We would like to acknowledge the technical assistance of Kristina Jurcic in the University of Western Ontario MALDI MS facility, as well as the National Sciences and Engineering Council (NSERC) for funding this work. The authors would also like to acknowledge the Caprioli group (Vanderbilt University, TN) and Chaurand group (Universit&#233; de Montreal, QC) for their advice in optimizing the sublimation technique presented in this manuscript.

Todos os procedimentos de manipulação animal descrito abaixo aderir à Universidade do comitê de cuidados com os animais de Western Ontario (2016-014). 1. Preparação de tecidos e Seccionamento <ol><li> Extraia o tecido cerebral de ratos através de um processo conhecido como &quot;Fresco Congelado Extraction&quot; (FFE). <ol><li> Euthanize o rato com uma overdose de pentobarbital de sódio e monitorar reflexos nos membros. Uma vez que todos os reflexos cessaram, cortar a cabeça do rato, utilizando uma guilhotina. </li><li> Cuidadosamente separar os músculos e outros tecidos do crânio utilizando um bisturi. Use uma pinça de corte de osso para quebrar o crânio para expor o cérebro, a partir da base do crânio (buraco occipital) para a porção anterior. </li><li> Uma vez que o cérebro é exposto, colher-a cuidadosamente com uma espátula cirúrgica e colocar imediatamente em gelo seco esmagado para o flash de congelamento. NOTA: O cérebro vai ser muito maleável. Portanto, tome cuidado extremo ao colocar o cérebro emgelo seco. Se o cérebro é esmagado ou pressionado de encontro a uma superfície, que vai alterar a sua forma e congelar nessa posição. </li></ol></li><li> Remover o tecido fresco congelado (não perfundidos com formaldeído ou incorporado em OCT) de - 80 ° C freezer e colocar no gelo seco. </li><li> Coloque algumas gotas de água sobre um suporte de criostato e colocar em gelo seco ou barra de congelamento criostato. Imprensa tecido levemente no suporte criostato, uma vez que começa a congelar e segure até que a água congela em torno da base do tecido e ancora-lo no lugar. Adiciona-se água adicional para proteger ainda mais o tecido sobre o titular, se necessário. NOTA: A água é utilizada, em vez de meios de outubro de tecido de montagem, a fim de evitar a contaminação do tecido com os compostos que podem afectar a detecção do sinal desejado. </li><li> tecidos posição no criostato. Secção de tecido até ao local anatómico desejado. Certifique-se de que a espessura de corte é entre 8-12 mm. NOTA: Quando o corte de tecidos em criostato comunaldispositivos, é imperativo que os materiais separados, tais como lâminas, escovas, barras estabilizadoras, e os titulares de ser utilizada, a fim de evitar a contaminação com a incorporação de compostos. O interior do criostato também devem ser limpos cuidadosamente com etanol antes do uso. </li><li> Usando a barra anti-roll criostato, lentamente secção achatada secções de tecido. Furos ou marcas no tecido pode ocorrer se a colocação de barra de rolo está incorreto ou lâmina é maçante. Mova o tecido para o centro de cortar plataforma, usando pincéis limpos. </li><li> Montagem <ol><li> Congelar lâminas condutoras ou placas de metal, colocando-os no criostato, enquanto cortando. Quando o slide é completamente congelado, mova com cuidado o tecido seccionado para a superfície condutora da lâmina utilizando pincéis limpos. Uma vez que todas as secções de tecido são posicionados corretamente no slide, coloque um dedo sob o slide, em frente ao tecido, e pressione até que a secção descongela. NOTA: As Secções podem dobrar ou enrolar-se durante o processo de descongelamento quandousando este método de montagem. Este pode ser reduzido, mantendo a corrediça no criostato quando o descongelamento do tecido. Se estas questões tornar-se problemática, uma alternativa, warm-mount método é listado abaixo. </li><li> Alternativamente, dê uma temperatura ambiente de índio-estanho Oxide (ITO) de slides (ou placa de metal) e pressione levemente para baixo na seção de tecido congelado na superfície da plataforma do corte, o lado condutora para baixo. Isto conduzirá à secção de tecido descongelamento uniformemente sobre a superfície da lâmina com pouco de ondulação ou a dobragem do tecido. NOTA: A condensação pode aparecer abaixo da seção na montagem usando este método que pode levar a perda de certas proteínas e lipídios. </li></ol></li><li> Colocar as lâminas com o tecido em um exsicador para 5 - 10 min. </li></ol> 2. sublimador Aparelho Set-up NOTA: Execute estas etapas em um exaustor. <ol><li> Coloque um banho de areia num recipiente de alumínio em um prato quente, com a placa quente em um elevador de metal tesourade área de superfície adequado (por exemplo maior do que a placa quente). Ligar a placa de aquecimento e ajustar a temperatura