Fundos para o desenvolvimento da pipeta de extracção foi fornecida em parte, por uma investigação interna e concessão Desenvolvimento atribuído a DRP.

1. Lise da amostra <ol><li> As amostras devem ser em forma líquida. Se a amostra é sólida, por exemplo alimentos ou fezes, a amostra deve ser suspenso num meio líquido tal como água ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Misturar 500 uL da amostra com 500 uL de tiocianato de guanidina 6M (pH 6,5) em um tubo de 1,5 ml. </li><li> Deprimir a lâmpada de uma pipeta de extracção, expulsando o ar ambiente. </li><li> Puxar a amostra mL inteiro 1 para a pipeta de extracção, ao longo do material sorvente, permitindo que a lâmpada lentamente expandir. </li><li> Inverta a ferramenta de extracção de tal modo que as pérolas de adsorvente e de drenagem de amostra no bolbo. </li><li> Moer os grânulos absorventes com a amostra na ampola com cuidado para não expelir a amostra para fora da pipeta de extracção. </li></ol> 2. Extracção de ácido nucleico (Figura 1, Painel A) <ol><li> Inverta a pipeta de extracção (a abertura para baixo) e expelir a amostra para o tubo mL inicial de 1,5. </li> &lt;li&gt; Puxar o inteiro 1 mL de amostra para a pipeta de extracção, que passa sobre o adsorvente, a uma taxa moderada, tomando cuidado para manter o sorvente no pescoço da pipeta de extracção. </li><li> Expulsar toda a amostra dentro do tubo de 1,5 mL, pressionando o bulbo. </li><li> Repetir os passos 2.2 e 2.3, passando a amostra ao longo dos sorventes mais quatro vezes para um total de 5 passagens. </li><li> Após a passagem através da quinta sorvente, expelir o inteiro 1 mL de amostra em 4mL de tampão de extracção de proteína (em um tubo cónico de 15 mL), fechar o tubo, e retiradas para utilização posterior. </li><li> Lavar os ácidos nucleicos isolados por passagem de 1 mL de etanol a 95% ao longo dos sorventes três vezes, voltando o etanol, para o seu tubo original mediante passagem final. </li><li> Repetir o passo 2,6 utilizando uma mL de 1 segundo, de lavagem etanol a 95%. </li><li> Pressione e solte a lâmpada por 5 minutos, passando do ar ambiente em toda a pipeta de extração para secar os ácidos nucléicos Pensão sorvente. Wipe etanol residual a partir da ponta da pipeta extracção ucantar uma Kimwipe. </li><li> Recuperar os ácidos nucleicos por passagem 250 uL de 10 mM Tris (pH 6,8) ao longo dos sorventes cinco vezes. O tampão de Tris pode ser substituído por qualquer outra solução apropriada aquoso tal como PBS. A solução resultante contém os ácidos nucleicos extraídos. </li></ol> 3. Extracção de proteína (Figura 1, Painel B) <ol><li> Misturar a amostra e proteína tubo tampão de extracção a partir do passo 2,5 por inversão e passar aproximadamente 2-3 mililitros desta amostra de 5 mL ao longo do sorvente de uma pipeta de extracção novo. </li><li> Expelir toda a amostra para o tubo de 15 mL mesma cónica tendo o cuidado de manter o sorvente no pescoço da pipeta de extracção. </li><li> Repetir os passos 3.1 e 3.2, passando a amostra ao longo dos sorventes 15 vezes. </li><li> Lavar o sorvente ea proteína ligada por passagem de 1 mL de etanol a 95% em relação ao leito adsorvente, três vezes, etanol a ejectar em que o tubo original. </li><li> Repetir o passo 3,4 utilizando uma mL de 1 segundo, de lavagem etanol a 95%. </li><html><li> Prima e liberte a lâmpada durante 5 minutos, passando o ar ambiente por toda a pipeta de extracção para secar a proteína / leito adsorvente. Wipe etanol residual a partir da ponta da pipeta de extracção utilizando um Kimwipe. </li><li> Recuperar a proteína por passagem 250 uL de PBS ao longo dos sorventes cinco vezes. O tampão PBS pode ser substituído por qualquer outra solução apropriada aquoso, tal como 10 mM de Tris (pH 6,8). A solução resultante contém o teor de proteína da amostra. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="A Figura 1A" /> Figura 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="A Figura 2" /> Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="A Figura 3" /> Figura 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="A Figura 4" /> Figura 4. conteúdo &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="A Figura 5" /> Figura 5.

