Alguns dos dados aqui apresentados foram obtidos no laboratório do Dr. Jacqueline N. Crawley no Instituto Nacional de Saúde Mental dos EUA e nós gostaríamos de lhe agradecer por nos permitir mostrar os dados no papel. Agradecemos também Kazuo Nakanishi por sua ajuda no desenvolvimento de programa ImageFZ para análise comportamental. Esta pesquisa foi apoiada por Grant-in-Aid para a Investigação Científica (B) (21300121), Grant-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras (Comprehensive Cérebro Science Network) do Ministério da Educação, Ciência, Desporto e Cultura do Japão , conceder a partir de Neuroinformatics Japão Center (NIJC) e doações do CREST do Japão Agência de Ciência e Tecnologia (JST).

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	<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> What's wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , (2007).</li><li>Fanselow, M. S., Poulos, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroscience+of+mammalian+associative+learning.">The neuroscience of mammalian associative learning.</a> Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).</li><li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annu. Rev. 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Confirmamos que não há conflitos de interesse conhecidos associados com esta publicação e não houve apoio financeiro significativo para este trabalho que poderia ter influenciado o seu resultado.

O teste de condicionamento do medo contextual e cued é um dos paradigmas mais utilizados para avaliar a aprendizagem ea memória. Este teste é uma forma de condicionamento pavloviano em que é feita uma associação entre um contexto e / ou um estímulo condicionado (sinal sonoro) e um estímulo aversivo (footshock elétrica). Depois de até mesmo um único par do contexto / sinal sonoro e footshock, os ratos apresentam congelamento de longa duração, quando confrontado com qualquer contexto ou a sugestão. Neste ensaio, o comportamento de congelação é usado como um índice de memória medo. Os estudos farmacológicos e lesão revelaram que a formação da memória, consolidação e recuperação são regulados por diversas regiões do cérebro, como a amígdala, o hipocampo e córtex pré-frontal 3,33-35. Além disso, estudos de genética molecular têm demonstrado o papel dos genes e moléculas envolvidos na aprendizagem e na memória nestas regiões do cérebro usando camundongos geneticamente modificados 36 específicas. Portanto, este teste é simple e útil para explorar a base neurobiológica aprendizagem medo subjacente e memória. Neste artigo filme, apresentamos nosso protocolo para fornecer pesquisadores com informações detalhadas para entender e facilmente realizar o teste. Comportamento de congelamento foi quantificada através da observação direta por experimentadores humanos. Um pesquisador bem treinado é esperado para produzir resultados estáveis ​​confiáveis ​​em todo observações. No entanto, este método envolve potenciais problemas, tais como diferenças no método de observação, vieses do observador, e os erros de quantificação simples, o que torna difícil comparar diretamente os resultados de pesquisadores independentes e diferentes laboratórios. Um sistema de medição de computador baseado em photobeam automatizado também foi usado 26,30-32. No entanto, este sistema também apresenta problemas potenciais na medição comportamentos de congelamento. Devido ao arranjo de sensores, este sistema pode ser incapaz de detectar pequenos movimentos da cabeça que typically ser marcado como &quot;ativo&quot; através da observação humana. Além disso, tremendo durante o congelamento pode ser considerado como não congelantes porque quando um congela animais, interrupções intermitentes no photobeam são observadas como conseqüência do tremor. Como um método alternativo, automatizados imagem e vídeo-análise de sistemas foram desenvolvidos 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 descritos alguns sistemas com programas de software de análise de imagem que têm boa validade e marcar congelamento bem 17,20,37-38. No entanto, a maioria destes sistemas e programas de análise tem que ser obtida a partir de fornecedores comerciais e são tipicamente dispendiosos. Nós desenvolvemos o software ImageFZ para a análise do comportamento de congelamento, e este programa é distribuído como um programa de software livre. ImageFZ detecta o mouse como um corpo de pixels (uma partícula) e discrimina sutil movimento do mouse como &quot;congelamento&quot; ou &quot;não-congelamento &#39;, dependendo da quantidade deárea de regiões que não se sobrepõem entre as partículas de cada par de imagens consecutivas. Como mostrado nos resultados representativos, as medições utilizando o programa ImageFZ são consistentes com ou mais preciso do que o obtido utilizando outros