para 140 ° C. NOTA: O ponto de fusão para a matriz DAN é entre 187-190 ° C. Não exceda esta temperatura sobre a placa. <ol><li> Se a placa de aquecimento está equipado com uma sonda de realimentação de temperatura, usá-lo para monitorar a temperatura de areia ao longo da experiência e assegurar a consistência da temperatura. Esse recurso pode ajudar com reprodutibilidade experiência em vários experimentos de sublimação. NOTA: O banho de areia deve ser contido dentro de um recipiente de alumínio como um recipiente de vidro pode se quebrar a altas temperaturas. </li></ol></li><li> Coloque 300 mg de matriz de DAN sobre a superfície inferior do aparelho de sublimação. Coloque a matriz no centro do aparelho e espalhar-se numa camada uniforme na largura e no comprimento da lâmina aproximada sendo sublimada. CUIDADO: matriz DAN é tóxico. Portanto, é importante usar luvas, máscaras, e segurançaóculos de proteção em todos os momentos ao manusear a matriz em pó. DAN devem ser armazenadas no escuro, pois é sensível à luz. </li><li> Tape uma placa de metal para a superfície interior do aparelho, com a placa que faz contacto directo com o fundo do condensador, de modo a assegurar uma distribuição uniforme da temperatura de arrefecimento através de toda a superfície da lâmina durante a sublimação. Alternativamente, a areia do fundo do condensador para assegurar uma superfície plana. <ol><li> Colocar a fita ao longo das bordas exteriores da placa e aderir aos lados do material de vidro interior. Se a fita adesiva é colocada sob a placa e adere à parte inferior da superfície de vidro interior, a distribuição de temperatura pode não ser uniforme e pode resultar na distribuição desigual da matriz sobre a superfície da lâmina. </li><li> Tape um espaço em branco (teste) deslize em diagonal através da superfície da placa de metal com a fita de novo colocada sobre os bordos exteriores da corrediça. </li></ol></li><li> Ligar as porções superior e inferior do aparelho, Wom uma borracha O-ring no meio para assegurar uma vedação completa. </li><li> Coloque um metal L-articular em torno do centro do aparelho e apertar vícios até a metade superior e inferior do aparelho são hermeticamente fechadas em conjunto. Colocar no metal de O-ring acima do banho de areia. </li><li> Pegue um punhado de gelo picado e colocá-lo no condensador. Preencha condensador de ¼ a ½ cheio com água fria para criar lama gelo. A lama de gelo irá arrefecer a placa de metal no interior do aparelho e subsequentemente a corrediça aderida a ela. Espere pelo menos 5 minutos para que a temperatura chegar a um estado estacionário. </li><li> Pour 300 ml de etanol no recipiente armadilha fria e colocar o material de vidro para dentro do recipiente. Redução de 2 - 3 pequenos pedaços de gelo seco, para o etanol na parte inferior do recipiente armadilha fria. A entrada de câmara de frio tem um tubo de vidro de correr para o fundo do cilindro, enquanto que a saída não. </li><li> Ligue a bomba de vácuo para a saída de câmara de frio utilizando tubos de borracha. Use outro pedaço de borrachatubagem de entrada para ligar a câmara de frio para o aparelho de sublimação. Certifique-se de que o tubo esteja bem preso com grampos de metal, se disponível. </li><li> Utilizar a bomba de vácuo para proporcionar um vácuo de 30 - 50 mT. Deixe a bomba funcionar durante pelo menos 5 minutos para equilíbrio de pressão. Vícios de L-anel de aparelho de sublimação pode ter que ser novamente apertados uma vez que a bomba de vácuo é ligada por causa da diminuição da pressão no aparelho. NOTA: É altamente recomendável que um indicador de vácuo ser ligado à bomba para monitorar a pressão de vácuo durante a experiência e para testar a existência de fugas de pressão, a fim de alcançar a mais alta reprodutibilidade possível entre experiências. No entanto, a maioria das bombas são concebidos para manter uma pressão constante, por conseguinte, o medidor pode não ser essencial que os utilizadores experientes. Além disso, o selo de vácuo gordura podem ser usadas para ajudar a manter a pressão de vácuo. </li></ol> 3. A sublimação <ol><li> Certifique-se de que a temperatura do banho de areia tem stabilizado a 140 ° C e que o aparelho é fixado no metal de O-ring acima do banho de areia com toda a tubagem ligado e o vácuo ligada. </li><li> Definir temporizador para 7 min, mas não iniciar o temporizador. Lentamente levantar o elevador de tesoura e areia banho até o aparelho de sublimação até o U-conjunta do sublimador está bem acima do metal O-ring. Este espaço extra permite o ajuste do aparelho sobre a areia. <ol><li> Pressione rapidamente a sublimador suavemente na superfície da areia para garantir que o aparelho está sentado uniformemente sobre a areia, e em seguida, iniciar