The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.

1. Preparação de material de vidro e Culturas <ol><li> Antes de prosseguir com esta experiência, preparar agar sangue 5% de ovelha (SBA) placas para o cultivo de MRSA. Incubar as placas SBA durante 24 horas à temperatura de 37 ° C. Após este tempo,, colónias individuais bem isoladas deve estar presente para ser utilizado para as inoculações subsequentes em meios líquidos. Loja estrias SBA placas com colónias isoladas a 4 ° C durante 1 - 2 meses. NOTA: placas de agar de sangue de ovelha-se em embalagens contendo pré-fabricados entre 20-25 placas com base no fabricante, e consistem tipicamente numa base de agar de tripticase de soja com adição de 5% w / v de sangue de ovelha. </li><li> Adicione 500 ml de caldo de soja tríptica (TSB) suplementada com 1% de glucose e 0,1% de NaCl. Depois disso, recolher e limpar 2 tubos de ensaio de vidro. Se tampas autoclaváveis ​​não estão disponíveis para tubos de ensaio, use uma folha de alumínio como uma tampa. Autoclave TSB e tubos de ensaio, juntamente com uma caixa de 1 ml pontas de pipeta. </li><li> Debaixo de uma cabine de segurança biológica ou perto de uma Bunsen queimador, pipeta de 5 ml de previamente autoclavada TSB em tubos de ensaio autoclavado. Ter cuidado para garantir que o tempo suficiente tenha sido dada para permitir que o TSB e tubos de ensaio arrefecer até à temperatura ambiente. A partir de uma placa de 5% SBA anteriormente listado, inocular uma única colônia em 6 ml de caldo TSB. Uma vai conter MRSA, e o segundo tubo de ensaio será utilizado como um controlo negativo para assegurar a esterilidade. </li><li> Tome tubos de ensaio TSB inoculados e colocá-los numa incubadora recíproco durante 24 horas a 37 ° C e a 200 rpm. Após este tempo, o crescimento microbiano deve ser aparente no tubo de ensaio, enquanto não houve crescimento de MRSA deve ter ocorrido no tubo de ensaio de controlo. </li><li> Tome 1 ml de cultura de 24 horas e pipeta em 6 ml de TSB fresco. Incubar a 37 ° C durante 6 horas a 200 rpm. </li><li> Pipetar 1 mL de 6 horas de sub-cultura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar durante 3 min a 850 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de H 2 O. desionizada Centrífuga, repito, e suspender novamente. </li></ol><ol><li> Tome aço inoxidável e discos de amostra de AFM ouro (20 mm e 10 mm de diâmetro, respectivamente) e limpar cada um dos lados com 5 ml de H 2 O. desionizada Segurar discos de amostra no lado dominante com uma pinça e usar a mão para subdominant pipeta de 5 ml de cada lado do disco de amostra. Depois de lavar ambos os lados, discos lugar amostra num copo contendo 20 ml de H2O desionizada, seguido por sonicação durante 1 minuto. </li><li> Após utilização de sonicação fórceps para remover os discos da amostra a partir do copo. Coloque os discos de modo que eles se inclinar em um ângulo de 60 ° contra a borda de uma placa de Petri aberta em uma toalha de papel. Utilizar a tampa da placa de Petri para cobrir os discos de secagem. Deixe secar totalmente os discos antes de prosseguir. O tempo de secagem pode variar entre 4-8 horas. </li><li> Depois de seco, use uma pinça para colocar discos de amostra em uma placa de Petri. <ol><li> Opcionalmente, funcionalizar as superfícies dos discos com qualquer material de amostra (por exemplo, colagénio, ácido hialurônico, nano-partículas de prata, etc.). </li><li> Para esta experiência, usar poli-L-lisina para revestir a superfície do substrato. Por poli-L-lisina funcionalização, pipeta 200-400 ul de 0,1% de poli-L-lisina (em H2O) em discos de amostras, e deixou incubar durante 1 hora à temperatura ambiente numa placa de Petri. </li><li> Após 1 h, utilizar uma pinça para segurar o disco de amostra, e lava-se com 1 ml de H 2 O. desionizada Deixar secar em toalhas de papel, como descrito no passo 2.2. </li></ol></li><li> Tome 2x células re-suspenso lavados e placa 200-400 mL em discos de amostra dentro de uma cabine de segurança biológica. Se os discos de amostras são revestidas com poli-L-lisina, incubar durante 0,5 horas à temperatura ambiente. </li><li> Após incubação das células em discos de amostra, lavar discos amostra suavemente com 1 ml de H 2 O. desionizada Vamos discos secar durante a noite antes de imagem. </li></ol> 3. KPFM Imagem NOTA: Para esta experiência,usar um Agilent série 5500 ILM-AFM. <ol><li> Para iniciar AFM, ligue unidade de computador, juntamente com HEB e MAC III controlador da AFM. Abra o software de imagens AFM (por exemplo, da Agilent PicoView). Certifique-se de