Este trabalho foi em parte apoiada por doações da Agence Nationale pour la Recherche, programa PIRIbio Dynabiofilm e do CNRS programa Risco Interdisciplinar. Agradecemos Philippe Thomen por sua leitura crítica do manuscrito e Christophe Beloin por fornecer a E. coli cepa utilizada neste trabalho.

1. Cultura das bactérias e preparação de suspensão <ol><li> Escolha de uma colónia recentemente crescido a partir de uma placa de ágar Lisogenia Broth (LB), inocula-o em 5 mL de meio líquido LB contendo 100 μ g / ml de ampicilina e 7,5 μ g / ml de tetraciclina e incube-para de 5 a 6 horas a 37 ° C em uma plataforma de agitação. </li><li> Em seguida, adiciona-se 100 μ l de cultura bacteriana, em 5 ml de meio mínimo (M63B1) suplementado com 0,4% de glucose e as mesmas concentrações de antibiótico. Incubar durante a noite desta cultura recém diluído a 37 ° C em uma plataforma de agitação. </li><li> Após 16 horas de incubação, adiciona-se 100 ul da cultura durante a noite a 5 ml M63B1, 0,4% de glucose. Manter o tubo a 37 ° C para a plataforma de agitação até uma OD de 0,5 seja alcançado. A suspensão é em seguida, pronto para a injecção para dentro do canal experiência para a formação de biofilme. </li></ol> 2. Preparação de Partículas Magnéticas <ol><li> Tome 10 partículas magnéticas ul -2,8 μ m de diâmetro, - a partir do estoque e lavá-los 3x em 190 ul de meio mínimo, com o auxílio de um suporte de amostras magnético. </li><li> Ajustar a concentração de partículas de 5 x 10 6 / ml grânulos. Tipicamente, 50 uL da solução do grânulo lavado é misturado com um outro 950 μ l de M63B1 com 0,4% de glucose. </li></ol> 3. Canal Preparação e crescimento do biofilme <ol><li> Montagem Canal <ol><li> Corte dois quadrados (800 μ m de comprimento lado) capilares de vidro borosilicato 10 cm de comprimento para obter peças de dois 8 cm de comprimento. </li><li> Cole as duas partes capilares em duas lâminas de vidro - cortado pela metade primeiro - 2 cm de distância de 1 cm de saliência em cada extremidade, como na Figura 1, usando uma cola de cianoacrilato de ação rápida (os chamados super-cola). </li><li> Autoclave toda a configuração ea tubulação necessária exigida para posterior conexão de canal. </li><li> Reúna todos os materiais estéreis sobuma capela de fluxo laminar: i) o canal e prender um montado, ii) a tubulação e os conectores, iii) as duas armadilhas bolha - o filtro bolha comumente usados ​​para proteger as crianças que se alimentam de gotejamento (armadilha 1) ea bolha armadilha caseira como um tubo de 4 cm de comprimento de diâmetro maior (armadilha 2), iv) braçadeiras, v) 30 ml seringas cheias de M63B1, 0,4% de glicose, e vi) o frasco de resíduos. </li><li> Conecte toda a configuração com conectores Luer Lock ou junções na seguinte ordem: 50 ml M63B1 seringa controlada pela bomba de seringa, filtro bolha pediátrica, caseiro borbulhador, capilar (Figura 1, painel B), e do tubo para o frasco de resíduos. Em seguida, preencha a configuração com M63B1 estéril, 0,4% de glicose, de ligar a bomba de seringa a uma taxa de cerca de 10 ml / h, superior às taxas experimentais. Monitorar cuidadosamente e eliminar todas as bolhas no circuito. </li><li> Fluxo o meio através do sistema por 10-15 min; concorrentemente misturar 1 ml da suspensão de bactérias em OD 0.5 da Seção1.3 com 1 ml da solução de talão lavado preparado na Seção 2.2. </li><li> Anexar (mas não feche) braçadeiras para a tubulação em duas posições: antes e depois dos capilares. Mudar o fluxo fora. </li><li> Introduzir a mistura de bactérias talão no capilar após a casa feita bolha armadilha usando uma seringa de 1 ml, tendo o cuidado de segurar o tubo de extremidades para evitar a entrada de ar. Re-conectar o tubo e feche os grampos. </li><li> Repita o mesmo procedimento para o segundo capilar e verificar todos os tubos para bolhas. </li><li> Transferir o aparelho para o microscópio e deixar em repouso durante 15-20 minutos para permitir que as bactérias que se contentar e aderem à superfície do capilar. Instale o capilar para o palco microscópio com o recipiente de resíduos a um nível ligeiramente superior. Coloque a bomba de seringa em cima do balcão ao lado do microscópio. Elevar a retenção de bolhas antes da capilar ligeiramente mais elevada do que o plano capilar para capturar bolhas. </li></ol></li><li> Biofilme Growth <ol><li> Ajuste a velocidade de fluxo da bomba de seringa e iniciar o fluxo, o biofilme se agora desenvolver na superfície do capilar durante o período necessário - geralmente 24 ou 48 horas nestas experiências. </li><li> Concentre-se no plano inferior capilar e iniciar a gravação de lapso de tempo as imagens da amostra - geralmente uma freqüência de aquisição de 2 imagens / min irá relatar adequadamente o crescimento do biofilme. Este biofilme crescimento pós-controle de monitores de vídeo (ver extratos em Vídeos 1, 2 e 3). </li></ol></li></ol> 4. Pinças magnéticas Instalação <ol><li> Parafuso as pinças magnéticos em micromanipuladores XYZ controlado manualmente e parafuso micromanipuladores na platina do microscópio para ajustar a posição das pinças relativamente ao capilar. Coloque a pinça como na Figura 2 para assegurar o gradiente de campo magnético apropriado é gerado na zona de observação. </li><li> Ligue as pinças tO gerador de função através de um amplificador de potência para gerar um período de 40 segundos de tempo de 24 s fez sinal zero e 16 seg de 4 uma corrente directa com um gatilho enviada para o campo de luz brilhante do obturador depois de 20 segundos para a sincronização de sinal proporcionando uma sequência de eventos como na Figura 3. Nota: Estas duas operações pode ser conseguida em qualquer altura entre a instalação do capilar e medição de início. Ver experimentar esboço visão geral na Figura 4. </li></ol> 5. Creep Curve Aquisição <ol><li> Usar o controle do movimento xy de platina do microscópio para trazer a aresta do pólo magnético do lado esquerdo e do bordo do lado esquerdo do capilar no mesmo campo de observação. Leve a origem do referencial de análise na intersecção de x e y-eixos definidos pela aresta do capilar e a aresta da peça polar, respectivamente (ver Figura 2). </li><li> Ajusta a posição vertical do capilar usando fina foco cbotão ontrol da posição microscópio. Tipicamente, o primeiro plano examinados situa-se entre 4 a 7 μ m acima do fundo do capilar. Vídeo 1 corresponde ao campo xy que tem o seu canto superior esquerdo na origem do referencial espacial. </li><li> Desencadear a sequência de 40 seg dos eventos descritos na secção 4.2 e a Figura 3, ao ligar o gerador de corrente e ao mesmo tempo, desencadear manualmente a sequência de aquisição de imagens de vídeo 1. </li><li> Mover o capilar para o campo direito vizinho por uma μ m de tradução 250 da platina do microscópio para a esquerda e utilizar, como na secção 5.3 para gerar video 2 de fatia de 2 e de modo a obter os vídeos necessários. Normalmente 3 a 4 campos de 250 x 250 μ m 2 são coletados ao longo do eixo-x antes de mudar o plano e repetir mesmas operações para o novo avião. </li></ol> Calibração Força 6. <ol><li> Prepare uma solução de glicerol pela mistura de 39,8 g de glicerol com 190 μ l de água bi-destilada e 10 ml de partículas magnéticas em um 2 x 10 9 partículas / ml e encher um canal experimental com esta mistura e coloque-o no palco microscópio como descrito para a amostra de biopelícula. </li><li> Depois de instalar as pinças magnéticas, como indicado no capítulo 4, aplicar a força magnética, como indicado na seção 5.4 e fazer imagens de lapso de tempo para extrair cada velocidade única partícula (v) ea sua posição no capilar para obter o arquivo de calibragem. Este ficheiro deve conter a força aplicada como uma função da sua posição na zona de análise do capilar de acordo com a lei de Stokes, F = 6πRηv (R: raio da partícula). </li></ol> 7. Análise <ol><li> Use um software de &quot;partícula rastreador&quot; para obter arquivos de texto com as posições das partículas em cada quadro para todas as pilhas de imagens adquiridas, como indicado na seção 5. Using a imagem de frequência de aquisição pilha, calcular o deslocamento das partículas em função do tempo (por exemplo, Figura 5 e vídeo 4). </li><li> Utilizando o ficheiro de calibração de força, converter as curvas de deslocamento para as curvas de conformidade (compliance total do material - J (t) - como uma função do tempo) de acordo com a fórmula de conformidade: <img alt="" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq1.jpg" width="106" /> o que dá a relação entre a deformação do material e tensão aplicada por uma sonda de partícula de raio R embutido, um meio viscoelástico homogéneo incompressível tal como anteriormente estabelecido por Schnurr e colegas de trabalho 19. </li><li> Ajuste as curvas de conformidade com o modelo de fluência Burgers geral para materiais viscoelásticos e derivar os parâmetros viscoelásticos, J 0, J 1, η 0, η 1 para cada partícula ( <strong&gt; Figura 6) de acordo com a fórmula Burgers: <img alt="" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/50857/50857eq2.jpg" width="169" /> Nota: Esta análise fenomenológico foi anteriormente empregue para uma grande variedade de materiais, incluindo materiais biológicos, tais como biofilme para interpretar os dados de reologia macroscópicas 20-22. </li></ol>