imediatamente o temporizador. </li></ol></li><li> Quando o temporizador soa, desligue a bomba de vácuo e baixe cuidadosamente o elevador de tesoura até o sublimador não está tocando o banho de areia e está bem presa no metal O-ring. <ol><li> Lentamente solte a válvula de micro-vent para liberar a pressão no aparelho. Solte a braçadeira de metal ao redor do tubo de borracha do aparelho sublimação e lentamente começam a soltar o tubo. Uma vez que o rubber tubo foi afrouxado ligeiramente, dobrar o tubo de um lado para permitir que a pressão residual de escapar. </li><li> Quando os retornos de pressão ambiente, remova cuidadosamente o tubo de borracha do aparelho sublimação. </li></ol></li><li> Solte os vícios do U-joint do aparelho e remover. Cuidadosamente separar as duas metades do aparelho de sublimação e retirar o slide a partir do topo do objeto de vidro interior. Examina a corrediça para confirmar a distribuição uniforme da matriz. NOTA: Se a matriz é desigual, a matriz em pó na parte inferior da sublimador pode ser reposicionada ou sublimador o aparelho pode ser reposicionada na areia para o slide seguinte. O processo de sublimação pode ser repetido várias vezes utilizando a mesma matriz, no entanto, a matriz acabará por se tornar mais escura por exposição repetida de calor e a quantidade de pó irá diminuir de tal forma que o tempo de sublimação terá de ser ligeiramente ajustados para compensar. Por esta razão, é importante controlar a quantidade de matriz being sublimou após cada experimento para assegurar a coerência na deposição de matriz entre os slides </li><li> Se a distribuição e quantidade de matriz sublimada é suficiente, grave um novo slide com o tecido para o interior da Secção sublimador e repita 3. NOTA: Para o controlo de qualidade (QC) fins, a quantidade de matriz sublimado pode ser medida após cada experiência por pesagem do diapositivo antes e após sublimação e dividindo o peso da matriz sublimada com a área de superfície da lâmina 2, deve notar-se que devido à falta de precisão da maioria das escalas além de 4 pontos decimais e variabilidade entre escalas, estas medidas devem ser ser usado apenas um guia para a deposição de matriz ideal em oposição a um meio totalmente quantificáveis de QC a menos que uma balança de alta precisão é usado (veja a Figura 3). </li></ol> 4. Tissue Armazenamento / Reidratação <ol><li> Depois de sublimação, loja desliza em um recipiente fechado ou pequena cassette em saco plástico selado. </li><li> Incubar as lâminas em freezer -20 ° C durante 2 h ou durante a noite. NOTA: O objectivo do processo de congelação é de actuar como um passo de re-hidratação para a dessorção de materiais de tecido no interior da matriz. O processo de congelamento também tem sido demonstrado para prevenir a degradação de sinais de lípidos durante até 1 semana, quando armazenados a -80 ° C 12. Por esta razão, a quantidade de tempo que as amostras são armazenadas em congelador pode ser variado em certa medida de acordo com as necessidades do experimentador, sem alterar de forma significativa a detecção de sinal (como observado no nosso laboratório). No entanto, temos notado alguma descoloração da matriz quando as amostras são congeladas por mais de 24 h a -20 ° C. Assim, recomendamos a imagiologia do tecido sublimado antes que o tempo ou o armazenamento de tecido a -80 ° C durante períodos de incubação mais longos. </li><li> Retirar as lâminas do congelador (e recipiente) e coloque em um secador durante 5 - 10 min. </li></ol> 5. Imaging and Análise <ol><li> Remover as lâminas da exsicador e aplicar normas de instrumentos para garantir a precisão massa de instrumento MALDI durante o exame. O tipo de padrões irá variar em função da instrumentação. Os padrões são geralmente aplicadas uniformemente ao longo de toda corrediça, em torno de tecido a ser visualizado (Figura 3D). </li><li> Inserir slide em instrumento MALDI e siga as instruções do fabricante para experimentos com imagens (métodos instrumento deve ser otimizado para um 1000 - faixa de massa 2,000). Resultado representativo (Figura 4) foi obtido em modo de reflectrão negativo com uma quadrícula de 70 uM e 20 disparos / espectro (aquisição em tempo ~ 2 h). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Este trabalho detalha um protocolo padronizado de sublimação matriz em tecidos para a detecção de lípidos carregados negativamente, tais como gangliósidos, em experimentos MALDI IMS. A preparação da amostra para MALDI IMS é altamente variável e deve ser personalizado para atender as propriedades únicas do analito de interesse. A aplicação da matriz sobre a superfície da amostra de tecido é um aspecto essencial do processo de preparação da amostra que diz respeito à qualidade dos resultados em IMS. Um c...