selecionar inicialmente ACAFM ou qualquer designação correta é no AFM para geração de imagens em modo intermitente-contact. </li><li> Utilizando uma pinça AFM na mão dominante, e segurando o titular clipe de mola aberta com a mão subdominant, coloque um cantilever KPFM para a cabeça-peça. Tenha cuidado ao manusear e transferindo a peça de cabeça AFM para o AFM que esta unidade (pelo menos no 5500 ILM-AFM) contém a unidade de cristal piezo frágil que controla X, Y, Z e direcionalidades digitalização. NOTA: As consolas KPFM utilizados neste caso foram Mikromasch condutora DPE (baixo ruído) cantilevers com frequências de ressonância média de 80 kHz e primavera constantes de 2,7 N / m. Cantilevers com estas frequências de ressonância e constantes de mola foram escolhidos devido a sua facilidade de uso.Cantilevers com maiores constantes de mola mais elevadas frequências de ressonância e também pode ser usado para imagiologia. </li><li> Arrumar com cuidado cabeça peça na AFM e ligar os fios apropriados (neste caso dois fios precisa ser conectado em: Laser e estágio motor de elevação). </li><li> Alinhar o laser para a ponta do braço de suporte. Algumas unidades contêm uma funcionalidade que permite a câmara de alinhamento mais fácil. Se a funcionalidade da câmera não está presente no AFM, alinhar na ponta cantilever conforme descrito a seguir: <ol><li> Gire o botão no sentido horário front-to-back para mover o laser overtop o chip cantilever. Quando o laser atinge o chip será bloqueado e não será mais visível. Apenas gire o botão algumas vezes. </li><li> Gire o botão front-to-back sentido anti-horário até o ponto de laser reaparece. O laser é agora na borda do chip. </li><li> Gire o botão da esquerda para a direita para posicionar o laser no cantilever. Como o laser passa sobre o cantilever ele vai desaparecer e reaparecer in rápida sucessão. O ponto de laser deve ser visível na tampa de vidro fosco onde a unidade fotodiodo mais tarde irá se sentar. </li><li> Rode o botão de front-to-back para a esquerda para mover o local para baixo o cantilever para a ponta até o local no vidro fosco desaparece. </li><li> Vire o-to-back frente botão no sentido horário apenas ligeiramente, a fim de posicionar o laser de modo que ele só se senta na ponta cantilever. O ponto de laser irá reaparecer no vidro fosco. NOTA: Este é o método de posicionamento a laser para consolas trampolim. Para cantilevers triangulares, o processo de alinhamento é um pouco diferente. </li></ol></li><li> Uma vez que o laser está alinhado, manter o motor na fase de elevação na posição &quot;aberto&quot; durante 10 segundos para assegurar espaço suficiente entre o braço de suporte e fixação da amostra quando a amostra para a AFM. </li><li> Colocar a amostra no palco amostra KPFM. Aterrar a amostra usando um fio de cobre. Ligue os fios apropriados da AFM para o estágio da amostra. Ligue os sTage ao AFM. Na maioria dos casos, a fase é mantida no lugar através de magnetos. </li><li> No software AFM, ajustar o braço de suporte e, em seguida, iniciar abordagem da ponta cantilever para a amostra. Certifique-se de que o tempo de estabilização é fixado em não mais do que 10 ms, e que a velocidade de aproximação não exceder 2,0 mm / s, a fim de evitar danos na ponta. </li><li> Uma vez que a ponta cantilever é na superfície da amostra, selecione um tamanho da janela de imagem e área de imagem ideal. Otimizar ganhos I e P, juntamente com o set point cantilever assim que a imagem topográfica é otimizado. <ol><li> Depois de imagem topográfica é otimizado, ligue módulo KPFM (tanto no modo AM FM ou, aqui, use o modo FM). Deve notar-se que KPFM imagem é muito desafiante fora da janela de imagem 5 mm x 5 mm. Além disso, para a imagem latente KPFM ideal, use uma resolução de 512 x 512 com velocidades lentas de digitalização (0,02-0,05 linhas / seg). </li></ol></li><li> Para definições FM-KPFM (não ACAFM configurações), defina o percentual de carro entre 5-10%. Defina a fr cantileverequency entre 1 - 5 kHz, com uma largura de banda de 2 kHz. Definir I e ganhos P para as definições FM-KPFM a 0,3%. <ol><li> Varie a largura de banda do sinal e eu e os ganhos de P entre as superfícies de amostras. Para otimizar SP imagem, ajustar ainda mais a largura de banda do sinal e eu e os ganhos P obter imagens mais favoráveis. O intervalo recomendado de ganhos I e P são 0,22-0,35%. </li></ol></li><li> Processar e analisar as imagens coletadas KPFM usando software de processamento de pós-imagem para coletar dados SP. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