métodos. Assim, o programa ImageFZ mede automaticamente o comportamento que os observadores humanos julgar como o congelamento de acordo com critérios definidos. Além disso, o programa ImageFZ calcula a distância percorrida (cm) antes, durante e após a exposição ao choque no pé, o que facilita uma avaliação da sensibilidade de choque e a análise do comportamento de congelação. Existem diferenças metodológicas entre os laboratórios. Essas diferenças podem resultar em dificuldade de comparação de dados entre os laboratórios e em replicar os resultados em diferentes laboratórios. Para obter dados mais estáveis ​​e comparáveis, é necessário normalizar o protocolo de teste, tanto quanto possível. O sistema de análise com ImageFZ leva à automação de processos de ensaio, o que pode contribuir paraa padronização dos protocolos usados ​​em laboratórios. Várias respostas comportamentais devem ser considerados quando se analisa o comportamento de congelamento. Em primeiro lugar, quando os animais enfrentam uma situação temerosa, eles podem fugir em vez de congelar 39. Fugindo é uma das respostas de medo, e sua ocorrência vai levar a subestimar a memória do medo. Em segundo lugar, a congelação pode depender de um nível de actividade geral, e o nível de actividade em ratinhos experimentais e de controlo necessita de ser examinado. Por exemplo, apesar de ratinhos sem o receptor de acetilcolina muscarínico M1 mostrou níveis reduzidos de congelação em comparação com ratinhos de tipo selvagem, vários testes comportamentais indicaram que os resultados podem ser atribuídos ao seu fenótipo de hiperactividade em vez da sua diminuição da memória 18. ImageFZ calcula a distância (cm) percorrida pelos sujeitos. Os dados estão disponíveis para examinar se existem diferenças nos níveis gerais de atividade entre os sujeitos. Se houver uma diferença no grupoa distância percorrida, uma abordagem possível para o problema é de considerar a distância percorrida durante o primeiro 2 min de formação, como a actividade da linha de base e para usar uma razão de supressão (razão de supressão = (actividade durante o teste) / (actividade da linha de base durante a + actividade durante teste)) como um índice secundário de medo 17,40. Finalmente, uma diferença na sensibilidade à dor, induzir as alterações na reactividade a um choque nas patas eléctrico, se houver, pode resultar em variações do comportamento de congelação. ImageFZ também calcula a distância percorrida (cm) em detalhe a partir de 2 segundos antes de uma exposição de um choque nas patas de 2 segundos a 2 segundos após a exposição (em 6 segundos), o qual pode ser utilizado como um indicador da sensibilidade do choque nas patas. Sistemas de vídeo-análise de ter sido desenvolvido para medir o comportamento de congelamento de albino, preto, cutia, e diluir os ratos marrons. ImageFZ utiliza uma bandeja de piso preto e grades pretas para examinar ratos brancos (ver Figura 1B). As grades pretas são feitas de especi<html> aliado processado metais revestidos com tinta preta e tem uma condutividade eléctrica semelhante à das grelhas de metal não revestida, que são tipicamente utilizados para ratos pretos. ImageFZ também analisa o comportamento de congelamento em ratos e outros roedores por meio de ajustes dos parâmetros do programa. Na versão atual do ImageFZ, o comportamento do sujeito é gravado usando uma câmera de vídeo a partir da parede superior para analisar o congelamento. ImageFZ também pode ser usado em uma configuração em que as imagens são captadas a partir do lado da câmara. Além disso, o ImageFZ controla um máximo de quatro aparelhos. Este recurso permite ao pesquisador analisar simultaneamente quatro ratos, economizando tempo e reduzindo os possíveis influências de diferenças no tempo de execução de cada um dos temas e da ordem de testes sobre o comportamento. Assim, ImageFZ simplifica o procedimento de teste e análise do comportamento de congelamento, e este programa facilita o teste com menos trabalho e sem qualquer tipo de formação para os experimentos comportamentais. e_content &quot;&gt; No laboratório Miyakawa, avaliamos mais de 110 cepas de ratos geneticamente modificados e dos ratos de controle do tipo selvagem no teste de condicionamento do medo contextual e cued utilizando o sistema de vídeo análise para elucidar os efeitos de um determinado gene na aprendizagem e memória 41-42 Obtivemos um grande conjunto de dados brutos para mais de 5.000 ratos Os dados brutos que foi usado para artigos de pesquisa publicados 4-16 estão incluídos no &#39;Mouse Fenótipo banco de dados &quot;, como um banco de dados público (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Este artigo filme presente fornece informações detalhadas a respeito dos detalhes do nosso procedimento experimental e promove a compreensão da situação de teste.