<ol>
	<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases.">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).</li><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Battling+biofilms.">Battling biofilms.</a> Scientific American. 285, 74-81 (2001).</li><li>Branda, S. 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J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+fluid+description+of+bacterial+biofilm+material+properties.">Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties.</a> Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).</li><li>Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniaxial+compression+measurement+device+for+investigation+of+the+mechanical+stability+of+biofilms.">Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms.</a> Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).</li><li>Cense, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+and+failure+of+Streptococcus+mutans+biofilms,+studied+using+a+microindentation+device.">Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device.</a> Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).</li><li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms.">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Physical Review Letters. 93, (2004).</li><li>Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+properties+of+a+mixed+culture+biofilm+from+rheometer+creep+analysis.">Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis.</a> Biofouling. 19, 279-285 (2003).</li><li>Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantitation+of+bacterial+biofilm+adhesion+and+viscoelasticity+by+microbead+force+spectroscopy.">Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).</li><li>Poppele, E. H., Hozalski, R. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Microscopic+Viscoelasticity+in+Flexible+and+Semiflexible+Polymer+Networks+from+Thermal+Fluctuations.">Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations.</a> Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).</li><li>Aggarwal, S., Hozalski, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Strain+Rate+on+the+Mechanical+Properties+of+Staphylococcus+epidermidis+Biofilms.">Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms.</a> Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).</li><li>Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+fluid-biofilm+interaction+using+a+Burger+material+law.">A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).</li><li>Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+antimicrobial+treatments+change+the+viscoelastic+properties+of+bacterial+biofilms.">Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms.</a> Biofouling. 27, 207-215 (2011).</li><li>Apgar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-particle+tracking+measurements+of+heterogeneities+in+solutions+of+actin+filaments+and+actin+bundles.">Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles.</a> Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Esta partícula magnética semeadura e puxando experimento permitiu in situ mapeamento 3D dos parâmetros viscoelásticos de um biofilme crescendo em seu estado original. Esta abordagem revelou heterogeneidade mecânica da E. coli biofilme cultivadas aqui e deu pistas para apontar os componentes do biofilme que suportam as propriedades físicas de biofilme, o que sugere fortemente uma implicação fundamental da matriz extracelular e mais precisamente o seu grau de cross-linking. <p class="jove_con...

