purificação e caracterização de complexos de proteínas de plantas. Nós demonstramos que por imunoprecipitando uma única proteína dentro de um complexo, para que possamos identificar as suas modificações pós-traducionais e seus parceiros que interagem.

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

identification-post-translational-modifications-plant-protein

Research

JoVE Journal

Biology

23.7K visualizações.  University of Warwick.  Descrevemos aqui um protocolo para a purificação e caracterização de complexos de proteínas de plantas. Nós demonstramos que por imunoprecipitando uma única proteína dentro de um complexo, para que possamos identificar as suas modificações pós-traducionais e seus parceiros que interagem. 

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Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biologia

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within the cell, type III effectors subvert host cellular processes to suppress immune responses and promote pathogen growth. Numerous type III effectors of plant and animal bacterial pathogens have been identified to date, yet only a few of them are well characterized. Understanding the functions of these effectors has been undermined by a combination of functional redundancy in the effector repertoire of a given bacterial strain, the subtle effects that they may exert to increase virulence, roles that are possibly specific to certain infection stages, and difficulties in genetically manipulating certain pathogens. Expression of type III effectors in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae may allow circumventing these limitations and aid to the functional characterization of effector proteins. Because type III effectors often target cellular processes that are conserved between yeast and other eukaryotes, their expression in yeast may result in growth inhibition phenotypes that can be exploited to elucidate effector functions and targets. Additional advantages to using yeast for functional studies of bacterial effectors include their genetic tractability, information on predicted functions of the vast majority of their ORFs, and availability of numerous tools and resources for both genome-wide and small-scale experiments. Here we discuss critical factors for designing a yeast system for the expression of bacterial type III effector proteins. These include an appropriate promoter for driving expression of the effector gene(s) of interest, the copy number of the effector gene, the epitope tag used to verify protein expression, and the yeast strain. We present procedures to induce expression of effectors in yeast and to verify their expression by immunoblotting. In addition, we describe a spotting assay on agar plates for the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. The use of this protocol may be extended to the study of pathogenicity factors delivered into the host cell by any pathogen and translocation mechanism.

In this video, we describe a procedure for the expression of bacterial type III effectors in yeast and the identification of effector-induced growth inhibition phenotypes. Such phenotypes can be subsequently exploited to elucidate effector functions and targets.

Identificação de fenótipos inibição do crescimento induzido pela expressão de Effectors Tipo III bacteriana em Yeast

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Detecção de modificações pós-translacionais sobre Native Nucleossomos Intact por ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

Método para o isolamento e identificação de mRNAs, microRNAs e componentes proteicos de complexos de ribonucleoproteínas de extratos celulares utilizando RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Brotando Yeast extração e purificação de proteínas para o estudo da função, interações e modificações pós-traducionais

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...