laser assistida por matriz de Dessorção / ionização (MALDI) Imagiologia espectrometria de massa (IMS) está a tornar-se uma técnica muito procurado para a visualização da distribuição espacial dos lípidos, péptidos e proteínas através de superfícies intactas de amostra. MALDI IMS foi anteriormente conhecido como uma técnica analítica para analitos pré-purificado, mas em anos recentes, tem-se chamar a atenção em muitas outras disciplinas por causa da capacidade de combinar a precisão de espectrometria de massa com pontos de referência de alta resolução visuais / anatómicas sem a precisa para qualquer rotulagem externo. Como a associação científica dos investigadores que utilizam esta técnica continua a crescer, há um aumento da necessidade de protocolos, fácil de seguir normalizados para auxiliar no desenvolvimento e optimização das experiências IMS. Os gangliósidos, um grupo de lípidos da membrana altamente abundantes no sistema nervoso central, são ideais para experiências MALDI IMS como a sua localização, incorporado no interior da membrana, faz certa especificidadees impossível detectar utilizando Imuno-rotulagem convencional. Adicionalmente, temos mostrado, utilizando MALDI IMS, de que estes lípidos, que funcionam como moduladores da sinalização celular, entre outras coisas, têm perfis de distribuição anatómica original no cérebro de roedores saudáveis que são modificadas após a lesão cerebral 3, 4, 5. Os gangliósidos estão localizados a uma gama de massa mais elevada em comparação com a maioria das espécies de lípidos, e são, assim, mais adequado para a plataforma de imagem MALDI. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> Figura 1: Fluxo de trabalho de MALDI IMS Experiment. Diagrama do fluxo de trabalho geral de uma experiência MALDI IMS usando sublimação. Tecido congelado a -80 ° C é seccionado num criostato e 10 uM secções são montadas em lâminas de degelo ITO condutoras. A lâmina é então colocado num excicador até sublimação. Slides são inseridas no aparelho de sublimação e mesmo uma camada de matriz é aplicada à superfície da amostra de tecido. As amostras são congeladas durante a noite num congelador a -20 ° C e depois colocada num excicador durante 10 minutos. Uma vez que tenham sido aplicados os padrões, as amostras são inseridas no instrumento MALDI onde um laser é dirigido através do tecido, causando moléculas dessorvidas na matriz para ionizar. Os íons de viajar para baixo um tubo de vôo e separada com base em sua massa (time-of-flight / TOF) até chegar ao detector. A informação sobre a abundância iónica de analitos num (m / z) gama predeterminada de massa-carga é apresentada como uma imagem de ambos molecular e espectro de massa. Estes dados podem ser utilizados para visualizar e quantificar tanto a abundância iónica do analito de interesse dentro do tecido impressa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Preparação de amostrapara MALDI IMS é altamente variável à medida que cada etapa do processo deve ser personalizado para os analitos de interesse. A característica definidora de experiências baseadas em MALDI é o uso de um revestimento de matriz depositada sobre a superfície da amostra antes da análise. Em adição à função de absorver e transferir energia de radiação do laser durante o processo de ablação, a matriz também serve para isolar vários analitos a partir da amostra, facilitando assim a análise de compostos de interesse 6, 7. aplicação homogénea da matriz para a superfície da amostra é a etapa mais importante no processo de preparação de amostras. Deposição de matriz inadequada pode levar a grandes formações heterogêneas cristal matriz e o desenvolvimento de artefatos, sinal de iões de baixa e pouca reprodutibilidade 7. Devido à afinidade de certas matrizes para isolar analitos específicos, do tipo de matriz seleccionado de um experimento podealterar significativamente o resultado. As matrizes utilizadas para geração de imagens de proteínas e péptidos são muitas vezes diferentes das utilizadas para a lípidos de imagem e o processo é ainda mais complicado pela necessidade de procedimentos adicionais, tais como passos de lavagem e re-hidratação, a fim de detectar sinais com sucesso a partir de tecido. Embora existam etapas de lavagem para o reforço de sinais de lipídios 8, eles não são um pré-requisito para a detecção da maioria das espécies de lipídios. Ao seleccionar uma matriz para uma experiência de imagem de lípidos, é importante ter em conta a polaridade do lípido de interesse como isso vai limitar a gama de matrizes adequadas. Por exemplo, gangliósidos contêm resíduos de ácido siálico, que lhes dão uma polaridade negativa global. Há um certo número de matrizes que podem eficazmente de s sorver e ionizar gangliósidos de tecido; No entanto, factores tais como picos de matriz derivada do espectro e estabilidade da matriz sob vácuo deve ser levado em consideração. 