Biofilme bacteriano são comunidades de bactérias associadas com superfícies biológicas ou artificiais 1-3. Eles formam por um mecanismo de adesão-crescimento juntamente com a produção de matriz extracelular rica em polissacárido que protege e estabiliza o edifício 4,5. Estes biofilmes não são assemblages simplesmente passivos de células aderidas a superfícies, mas organizado e sistemas biológicos complexos dinâmicos. Quando bactérias mudar de planctônicas de biofilme estilo de vida, as alterações na expressão de genes e fisiologia celular estão observada, bem como um aumento da resistência aos antibióticos e as defesas do hospedeiro imunes estando na origem de muitas infecções persistentes e crónicas 6. No entanto, o desenvolvimento controlada dessas estruturas vivas também oferecem oportunidades para aplicações industriais e ambientais, como a biorremediação de depósitos de resíduos perigosos, bio-filtração de água industrial ou formação de bio-barreiras para proteger o solo e as águas subterrâneas de contaminção. Embora as características moleculares específicos para forma de biofilme de vida estão cada vez mais descrito, os mecanismos que impulsionam o desenvolvimento da comunidade e persistência permanecem obscuros. Usando os recentes avanços nas medidas microescala usando eletroquímica de varredura ou microscopia de fluorescência, essas organizações vivas têm sido mostrados para apresentar considerável estrutural, química e biológica heterogeneidade 7. No entanto, até agora, a mecânica do biofilme foram principalmente examinados macroscopicamente. Por exemplo, a observação de flâmulas biofilme deformação devido a variações nas taxas de fluxo de fluido 8,9, compressão uniaxial de peças de biofilme levantar de ágar ou cultivadas em cobertura desliza 10,11, cisalhamento de biofilme coletado do ambiente e, em seguida, transferido para um paralelo placa reômetro 12,13, espectroscopia de força atômica usando uma conta de vidro e revestido com um biofilme bacteriano ligado a um cantilever AFM 14 ou um micr dedicadoocantilever método para medir a resistência à tracção de fragmentos de biofilme destacadas 15,16 foram aplicadas durante os últimos dez anos, fornecendo informação útil sobre a natureza viscoelástica do material 17. No entanto, parece provável que a informação sobre as propriedades mecânicas de biofilme in situ é perdida quando o material é removido do seu ambiente nativo, que era muitas vezes o caso em tais abordagens. Além disso, o tratamento do biofilme como um material homogéneo, falha a informação sobre a possível heterogeneidade das propriedades físicas dentro da comunidade. Portanto, as implicações exatas da mecânica da estrutura na formação de biofilme e traços biológicos, como a expressão do gene padrões ou gradientes químicos dificilmente pode ser reconhecido. Para avançar no sentido de uma descrição microescala das propriedades físicas do biofilme, as novas ferramentas dedicadas são obrigatórios. Este documento detalha uma abordagem original concebido para alcançarmedição dos parâmetros mecânicos locais in situ, sem perturbar o biofilme e permitindo que o desenho da distribuição espacial das propriedades dos materiais em microescala e, em seguida, a heterogeneidade mecânica. O princípio do ensaio baseia-se na dopagem de um biofilme cresce com micropartículas magnéticas, seguida da sua carga remota usando uma pinça magnéticos no biofilme maduro. Deslocamento de partículas sob controlado aplicação de força magnética fotografada ao microscópio permite derivação parâmetro viscoelástico local, cada partícula relatando seu próprio ambiente local. A partir destes dados, o perfil mecânico 3D do biofilme pode ser desenhada, revelando dependências condições espaciais e ambientais. Todo o experimento será mostrado aqui em um E. biofilme coli feito por uma cepa geneticamente modificado carregando um plasmídeo F-like desreprimidas. Os resultados detalhados em um artigo recente 18 fornecer uma visão única do interior da mecânica do biofilme intactas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1258">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 1: Reagents and cells</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="20" rowspan="2" style="height:22px;width:216px;">Magnetic particles</td>
			<td rowspan="2" style="width:323px;">Life technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:224px;">14307D</td>
			<td colspan="2" rowspan="2" style="width:496px;">Micrometric magnetic particle, 2.8 &#181;m diameter</td>
		</tr>
		<tr height="2">
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Ampicillin (Antibiotic)</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">A9518</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetracycline (Antibiotic)</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">87128</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacterial strain MG1655gfpF</td>
			<td style="width:323px;">UGB, Institut Pasteur, France</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 2:&#160; Capillaries and tubing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Filters for pediatric perfusion</td>
			<td style="width:323px;">Prodimed-Plastimed</td>
			<td style="width:224px;">6932002</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hollow Square Capillaries</td>
			<td style="width:323px;">Composite Metal Scientific</td>
			<td style="width:224px;">8280-100</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8mm x0.8mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing silicone peroxyde</td>
			<td style="width:323px;">VWR international</td>
			<td style="width:224px;">228-0512</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Diameter 1mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tubing silicone peroxyde</td>
			<td style="width:323px;">VWR international</td>
			<td style="width:224px;">228-0700</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Diameter 3mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Table 3: Biofilm growth</td>
			<td style="width:323px;"></td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td style="width:495px;"></td>
			<td style="width:1px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysogeny Broth (LB) solution</td>
			<td style="width:323px;">Amresco-VWR</td>
			<td style="width:224px;">J106-10PK</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">standard medium used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">M63B1 solution</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Standard minimum&#160; medium used to grow bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:323px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">G8270</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 4: Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Camera EMCCD&#160;&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:224px;">C9100-02</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Heater controller</td>
			<td style="width:323px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:224px;">300354</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Function generator</td>
			<td style="width:323px;">Agilent technologies</td>
			<td style="width:224px;">33210A</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Power amplifier</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringe pumps</td>
			<td style="width:323px;">Kd Scientific</td>
			<td style="width:224px;">KDS-220</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Shutter</td>
			<td style="width:323px;">Vincent Associates</td>
			<td style="width:224px;">Uniblitz T132</td>
			<td colspan="2" style="width:496px;"></td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:216px;">Magnetic tweezers</td>
			<td style="width:323px;">Home-made</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td colspan="2" style="width:496px;">Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Fig. 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 5: Optics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td style="width:323px;">Nikon</td>
			<td style="width:224px;">TE-300</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>This a long working distance ojective enabling observation of the biofilm in the depth</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20&#160; 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55</td>
			<td style="width:323px;">Chroma</td>
			<td style="width:224px;">1)#49020 2)#31002</td>
			<td>Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="5" height="21" style="height:21px;width:1257px;">Table 6: Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:323px;">NIH - particle tracker plugin</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