O teste de condicionamento do medo contextual e cued é o paradigma comportamental utilizado para avaliar medo associativa aprendizagem e memória em roedores 1-3. Este teste tem sido amplamente utilizada para compreender os mecanismos neurobiológicos da aprendizagem medo e memória em camundongos transgênicos e knockout 1,4-16. Comportamento de congelamento, que é definida como a imobilidade completa, com a exceção da respiração, é uma resposta comum a situações de medo. Neste paradigma comportamental, depois de animais são expostos a um emparelhamento de um sinal sonoro com uma footshock elétrica, eles respondem ao estímulo de produção de medo, mostrando o comportamento de congelamento, que é medido como um índice de aprendizagem medo associativa e memória. Este teste requer equipamentos menos elaborado, menos esforço físico pelo investigador, e muito menos tempo de treinamento para os ratos do que outras tarefas de aprendizagem e memória, que geralmente requer cerca de 5-10 min / dia por rato durante 2 dias. Embora o procedimento de teste é simple e requer pouco tempo para realizar, o investigador deve cuidadosamente observar e medir o comportamento do mouse e, portanto, vários sistemas automáticos de medição foram desenvolvidos para realizar a análise comportamental 17-20. Nosso sistema de vídeo-análise, que foi desenvolvido com o programa de software ImageFZ, nos permite analisar facilmente o comportamento de congelamento e produzir resultados altamente confiáveis. Este artigo fornece informações detalhadas sobre o nosso procedimento de teste e descreve como usar o programa de software ImageFZ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="701">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;ImageFZ&#160; program</td>
			<td>Developed by Tsuyoshi Miyakawa</td>
			<td></td>
			<td>&#160;This program is available through O&#39;Hara &#38; Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditioning chamber</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>CL-3002L</td>
			<td>For mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cued test chamber</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>CLT-3002L</td>
			<td>For mouse.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>CL-1040</td>
			<td>The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrambled shock generator</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>SGA-2040</td>
			<td>The shock generator can be controlled by ImageFZ program.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock grid tester (ammeter)</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>SG-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB video capture device</td>
			<td>XLR8</td>
			<td>USB2IVOSX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad image splitter</td>
			<td>Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan</td>
			<td>400AS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soundproof room</td>
			<td>O&#39;Hara &#38; co., Japan</td>
			<td>CL-4210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Monitor</td>
			<td>San Diego Instruments, Inc., CA, USA</td>
			<td></td>
			<td>16 x 16 photbeam array&#160; ( 2.5 cm spacing)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contextual and cued fear conditioning test using a video analyzing system in mice

O teste de condicionamento do medo contextual e cued é um dos testes comportamentais, que avalia a capacidade dos ratos para aprender e lembrar uma associação entre estímulos ambientais e experiências aversivas. Neste teste, os ratos são colocados numa câmara de condicionamento e são dadas as aparas de um estímulo condicionado (de um sinal sonoro) e um estímulo não condicionado aversivo (um choque nas patas eléctrica). Depois de um tempo de atraso, os ratinhos são expostos à mesma câmara de condicionamento e uma câmara com uma forma diferente de apresentação do sinal sonoro. Congelamento comportamento durante o ensaio é medido como um índice de memória medo. Para analisar o comportamento automaticamente, desenvolvemos um sistema de análise de vídeo usando o programa de software aplicativo ImageFZ, que está disponível como um download gratuito em http://www.mouse-phenotype.org/. Aqui, para mostrar os detalhes do nosso protocolo, demonstramos o nosso procedimento para o contextual e cued teste medo condicionado em ratos C57BL/6J usando o sist ImageFZem. Além disso, nós validado nosso protocolo e o desempenho do sistema de vídeo de análise por meio da comparação do tempo de congelação medido pelo sistema ImageFZ ou um sistema de medição de computador baseado em photobeam com que marcado por um observador humano. Como mostrado nos resultados representativos, os dados obtidos por ImageFZ foram semelhantes aos analisados ​​por um observador humano, indicando que a análise comportamental usando o sistema ImageFZ é altamente fiável. O artigo filme presente fornece informações detalhadas sobre os procedimentos de teste e irá promover a compreensão da situação experimental.