KPFM foi empregado como uma nova técnica para a obtenção de dados elétricos de superfície. Ele tem sido comumente usada como um método para a análise de distribuição de carga em química e só recentemente começou a ser aplicado para o estudo de sistemas biológicos na micro e nano-escala. A partir dos dados coletados, descobrimos que os micróbios não pareceu facilmente anexar para limpar superfícies de aço inoxidável e ouro, mesmo após 3 horas de incubação estática. Superfícies funcionalizadas poli-...

Os biofilmes produzidos nas superfícies dos equipamentos e em feridas cutâneas apresentam um problema para a indústria médica como biofilmes são recalcitrantes à remoção e pode levar a um aumento das taxas de transmissão da doença e resistência aos antimicrobianos. Anexo é o primeiro passo na formação de biofilme e é a etapa mais crítica, devido à sua reversibilidade 1-3. Características de superfície do substrato desempenham um papel crucial na adesão microbiana. Factores tais como a dureza da superfície, a porosidade, rugosidade, hidrofobicidade e têm sido mostrados para efectuar a adesão microbiana; No entanto, pouca investigação examinar o potencial papel da superfície do substrato (SP) na adesão microbiana tem sido feito 4,5. Superfícies carregadas negativamente impedir a penhora de esporos de Bacillus thuringiensis a mica, silício e ouro 6. Alterações no potencial da membrana celular são indicativos de alterações na adesão celular e a motilidade 5,7. Tem sido observado que hom electricamentesuperfícies ogeneous mais facilmente promover a adesão microbiana 5. Caracterizar o potencial de superfície de bactérias à escala nanométrica pode proporcionar uma nova maneira de entender a cinética de adesão de bactérias a superfícies diferentes, e assim pode ajudar no desenvolvimento de estratégias anti-incrustação biológica. Ao contrário de outros métodos utilizados para caracterizar a cinética electro de bactérias, como eletroforética espalhamento de luz, o potencial zeta, e determinação do ponto isoelétrico, microscopia de força sonda Kelvin (KPFM) permite a análise de células individuais em vez de culturas inteiras 11/08. Isso é benéfico quando se quer comparar célula-célula ou biofilme características elétricas com alta precisão e exatidão. KPFM é um módulo de microscopia de força atômica (AFM). AFM foi desenvolvido como um resultado direto do microscópio de tunelamento (STM) 12. As imagens publicadas pela primeira vez usando STM foram feitas por Gerd Binnig e Heinrich Rorhrer em 1982 12 </sup&gt;. Sua invenção foi capaz de resolver estruturas atômicas por raster digitalizando uma ponta condutora afiada sobre uma superfície condutora de ar. As implicações de conseguir imagens de alta resolução biólogos que rapidamente tentaram usar STM a imagem amostras secas de DNA, proteínas e vírus 12 animado. STM também pode ser feito de líquidos usando pontas de prova especializados 13. Isto foi demonstrado por Lindsay et ai., Que utilizado STM e AFM para moléculas de ADN da imagem em 10 mM de HClO 4 e na água, em eléctrodos de ouro 13. KPFM foi demonstrada na determinação dos potenciais de superfície de análise de DNA e proteína de 25 e biomoléculas interacção com ligandos 26. KPFM opera através da medição da diferença de potencial contacto (CPD), entre uma ponta cantilever condutor e uma amostra de AFM idealmente condutor (Figura 1, i) 14,15. As amostras não têm necessariamente de ser condutora (ie, sampl biológicaes). A imagiologia pode ser realizado em mica, vidro e superfícies de silício (não condutores), desde que a superfície não condutiva é fina e tem um material condutor subjacente 6,7. O DPC é equivalente ao potencial de tensão de superfície e pode ser descrita como a diferença nas funções de trabalho entre a ponta (tip φ) e amostra (amostra φ), dividida pela carga do electrão negativo (- e). Quando uma ponta de AFM condutor é levado para perto de uma superfície da amostra (separados por uma distância d), uma força electrostática (F es) é gerado, devido à diferença nas energias de Fermi (Figura 1, ii, a) 15. Neste ponto, as energias de vácuo da ponta e amostra (E v) estão em equilíbrio e alinhados. Ao trazer a extremidade mais perto da superfície da amostra, a superfície da ponta e a amostra entrem em contacto eléctrico e agir como capacitores de placas paralelas (Figura 1, b, ii </strong&gt;) 14,15. No ponto, as energias de Fermi superfície da ponta e da amostra se alinham, atingindo um equilíbrio de estado estacionário (Figura 1, ii, b). A ponta e amostra de superfície será cobrado e um CPD V irá formar devido a uma diferença de funções E v &#39;s e de trabalho. A F es age na área de contato elétrico devido ao CPD V formado. Esta força é subsequentemente anulada através da aplicação de um V DC externa da ponta que tem a mesma grandeza que o DPC V formado (Figura 1, ii, c). Esta tensão de CC aplicada elimina carga de superfície na área de contacto eléctrico, e a quantidade de V CC necessária para eliminar as es de F V CPD é igual à diferença nas funções de trabalho entre a sasuperfície mple e gorjeta de 15. Deve notar-se que a função de trabalho da ponta é conhecido e é fornecida pelos fabricantes. Em todos os métodos KPFM, uma tensão alternada (CA V, cerca de 100 - 500 mV) é também aplicado na ponta, a fim de gerar forças eléctricas oscilantes entre a ponta ea amostra 14. Isto proporciona uma melhor resolução ao medir mudanças na V CPD e / ou F es. Neste contexto, as alterações na frequência e amplitude de oscilação eléctrica pode ser corrigido por V DC, e mapas de potencial de superfície pode ser gerado. Os dados de áreas específicas destes mapas pode ser ainda analisada a fornecer informações elétrica sobre características topográficas específicas. KPFM pode ser operado em três modos: (1) Modo de levantamento, o modo (2), modulação de amplitude (AM), e modulação de frequência (FM) de modo 14,16 (3). Modo de elevação foi o inc inicialarnation de KPFM. Elevador modo baseia-se num método de duas passagens em que um ponta com oscilação é arrastado através da superfície para se obter uma imagem topográfica. Para o segundo passe a ponta é levantada uma distância pré-definida acima da amostra (10-100 nm) e digitalizada para o outro