1,5-diaminonapthalene (DUma matriz) é suficientemente estável sob condições de vácuo instrumento para a maioria das aplicações de imagem e demonstrou um elevado grau de sensibilidade para a dessorção lipídica e pode ser utilizado para a análise de lípidos em ambos os modos de iões positivos e negativos 2. matriz DAN, quando comparada com outras matrizes de afinidade lipídica negativa, tais como o ácido di-hidroxibenzóico (DHB), 9-aminoacridina (9-AA), e 5-cloro-2-mercaptobenzotiazole (CMBT), foi capaz de dessorver mais eficientemente gangliosidos de cérebro de rato tecido no modo de iões negativos (manuscrito em preparação). Selecionando o método adequado para a deposição de matriz é de igual importância para a seleção da própria matriz. métodos de deposição de matriz molhado em que a matriz sólida é dissolvido num solvente orgânico, e depositadas por pneumático ou pulverizadores ou observadores automatizadas, são particularmente eficazes para a dessorção de proteínas e péptidos como o líquido penetra a amostra para permitir adicionalcção de compostos e de co-cristalização com a matriz. Embora estas técnicas também podem ser usados para aplicações de lipídios, deslocalização de analitos e formações de cristal da matriz irregular são ocorrências comuns devido à grande abundância e solubilidade de lipídios na solventes, particularmente no tecido 2, 9. Porque os lípidos são prontamente ionizadas a partir de tecidos, técnicas de deposição de matriz seco, tal como a sublimação, oferecem uma alternativa de custo simples, eficaz para pulverizadores, contornando muitos dos desvantagem destas técnicas. O sucesso da sublimação em experiências MALDI IMS é atribuído a funções tais como a morfologia da matriz microcristalina que aumenta a área de superfície para a matriz de ligação para a substância analisável, o aumento da pureza da matriz, e deposição de matriz homogénea que conduzem ao aumento da reprodutibilidade da matriz em comparação com as técnicas sanitária 1, 10. invo sublimaçãoLves aquecimento de uma matriz em pó sob vácuo imediatamente abaixo de uma superfície de uma amostra arrefecida resultante em sólido de transição de fase gasosa da matriz em pó seguido de deposição sobre a superfície da amostra de tecido. Durante a sublimação, a deposição de matriz pode ser controlada por factores variáveis, tais como tempo, temperatura e pressão para proporcionar resultados altamente reprodutíveis. Uma experiência única sublimação pode levar de 5 a 20 minutos, dependendo do tipo de matriz seleccionado, o qual pode ser re-utilizada várias vezes antes da sua eliminação. O aparelho pode ser adquirido comercialmente a uma fracção do preço de pulverizadores automáticos e é facilmente desmontado para limpeza e manutenção. O baixo custo e relativa simplicidade dessa técnica deposição de matriz tornam ideal para pesquisadores iniciantes ou expandindo aplicações de imagem lipídico em MALDI IMS. Embora a informação detalhando protocolos para a sublimação dos tecidos para IMS foram relatados 11, alguns protocolos padronizados existem which focar o fluxo de trabalho básico envolvido com a realização de um experimento de sublimação para imagiologia lipídios de alta massa no modo de iões negativos, o que torna difícil estabelecer a técnica sem extensa tentativa e erro. O que se segue é um protocolo experimental com o objetivo de preencher essa lacuna para a sublimação da matriz DAN em secções de cérebro de rato para imagens de alta resolução e detecção de gangliosídeos. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> Figura 2: A sublimação Aparelho. A fotografia (A) e diagrama esquemático (B) do aparelho de sublimação. A bomba de vácuo ligada a um tubo de borracha para uma armadilha fria cheio com 300 ml de etanol. A câmara de frio é então ligado por tubos de borracha para o aparelho de sublimação. O aparelho é constituído por duas peças separadas de material de vidro que são seladas juntamente com um metal de L-articular. A metade superior da sublimadorcontém o condensador que é enchido com lama de gelo. A placa de amostra é gravado na parte inferior do condensador, no interior do aparelho de vidro selado. A metade inferior do aparelho de sublimação contém a matriz DAN, espalhar-se uniformemente em frente da placa de amostra. Durante a sublimação, o aparelho de vidro é colocada sobre um banho de areia aquecida a 140 ° C por uma placa quente directamente por baixo dele. A sonda de temperatura ajuda a manter uma temperatura estável durante todo o experimento sublimação através de realimentação da temperatura do banho de areia em comparação com a temperatura predefinida para o experimento. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sublimator</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG3038-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5- Diaminonapthalene (DAN) matrix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D21200&#160;</td>
			<td>100 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CryoStar NX50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate with temperature feedback</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>HP88857290</td>
			<td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100-120v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Jack</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>2216479</td>
			<td>10x10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Trap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom built on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Franklin Electric</td>
			<td>1102180403</td>
			<td>Savant VP100 Two Stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium-tin-oxide (ITO) Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI 1111000</td>
			<td>type II, 1.1mm/25 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI TOF/TOF 5800 Instrument</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2797</td>
			<td>tabletop desiccator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sublimation of dan matrix for the detection and visualization of gangliosides in rat brain tissue for maldi imaging mass spectrometry