remote magnetic actuation of micrometric probes for in situ 3d mapping of bacterial biofilm physical properties

Aderência bacteriana e crescimento em interfaces levar à formação de estruturas tridimensionais heterogéneos chamados biofilmes. As células que habitam estas estruturas são mantidas juntas por interacções físicas mediadas por uma rede de substâncias poliméricas extracelulares. Biofilme bacteriano impactar muitas atividades humanas ea compreensão de suas propriedades é fundamental para um melhor controle do seu desenvolvimento - manutenção ou erradicação - dependendo de seu resultado adverso ou benéfico. Este artigo descreve uma nova metodologia com o objetivo de medir in situ as propriedades físicas locais do biofilme que tinha sido, até agora, examinada apenas a partir de uma perspectiva macroscópica de material e homogênea. A experiência aqui descrita envolve a introdução de partículas magnéticas num biofilme em crescimento sobre as sementes de sondas locais que podem ser comandadas à distância, sem perturbar as propriedades estruturais do biofilme. Pinças magnéticas Dedicados foram desenvolvido para exercer uma força definida em cada partícula incorporada no biofilme. A instalação é montada sobre a plataforma de um microscópio, para permitir a gravação de imagens de lapso de tempo do período de puxar partícula. As trajectórias das partículas são, em seguida, extraiu-se a partir da sequência de puxar e os parâmetros locais viscoelásticas são derivados a partir de cada curva de deslocamento das partículas, proporcionando assim a distribuição 3D-espacial dos parâmetros. Ganhar insights sobre o perfil mecânico do biofilme é essencial do ponto de vista de um engenheiro de vista para fins de controle do biofilme, mas também a partir de uma perspectiva fundamental para esclarecer a relação entre as propriedades arquitetônicas e biologia específico dessas estruturas.

