Nosso protocolo permite a visualização do metabolismo espacial das interações microbianas que ocorrem durante a infecção. Desenvolvemos este fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imagem para coculturas bacterianas cultivadas em modelos de ágar e tecido. A análise de substratos não tradicionais, como culturas bacterianas cultivadas em ágar, apresenta muitos desafios.
Usando nosso protocolo, as amostras bacterianas podem ser secas adequadamente para facilitar a aplicação da matriz MALDI na análise subsequente de espectrometria de massa por imagem. Este método é amplamente aplicável a uma variedade de metabólitos, patógenos ou doenças microbianas e tipos de amostras em que uma medida espacial da bioquímica celular ou tecidual é desejada, particularmente ao estudar tipos de amostras que requerem desidratação antes da análise. Depois de preparar as macrocolônias de cultura bacteriana, remova as colônias bacterianas de agarose montadas em lâminas de microscópio revestidas de ITO do material de embalagem.
Colocar as amostras numa caixa seca com dessecante durante 48 a 72 horas à temperatura ambiente. Inspecione visualmente as colônias em busca de deformações na superfície do ágar. Em seguida, feche a linha de vácuo para a câmara de amostra e ligue o interruptor de energia para a bomba de palhetas rotativas para permitir que a bomba de vácuo aqueça e atinja a pressão de vácuo adequada.
Ligue o transformador de tensão variável para aquecer o filamento de fio enrolado em torno da câmara. Ajuste a fonte de alimentação variável até que a temperatura interna da câmara de vácuo atinja aproximadamente 50 graus Celsius. Enquanto a bomba está aquecendo, coloque uma pasta de gelo seco e etanol a 100% no condensador de armadilha fria.
Abra a câmara de vácuo usando uma chave inglesa para soltar os grampos de flange de pano duplo de 16 milímetros. Insira as amostras de agarose na câmara e sele firmemente a câmara com os grampos de flange de pano duplo de 16 milímetros. Em seguida, abra a válvula da bomba para evacuar a câmara e deixe as amostras secarem por 60 a 120 minutos.
Quando estiver completo, ventile lentamente a câmara de vácuo à pressão ambiente, fechando a válvula na bomba de palhetas rotativas e abrindo a flange de vácuo para o ar ambiente. Abra a câmara, como demonstrado anteriormente, e remova a amostra de agarose seca da câmara. Use a matriz MALDI de 1, 5-Diaminonaftaleno para sua dessorção e ionização favoráveis de aminoácidos e modo de íons negativos.
Prenda a amostra à bandeja do pulverizador e carregue as soluções preparadas na linha do pulverizador. Usando o software de computador, especifique os parâmetros necessários para um revestimento uniforme do composto da matriz. Monitore a sequência de pulverização até que ela seja concluída.
Retire a amostra da bandeja do pulverizador e guarde-a em um gabinete de dessecação até a análise. Insira a amostra revestida de matriz no adaptador de lâmina do microscópio de placa alvo MALDI. Inscreva pelo menos três marcadores fiduciais que abranjam a área da amostra usando marcadores permanentes.
Use um scanner de mesa para adquirir uma imagem óptica da lâmina do microscópio, incluindo os marcadores fiduciários. Agora defina um método de instrumento de espectrometria de massa como descrito no manuscrito. No modo de íons negativos, selecione a janela de massa de 100 dalton de massa por carga 100 a 200 para enriquecimento de sinal em fase gasosa usando uma abordagem de acumulação contínua de íons selecionados que engloba os valores de massa por carga dos metabólitos de interesse.
Abra o software de aquisição de imagem do instrumento e use o assistente de configuração para definir o nome e o local do arquivo, o modo de aquisição de MS, as regiões de interesse a serem amostradas e a resolução espacial da imagem. Ensine a amostra usando os marcadores fiduciais da imagem óptica para sincronizar com o suporte da amostra do instrumento. Em seguida, defina as regiões de interesse na imagem óptica usando a ferramenta de seleção de regiões de interesse do software.
Uma vez que todos os parâmetros tenham sido definidos, inicie a sequência de aquisição para adquirir em série um espectro de massa em cada pixel em toda a região de interesse definida. Após a aquisição da imagem, salve os dados com uma extensão de arquivo MIS, que é um formato de arquivo específico do fornecedor para plataformas de espectrometria de massa de imagem. Abra o arquivo de dados em pacotes de software flexImaging ou SCiLS ou exporte para um formato de dados não proprietário, como mzML, e visualize usando software neutro do fornecedor.