A preparação da amostra é a chave para a detecção e a visualização de analitos em experiências com laser assistida por matriz de Dessorção / ionização (MALDI) Imagiologia espectrometria de massa (IMS) óptima. Determinação do protocolo apropriado para seguir em todo o processo de preparação da amostra pode ser difícil já que cada passo tem de ser optimizado para satisfazer as características únicas dos analitos de interesse. Este processo envolve não só em encontrar uma matriz compatível que pode desorver e ionizam as moléculas de interesse de forma eficiente, mas também seleccionar a técnica de deposição de matriz apropriada. Por exemplo, uma técnica de deposição húmida da matriz, o que implica a dissolução de uma matriz no solvente, é superior para a dessorção da maior parte das proteínas e péptidos, enquanto que as técnicas de deposição de matriz secas são particularmente eficazes para a ionização de lípidos. A sublimação foi classificado como um método altamente eficiente de deposição da matriz seco para a detecção de lípidos no tecido por MALDI IMS devido à homogeneity de deposição de cristais de matriz e mínima deslocalização analito, em comparação com muitos métodos de deposição molhadas 1, 2. Em termos gerais, que envolve colocar uma amostra em pó e a matriz em uma câmara de vácuo com as amostras pressionada contra uma superfície fria. O aparelho é então reduzido para um banho aquecido (areia ou óleo), resultando em sublimação da matriz em pó sobre a superfície da amostra de tecido arrefecida. Descrevemos aqui um protocolo de sublimação utilizando 1,5-diaminonaftaleno matriz (DAN) para a detecção e a visualização de gangliósidos no cérebro de rato utilizando MALDI IMS.