lado da mesma área. Devido a este método de duas passagens, o modo de elevador, em comparação com AM- e FM-KPFM, leva mais tempo para aquisição de imagem. Aumentando a ponta para fora da superfície garante que apenas longo alcance F es é medido. Além disso, conversas cruzadas entre topografia e medições de superfície potenciais é desacoplada à custa do aumento da resolução lateral e sensibilidade. AM-KPFM melhora a resolução lateral e sensibilidade usando dual-frequências para medir simultaneamente topografia da amostra e potencial de superfície (varredura de uma passagem) 14. No modo de AM, o braço de suporte é oscilado mecanicamente, geralmente 5% abaixo da sua primeira frequência de ressonância (f 0), e electricamente oscilado (through um AC V) em sua segunda frequência de ressonância (f 1). Mudanças na amplitude de f 0, para a geração de dados topográficos, enquanto as mudanças na amplitude de f 1, devido a mudanças na F es e V CPD, fornecer dados de medição do potencial de superfície. f 0 e f 1 do cantilever são separados por freqüências e energias significativas que sinalizam cross-talk é minimizado 14. A caixa eletrônica de cabeça (HEB) da AFM separa os dois sinais para dar tanto topográfico e de superfície de dados potenciais simultaneamente em uma varredura. FM-KPFM melhora a resolução ainda mais longe do AM-KPFM em superfícies biológicas 14. FM-KPFM funciona de forma diferente do que o AM-KPFM no que mede a evolução gradientes força eletrostática, em vez de força eletrostática (F es) 15. Como modo de AM, FM utiliza modo dual-frequências e um singlmecanismo de varredura de e-pass para obter topográfico e de superfície de dados potenciais simultaneamente 14. No modo FM, o cantilever é mecanicamente oscilaram em torno de f 0 e eletricamente oscilou em uma freqüência modificado baixo (f mod, tipicamente 1-5 kHz). Após interações eletrostáticas, f 0 e f mix mod para produzir faixas laterais de f 0 ± f mod. Estas bandas laterais são muito sensíveis às mudanças na força electrostática, e pode ser separado a partir de f 0 HEB através da AFM. Desde FM-KPFM mede as alterações em gradientes de força electrostática, o dicas forma ápice e sua manutenção / integridade desempenhar um papel crítico na superfície global potencial resolução 14, 15. Superfície potencial resolução com AM e modos de FM estão na gama de 1 nm, 14 lateralmente -16. Deve notar-se que KPFM imagiologia pode ser feito em líquidos não polares, e, mais recentemente, tem sido mostrado para ser feito em (&lt;10 mM) líquidos polares de baixo iónico (emKPFM modos de malha aberta, que não requerem uma reacção de polarização, obviando a aplicação de uma polarização DC), tais como água MilliQ; no entanto, KPFM imaging ainda tem de ser feito em células vivas em soluções polares 17-20. Desafios adicionais associados com SP imaging em líquido é que as soluções comumente usado para manutenção de células (ou seja, tampão fosfato salino) têm altas concentrações de íons móveis, o que levaria a reações faradaica, dinâmica de carga induzida por viés e difusão do íon / redistribuição 20. Assim, para esta experiência, as medidas foram tomadas a partir de células secas por MRSA e mortos em superfícies em aço inoxidável funcionalizadas com poli-L-lisina de aço e ouro sob condições ambientes. A imagiologia pode ser realizado em condições de ar ou de vácuo, em amostras biológicas que foram previamente secos ou imobilizados em superfícies 20. Condições de umidade também foram mostrados para afetar imagem KPFM de superfícies 6. Neste estudo, foram empregados FM-KPFMe AFM para examinar o papel de SP sobre a penhora de resistente à meticilina Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) para superfícies de aço inoxidável e ouro funcionalizadas poli-L-lisina. MRSA foi recentemente ganhou status como um multi-resistente (MDR) &quot;superbactéria&quot;, devido à sua resistência selecionados naturalmente a muitos antibióticos β-lactâmicos e cefalosporinas 21. Infecções MRSA são agora mais desafiadora, difícil e formidável de tratar, que conduz à utilização de agentes antimicrobianos mais duras, tais como a vancomicina ou oxazolidinonas que possuem níveis mais elevados de toxicidade em seres humanos e, portanto, não podem ser utilizados como tratamentos de longo prazo 22. O aço inoxidável foi escolhida devido à sua relevância médica e uso comum como um material em agulhas hipodérmicas, comadres, maçanetas, pias, etc. O ouro foi usado como um metal comparativa. FM-KPFM foi utilizado para examinar se microbiana membrana SP muda mediante adesão aos substratos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">5500ILM Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9435S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">AFM/STM Metal Specimen Discs</td>
			<td style="width:71px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:119px;">#16219</td>
			<td>Stainless steel sample discs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes</td>
			<td style="width:71px;">Mikromasch</td>
			<td style="width:119px;">#HQ:DPE-XSC11</td>
			<td>There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.&#160; We utilized cantilever B for experiments.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs</td>
			<td style="width:71px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:119px;">#16218-G</td>
			<td>Gold sample discs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PicoView Software</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9797B</td>
			<td>5500ILM Atomic Force Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pico Image Software (Pico Image Basic)</td>
			<td style="width:71px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#N9797AU-1FP</td>
			<td>5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">#91201513</td>
			<td>Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#221261</td>
			<td>Pre-made plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:71px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">#257107</td>
			<td>Comes as a dry powder.&#160; Instruction on how to make come on the container.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface potential measurement of bacteria using kelvin probe force microscopy