Usando o software de referência, defina janelas de massa para picos de interesse para gerar mapas de calor coloridos falsos de distribuições de íons nas regiões amostradas. Na exibição média do espectro de massa, amplie o pico de interesse e selecione uma janela de massa apropriada que englobe a área do perfil de pico. Agora, clique com o botão direito do mouse na janela de massa destacada e selecione Adicionar filtro de massa.
Rotular a massa selecionada por valor de carga usando a identificação provisória do metabolito suspeito, conforme determinado pela medição de massa precisa de alta resolução. Selecione o limite de intensidade para ajustar o intervalo dinâmico da imagem do analito exibido pelo mapa de calor de cores falsas. Ajuste ainda mais os parâmetros de filtragem de massa para que a janela de massa englobe a área do perfil de pico e, em seguida, adicione o filtro de massa.
Limpe todos os equipamentos de criossecção, enxaguando-os com etanol a 100%, e deixe secar antes de colocar as amostras na câmara de criostato. Prepare lâminas de microscópio revestidas de ITO usando um ohmímetro para identificar o lado da lâmina com o revestimento condutor. Usando um escriba com ponta de diamante, grave e rotule o lado revestido de ITO da lâmina do microscópio.
Em seguida, realize a criossecção em um criomicrótomo de pesquisa. Transfira os tecidos cecálicos de rato incorporados em OCT de um congelador Celsius de 80 graus para a câmara criomicrótoma em gelo seco. Dentro da câmara de criomicrótomos, monte o tecido incorporado em OCT em um mandril de amostra usando uma solução adicional de OCT.
Após a solidificação da solução OCT, fixe o mandril na cabeça da amostra e inicie a criossecção a incrementos de 10 a 50 micrômetros para atingir a profundidade ou o plano desejado do tecido do órgão. Uma vez que uma seção transversal ideal do tecido é atingida, comece a coletar seções com 12 micrômetros de espessura. Manipule suavemente a fatia usando pincéis de artista e coloque-a em uma lâmina de microscópio revestida de Teflon.
Para pegar o tecido da lâmina revestida de Teflon, enrole a lâmina do microscópio revestida de ITO no topo da seção de tecido. Descongele a seção de tecido na lâmina do microscópio pressionando a palma da mão na parte de trás da lâmina revestida de ITO. Continue a descongelar até que a seção do tecido passe de translúcida para uma textura opaca ou fosca.
Para análise no mesmo dia, transfira as lâminas do microscópio montadas no tecido em gelo seco para uma caixa seca com dessecante para armazenamento. Execute a aplicação da matriz MALDI e a espectrometria de massa de imagem MALDI, conforme demonstrado anteriormente. Analise as imagens de íons de múltiplas replicações biológicas e compare os resultados para uma significância através de comparações de gráfico de caixa de intensidade usando o software estatístico SCiLS.
A análise MALDI em modo iônico negativo de amostras de cultura bacteriana permite detectar dezenas de metabólitos. Medições de massa precisas de alta resolução permitem a identificação provisória de ornitina e arginina. As regiões de medição para análise por espectrometria de massa por imagem são mostradas.
A espectrometria de massa por imagem dessas amostras permite o mapeamento espacial de metabólitos de aminoácidos de ornitina e arginina que se encontram alterados e diferencialmente localizados na presença de Enterococcus faecalis. A morfologia tecidual da ceca de camundongo infectado foi visualizada por meio da coloração de hematoxilina e eosina. Imagens ópticas de tecidos cecais de camundongos após a aplicação de uma camada de matriz MALDI de 1, 5-Diaminonaftaleno são mostradas.
As imagens de íons MALDI para ornitina e arginina exibem distribuições espaciais únicas entre as amostras de tecido. A consideração mais importante para este protocolo é manter a secagem suave e o manuseio de amostras de cultura bacteriana para minimizar borbulhamento, rachaduras e outras deformações da amostra. Após espectrometria de massa por imagem, análises de microscopia de campo brilhante e fluorescência de amostras de tecido podem ser realizadas para avaliar a morfologia do tecido.
Isso também pode permitir a validação direcionada de vias moleculares usando métodos de imagem baseados em anticorpos.