Após a conclusão da experiência sublimação, as duas metades do aparelho de vidro estão separadas no exaustor de fumos e a corrediça, gravado para o condensador, pode ser removida (Figura 3A). Neste ponto, a lâmina deve ser examinada para a distribuição desigual de matriz e o tempo, a temperatura, ou a colocação do aparelho em banho de areia pode ter que ser ajustada para o slide seguinte. Um experimento sublimação DAN bem sucedido resultará num revestiment...

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Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Sublimação da DAN Matrix para a Detecção e Visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por MALDI imagem Espectrometria de Massa

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

sublimation-dan-matrix-for-detection-visualization-gangliosides-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K visualizações.  The University of Western Ontario. A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Vídeo: Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Neurociência

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Cirurgia estereotáxica para lesão excitotóxica de áreas específicas do cérebro do rato adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Implantação de fibra óptica para Estimulação Crônica optogenética do Tecido Cerebral

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

A dupla Tracer PET-MRI Protocolo para a medida quantitativa da Regional cérebro substratos energéticos Captação no Rato

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Parênquima não-invasivo, Vascular e Metabólica alta freqüência ultra-som e Fotoacústica Rat Cerebral Profunda Imagem

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

Visualização dos depósitos β amiloide no cérebro humano com Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de imagem espectrometria de massa

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Adsorção molecular induzida por luz de proteínas usando o sistema PRIMO para Micropadronização para estudar as respostas celulares às proteínas da matriz extracelular

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

Rotulagem e imagem de placas amilóides no tecido cerebral usando a curcumina polifenóis naturais

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...