Uma análise típica irá proporcionar a distribuição espacial dos parâmetros viscoelásticos na escala mícron sobre um biofilme viver sem perturbar o seu arranjo original. Os resultados típicos são mostrados na Figura 7, em que os valores de J 0 - o cumprimento elástico - são dadas como uma função do eixo-z ao longo da profundidade e do eixo-y ao longo de uma dimensão lateral do biofilme. Cada ponto corresponde a um cordão que a análise da curva de fluência tem proporcionado um...

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Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

Este documento mostra uma metodologia original baseado na actuação remota de partículas magnéticas semeadas num biofilme bacteriano e o desenvolvimento de uma pinça magnéticos dedicados para medir in situ as propriedades mecânicas locais da matéria viva complexo construído por micro-organismos nas interfaces.

Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas<em&gt; In situ</em&gt; Mapping 3D de bactérias biofilme Propriedades Físicas

Bacterial adhesion and growth on interfaces lead to the formation of three-dimensional heterogeneous structures so-called biofilms. The cells dwelling in ...

remote-magnetic-actuation-micrometric-probes-for-situ-3d-mapping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties

9.1K visualizações.  Sorbonne Universités, UPMC.  Este documento mostra uma metodologia original baseado na actuação remota de partículas magnéticas semeadas num biofilme bacteriano e o desenvolvimento de uma pinça magnéticos dedicados para medir in situ as propriedades mecânicas locais da matéria viva complexo construído por micro-organismos nas interfaces. 

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Bioengenharia

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided endovascular procedures have several significant limitations, including difficult catheter navigation and use of ionizing radiation, which can potentially be overcome using a magnetically steerable catheter under MR guidance.
	The main goal of this work is to develop a microcatheter whose tip can be remotely controlled using the magnetic field of the MR scanner. This protocol aims to describe the procedures for applying current to the microcoil-tipped microcatheter to produce consistent and controllable deflections.
	A microcoil was fabricated using laser lathe lithography onto a polyimide-tipped endovascular catheter. In vitro testing was performed in a waterbath and vessel phantom under the guidance of a 1.5-T MR system using steady-state free precession (SSFP) sequencing. Various amounts of current were applied to the coils of the microcatheter to produce measureable tip deflections and navigate in vascular phantoms.
	The development of this device provides a platform for future testing and opportunity to revolutionize the endovascular interventional MRI environment.

Current applied to an endovascular microcatheter with microcoil tip made by laser lathe lithography can achieve controllable deflections under magnetic resonance (MR) guidance, which may improve speed and efficacy of navigation of vasculature during various endovascular procedures.

Magneticamente Assistida deflexão da ponta Remote Controlled microcateter em Imagem por Ressonância Magnética

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Fabricação de uma funcionalizados Magnetic bacteriana Nanocellulose com óxido de ferro nanopartículas

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

Rápida digitalização ressonância paramagnética eletrônica abre novos caminhos para criação de imagens fisiologicamente parâmetros importantes<em&gt; In Vivo</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Configuração otimizada e protocolo para a imagem latente magnética domínio em Situ histerese medicão

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Análise espacial bidimensional automatizada de sondas FRET de molécula única móvel

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

Methods Article

Atuação Remoto magnética de micrométricas para Sondas