Potencial de superfície é uma característica física geralmente negligenciado que desempenha um papel dominante na adesão de microorganismos para substrato superfícies. Microscopia de força sonda Kelvin (KPFM) é um módulo de microscopia de força atômica (AFM), que mede a diferença de potencial entre as superfícies de contato na escala nano. A combinação de KPFM com a AFM permite a produção simultânea de potencial de superfície e mapas topográficos de amostras biológicas, tais como células bacterianas. Aqui, nós empregamos KPFM para examinar os efeitos do potencial de superfície sobre a adesão microbiana em superfícies medicamente relevantes, tais como aço inoxidável e ouro. Mapas de potencial de superfície revelou diferenças de potencial de superfície para membranas microbianas em diferentes substratos de materiais. Um gráfico passo-a altura foi gerado para mostrar a diferença de potencial na superfície uma área de fronteira entre a superfície do substrato e microrganismos. Alterações no potencial de membrana da superfície celular têm sido relacionados com a mudanças no metabolismo celular e a motilidade. Portanto, KPFM representa uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para examinar as alterações da superfície microbiana potencial de membrana sobre a adesão a várias superfícies do substrato. Neste estudo, nós demonstramos o procedimento para caracterizar o potencial de superfície de células de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina USA100 individuais em aço inoxidável e ouro usando KPFM.