<ol>
	<li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries,+1984-2005.">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li><li>Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+Pipette.">Extraction Pipette.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li><li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample.">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , (2010).</li><li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli.">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li><li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea.">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li><li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain.">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li><li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages.">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited. , (2004).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes.">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

As ferramentas, químicas e protocolo descrito no presente relatório representa o primeiro exemplo conhecido de uma electricidade livre de sistema de extracção, multi-macromolécula que pode ser utilizada no campo, baseadas em ponto de cuidados de aplicações. Ambos os tipos macromolécula pode ser aplicado a um número de dispositivos de diagnóstico ou a jusante analítica. Por exemplo, os ácidos nucleicos isolados são de PCR de qualidade (Figura 2 e 3), enquanto o componente de proteína da amostra é imunoreactivo (Figura 4). A utilização deste sistema de extracção em austeros ou recurso áreas limitadas do mundo poderia reduzir drasticamente a carga de doenças nas populações que ali vivem. Este sistema de extracção também podem ajudar em programas de doenças de vigilância em todo o mundo, fornecendo um método robusto ainda rápida e de custo eficaz para o processamento de amostras em locais inóspitos ou remotos. Um aspecto importante para o método de extracção descrito acima é queele pode ser modificado pelo utilizador. Por exemplo, nos casos em que o tamanho da amostra é maior ou menor do que os iniciais 500 μLs (passo 1.2), o utilizador pode ajustar os volumes dos reagentes em conformidade. Isto é, a relação volumétrica dos reagentes para o tamanho da amostra deve permanecer constante enquanto os volumes absolutos podem ser alteradas. Além disso, os ajustes no número de passagens durante o sorvente pode também ser feita à discrição do utilizador. Por exemplo, se um volume de amostra maior é usado, passando a amostra ao longo dos tempos sorventes mais do que listadas (passos 2.4 e 3.3) vai aumentar a probabilidade de o tipo de macromolécula (ácido nucleico ou proteína) o contacto do sorvente. O aumento nas passagens deve aumentar a eficiência capturar até à saturação sorvente é atingido. Nós descobrimos que a ferramenta de extracção e de produtos químicos associados têm algumas limitações, sendo o mais significativo dos quais é que a química de extracção de proteína é ineficiente para a recuperação de altamente glicosiladaproteínas. No caso em que o diagnóstico jusante ataca uma proteína glicosilada, este sistema não pode ser ideal para a identificação. Além disso, os limites superior e inferior da eficiência de extracção, quer para ácidos nucleicos ou proteínas ainda estão a ser determinado, e optimização está em curso para maximizar a eficiência de recuperação. Maior desenvolvimento da ferramenta irá superar estas lacunas de conhecimento atuais.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Tiocianato de guanidina </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> etanol </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td></tr></tbody></table>

electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation

Patógenos tradicionais e emergentes, tais como Escherichia coli entero (EHEC), Yersinia pestis, ou príon baseados doenças são de grande preocupação para governos, indústrias e profissionais da área médica em todo o mundo. Por exemplo, EHECs, combinados com Shigella, são responsáveis ​​pelas mortes de aproximadamente 325.000 crianças a cada ano e são particularmente prevalentes no mundo em desenvolvimento, onde baseado em laboratório de identificação, comum nos Estados Unidos, não está disponível 1. O desenvolvimento ea distribuição de baixo custo, baseados em campo, ponto-de cuidados de ferramentas para ajudar na identificação rápida e / ou diagnóstico de patógenos ou marcadores de doença poderia alterar drasticamente a progressão da doença eo prognóstico do paciente. Nós desenvolvemos uma ferramenta para isolar os ácidos nucleicos e proteínas a partir de uma amostra por extracção em fase sólida (SPE) sem electricidade ou equipamento associado laboratório 2. As macromoléculas isolados podem ser utilizados para diagnósticosis quer em um laboratório para a frente ou usando campo baseados no ponto-de-cuidado plataformas. É importante ressaltar que este método prevê a comparação direta de ácidos nucléicos e proteínas de dados a partir de uma amostra não-divisão, oferecendo uma confiança através de comprovação de análise genômica e proteômica. A nossa ferramenta de isolamento utiliza o padrão da indústria de fase sólida para o isolamento de ácido nucleico, a tecnologia BOOM, que isola os ácidos nucleicos a partir de uma solução de sal caotrópico, geralmente isotiocianato de guanidina, através da ligação a base de sílica partículas ou filtros 3. Química CUBRC de extracção em fase sólida de propriedade é usado para purificar a proteína a partir de soluções de sal caotrópicos, neste caso, a partir dos resíduos ou de fluxo através após isolamento de ácido nucleico 4. Por uma embalagem bem caracterizado químicas em uma plataforma de pequeno, barato e simples, que geraram um sistema portátil para a extracção de ácido nucleico e proteína que pode ser realizado sob uma variety de condições. Os ácidos nucleicos isolados são estáveis ​​e podem ser transportados para uma posição onde a energia está disponível para amplificação por PCR, enquanto o teor de proteína pode ser imediatamente analisadas por mão ou outros imunológica ensaios baseados. A rápida identificação de marcadores de doenças no campo poderiam alterar significativamente o resultado do paciente, orientando o curso apropriado do tratamento em um estágio anterior de progressão da doença. A ferramenta e método descritos são adequados para utilização com virtualmente qualquer agente infeccioso e dar ao utilizador a redundância de análises de tipo multi-macromolécula, reduzindo simultaneamente a sua carga logístico.