A capacidade de medir utilizando SP KPFM baseia-se no princípio de que tanto a superfície da amostra e o braço de suporte da ponta condutora são, em certa medida. Aço inoxidável e ouro agiu superfícies como condutores para que MRSA foram anexados. KPFM imagens foram tiradas de 15 células por MRSA em ambas as superfícies com 512 x 512 de resolução, e com as áreas de análise que variam de 5 x 5 mm a 10 x 10 mm. Varredura foi realizada com velocidades de linha que variam de 0,02 linhas / seg de 0,05 linhas / s...

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Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.7K visualizações.  University of Guelph. Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces. 

Vídeo: Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. For example, they play an important role in directing cell migration during wound healing. Here we describe the manufacture and use of ultrasensitive vibrating probes for measuring extracellular electric currents. The probe is an insulated, sharpened metal wire with a small platinum-black tip (30-35 &mu;m), which can detect ionic currents in the &mu;A/cm2 range in physiological saline. The probe is vibrated at about 200 Hz by a piezoelectric bender. In the presence of an ionic current, the probe detects a voltage difference between the extremes of its movement. A lock-in amplifier filters out extraneous noise by locking on to the probe's frequency of vibration. Data are recorded onto computer. The probe is calibrated at the start and end of experiments in appropriate saline, using a chamber which applies a current of exactly 1.5 &mu;A/cm2. We describe how to make the probes, set up the system and calibrate. We also demonstrate the technique of cornea measurement, and show some representative results from different specimens (cornea, skin, brain).

The manufacture, calibration and use of non-invasive vibrating probes to measure bioelectric current in various biological systems is described.

Medição de corrente bioelétrica com uma sonda de vibração

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

Bioengenharia

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Medição de Coesão agregados por tensiometria superfície do tecido

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

A imobilização de bactérias for Imaging por Microscopia de Força Atômica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biossensor para detecção de bactérias Staphylococcus resistente a antibióticos

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. In this article we outline a valid and reliable technique to prepare and test permeabilized skeletal muscle fibers in vitro.

Medição do isométrica máxima força gerada pelo permeabilizadas fibras musculares esqueléticas

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

Medição da dinâmica de força-sensível da proteína em células vivas, usando uma combinação de técnicas fluorescentes

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...