Isolamento de ácido nucleico: ácidos nucleicos isolados são PCR amplificável e livre de contaminação de proteína. Exemplo 1: Os ácidos nucleicos recuperados são adequados para utilização na PCR aplicações baseadas. Por exemplo, a Figura 2 mostra a amplificação de genes associados a toxina Shiga entero E. coli O157: H7 estirpe EDL-933 (ATCC # 35150) de um procedimento de extracção de ácido nucleico / proteína utilizando a pipeta de extracção. Os genes toxina Shiga stx 1 e stx 2 são encontrados em bacteriófago lambda do tipo temperado e com defeito bacteriófago nesta e em outras entero E. coli sob o controlo do promotor P R 5 6 7 8. A ativação da resposta SOS em E. coli leva a profago indução e / ou a produção de toxina 9. Nós utilizada uma versão modificada do ensaio de PCR multiplexado por Feng et ai. 11 para identificar a stx 1 e stx 2 genes, tanto em cultura e as amostras de esgoto perfurantes. As pistas A e B na Figura 2 mostram os resultados de uma amplificação por PCR de uma amostra de cultura não transformadas (pista A) e uma amostra de cultura processado (pista B). Estes resultados são significado praticamente idêntico, não há perda de fidelidade nos ácidos nucleicos transformados ou isolado. A seguir, amplificado esgoto enriquecido (pista D) ou ácidos nucleicos isolados de esgoto enriquecido (pistas E &amp; F). Estes dados indicam que os ácidos nucleicos isolados resultou em maior amplificação versus os ácidos nucleicos não isoladas a partir de amostras de esgoto perfurantes. Concluímos, portanto, que os inibidores de PCR quer naturalmente encontrados no esgoto foram removidos no isolamento ou que os ácidos nucleicos foram concentrados no isolamento. Uma combinação destas duas hipóteses é também possível. Espectroscopia de ultravioleta foi próxima usado para mostrar que os ácidos nucleicos isolados eram relativamente livre oproteína f contaminante. A Figura 3 mostra os espectros de UV de dois E. isolamento de ácido nucleico H7 extracções, rotulados e um b isolamento, em comparação com o espectro normalizado da cultura bacteriana, rotulada isolamento do pré-: coli O157. Os espectros de UV dos ácidos nucleicos isolados semelhante à espectros de puras ácidos nucleicos, tendo uma proporção calculada de absorvância entre 260 nm e 280 nm que se aproximam 1,8 10. Estes dados mostram que há muito pouca proteína contaminante na fracção de ácido nucleico recuperado utilizando a técnica descrita. Isolamento da proteína: proteína recuperado a partir da experiência de isolamento de ácido nucleico / proteína é imunorreactivo e electroforeticamente idêntica à proteína pura. Exemplo 2: A fracção de proteína isolada foi aplicada ao E. RapidChek coli O157 tiras de fluxo lateral de ensaio (SDIX, Inc.). Controles de mostrar uma identificação positiva em todas as amostras que abrigam E. coli<html> O157, com ou sem STX indução (Figura 4, pistas B e C, respectivamente). Os dados na Figura 4 também mostram resultados positivos para as amostras que albergam E. coli O157 que foram processados ​​para ácidos nucleicos e então a proteína utilizando a pipeta de extracção. Estes dados mostram que a proteína isolada a partir de cada amostra é imunoreactivo desencadeando assim uma resposta positiva. A amplificação por PCR (como descrito no Exemplo 1) foi realizada sobre as amostras de proteína para mostrar que a fracção de proteína isolada era desprovido de contaminantes ácidos nucleicos. Os resultados para estes experimentos foram todos negativos por eletroforese em gel. Assim, conclui-se que o teor de proteína da amostra foi separada a partir de ácidos nucleicos contaminantes. Estes resultados, tomada em conjunto com as descritas para o passo de ácido nucleico mostram que o isolamento dos ácidos nucleicos e teor de proteína são isolados em passos de fraccionamento separadas. t &quot;&gt; Exemplo 3:. A proteína isolada é adequado para electroforese 10 A Figura 5 representa uma coomassie coradas gel de acrilamida a 8% carregado com BSA (Figura 5, pistas A e C) e BSA isolado a partir de 6M isotiocianato de guanidina utilizando a extracção pipeta e associado protocolo. A mobilidade electroforética da proteína isolada é idêntica à das amostras de controlo. Concluímos daí que o processo de extracção não altera a estrutura covalente da proteína isolada. <img alt="Figura 1a" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> Figura 1, Painel A: Representação de um procedimento de extracção de ácido nucleico típico A amostra é misturada com tiocianato de guanidina 6M no tubo de amostra e passada ao longo dos sorventes cinco vezes.. Após a última passagem, a amostra é adicionada ao tampão de extracção de proteínas. Os ácidos nucleicos sorventes e acoplado são lavadas duas vezes com etanol. A amostra é então ar dRied e eluiu-se a partir do adsorvente. <img alt="A Figura 1b" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> A Figura 1, Painel B: Representação de um procedimento típico da proteína de extracção A amostra misturada com tampão de isolamento de proteínas a partir do passo 1, a Figura 1, painel A é passado sobre o sorvente de uma pipeta de extracção segundo 15 vezes.. O resto do procedimento é idêntico ao do protocolo de extracção de ácido nucleico. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> Figura 2:. Imagem negativa de um brometo de etídio gel de agarose corado Um multiplexados toxina Shiga 1 e 2 experimento amplificação do gene foi realizada utilizando amostras de cultura (pistas A e B) ou de amostras de esgoto em bruto dopada com E. coli O157: H7 (pistas D, E e F). As amostras foram, quer directamente adicionado a um tubo de reacção de PCR (pistas A e D) ou as amostras foram processadas utilizando o proces isolamentos, e os ácidos nucleicos extraídos foram adicionados ao tubo de reacção de PCR (Amostras B, E e F). O protocolo de PCR é uma modificação do descrito por Feng et al 11. Nossa modificação alvo apenas aqueles amplificado pelo stx 1 (banda inferior) e stx 2 (banda superior) pares de primers, abandono todos os pares de primers outros. Pista C é a escada 1Kb da BioRad. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> Figura 3: Os resultados de espectroscopia de UV de E. coli O157: H7 ácidos nucleicos isolados utilizando a pipeta de extracção relatado Os ácidos nucleicos isolados são rotulados isolamento e uma b isolamento.. O espectro de UV da amostra foi também testada antes da extracção de ácido nucleico e é rotulado pré-isolamento. Os espectros foram obtidos utilizando um Espectrofotómetro Hitachi U3010 e associados pacote de software. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; Figura 4:. Foto cor de tiras de teste RapidChek O conteúdo de proteína das amostras utilizadas na Figura 2 foi isolado utilizando a pipeta de extracção e testados para a imuno-reactividade por ensaio de fluxo lateral. Lanes AC são controlos não transformados, que é, a cultura de células foi adicionado para a tira de teste sem ácido nucleico ou de extracção de proteínas. Pista A é E. coli BL21 DE3 pLysS como um controlo negativo, Lanes B e C mostram E. coli O157: H7 que não foi tratado (B), ou tratadas com mitomicina C durante 4 horas (C). Lanes D através de H mostram os resultados da adição da proteína extraída para as tiras de teste de fluxo lateral. Lanes D e E foram sondadas utilizando o extracto de proteína a partir de E. coli BL21 DE3 pLysS, quer sem (D) ou com mitomicina C tratamento (E) como controlos negativos. Lanes FH mostrar os resultados quando extraído de proteínas de E. coli O157: H7 foi usado. A proteína foi extraída não tratado (F), ou a partir de 2 horas (G) ou 4 horas (H) da mitomicina C culturas tratadas.Os resultados positivos produzir uma linha dupla vermelha. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> Figura 5:. A fotografia de um corado com Coomassie SDS-PAGE BSA foi isolado a partir da solução utilizando a pipeta de extracção e protocolos descritos. As pistas A e C são faixas de controlo de 250 ug / mL e 500 ug / mL, respectivamente. Lanes B e D representam BSA recuperado a partir de soluções contendo as mesmas concentrações como os seus respectivos controlos.

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Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Uma ferramenta e químicas são descritos para sequencialmente isolar os ácidos nucleicos, seguido por proteínas a partir de uma amostra sem a necessidade de electricidade. A ferramenta é constituída por um sorvente realizada dentro de uma pipeta de transferência, enquanto os produtos químicos de isolamento são baseado em princípios de fase sólida de extracção. As macromoléculas isoladas podem ser analisados ​​através de ensaios de imuno-base e baseado em PCR.

Electricidade-Free, Ácido Nucleico seqüencial e isolamento de proteínas

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

12.4K visualizações.  CUBRC, Inc.. Uma ferramenta e químicas são descritos para sequencialmente isolar os ácidos nucleicos, seguido por proteínas a partir de uma amostra sem a necessidade de electricidade. A ferramenta é constituída por um sorvente realizada dentro de uma pipeta de transferência, enquanto os produtos químicos de isolamento são baseado em princípios de fase sólida de extracção. As macromoléculas isoladas podem ser analisados ​​através de ensaios de imuno-base e baseado em...

Vídeo: Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

Análise e construção de estruturas de Ácido Nucleico com 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Isolamento de proteínas a partir da Embryonic Rato Coração Região Válvula Desenvolvimento

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Rotulagem específica de seqüência de ácidos nucléicos e proteínas com Metiltransferases e cofator Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing technologies have allowed for the rapid and efficient characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene sequencing from a variety of sources. Although readily available tools for 16S rRNA sequence analysis have standardized computational workflows, sample processing for DNA extraction remains a continued source of variability across studies. Here we describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs. We also delineate downstream methods for 16S rRNA gene sequencing, including generation of sequencing libraries, data quality control, and sequence analysis. The workflow can accommodate multiple samples types, including stool and swabs collected from a variety of anatomical locations and host species. Additionally, recovered DNA and RNA can be separated and used for other applications, including whole genome sequencing or RNA-seq. The method described allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates downstream analysis of genomic, metagenomic and transcriptional information.

We describe an efficient, robust, and cost effective method for extracting nucleic acid from swabs for characterization of bacterial communities using 16S rRNA gene amplicon sequencing. The method allows for a common processing approach for multiple sample types and accommodates a number of downstream analytic processes.

Eficiente de Ácido Nucleico Extração e sequenciamento genético 16S rRNA para Bacteriana Comunidade Caracterização

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...