No teste de medo condicionado, experimentadores humanos utilizado para quantificar o comportamento de congelamento por meio de observação direta de trabalho intensivo 26-29, mas de medição computador recentemente com base em photobeam (por exemplo, o sistema de &quot;Congelar Monitor &#39;) e imagem em análise de sistemas têm sido usados ​​para automaticamente medir o comportamento de congelamento 26,30-32. ImageFZ é um sistema de análise de imagem-automatizado, o qual produz os resultados comparáveis ​​àqueles obtidos por meio de observação humana, tal como descrito abaixo. Aqui, nós comparamos os resultados de observação humana com os de análise ImageFZ sob parâmetros variáveis: &#39;Rate (quadros / seg) &quot;e&quot; Congelamento critério (pixels). Neste experimento, cinco camundongos C57BL/6J machos (média de peso corporal ± SD (g), 31,4 ± 3,55, com média de tamanho do corpo ± SD (pixels), 351,6 ± 62,2) foram utilizados em 15-27 semanas de idade. A observação humana foi feita usando um programa de evento de gravação (um programa de software Macintosh OS9); um evento de pressionar a tecla que continued por 2 segundos ou mais, quando um rato exibido um ataque de nenhum movimento foi considerado &quot;congelamento&quot;. A percentagem de congelamento foi calculado a cada 60 segundos em cada um dos testes e utilizado para análises de correlação. A porcentagem de congelamento marcado pelos dois observadores (confiabilidade interobservador, para condicionado, r = 0,879; para teste de contexto, r = 0,957; para teste cued, r = 0,866, para todos os casos, r = 0,888) foi em média de gerar um ser humano marcar. Correlações entre as porcentagens de congelamento medidos através ImageFZ com cada taxa de quadros (ou seja, 1, 2 e 4 fps) e aqueles obtidos através de observações humanos foram examinados. Tal como ilustrado na Figura 4, as percentagens calculadas através de congelamento ImageFZ (1, 2, e 4 fps) eram altamente correlacionados com o valor médio obtido a partir da medição dos dois observadores. Notavelmente, a captura de imagens a uma taxa de quadros mais alta nem sempre produz a melhor correlação. A análise de imagem em 1 resultados fps gerado semelhantes aos obtidos a partir de observadores humanos e emteste ach. Correlações entre as porcentagens de congelamento medidos através de observações humanas e utilizando ImageFZ em cada condição do &#39;critério de congelamento (pixels) &quot;(ou seja, 20, 30 e 40 pixels) foram examinados. As percentagens de congelamento calculados usando ImageFZ no &#39;critério de congelamento (pixels)&#39; de 20, 30 e 40 pixels foram, em todos os casos, altamente correlacionada com os obtidos através de observações humanas (Figura 5). Como mostrado na Figura 5D, quando o critério de congelamento é definido para um valor baixo, o movimento sutil de um rato, consideradas como &quot;congelamento&quot; por observadores humanos, seria considerado &quot;não-congelamento &#39;usando ImageFZ. Por outro lado, se o critério é definido para um valor alto, o movimento de um rato, marcado como &quot;não-congelamento &#39;por observadores humanos, seria considerado&#39; congelamento &#39;usando ImageFZ (Figuras 5C, 5F, e 5I). Assim, para obter os resultados mais fiáveis, cada um dos parâmetros do programa ImageFZ deve ser calibrado nósção os dados marcados através de observações humanas em cada ambiente de teste. Além disso, compararam-se os resultados obtidos por um observador humano, usando um sistema de medição com base photobeam computador (o sistema de monitor de congelamento), com os obtidos usando ImageFZ (ver Figura 6). O observador humano desconhecia o grupo de tratamento e os resultados do ImageFZ marcar. Para os ajustes dos parâmetros do sistema de congelamento Monitor, usamos três medidas de porcentagem de congelamento de um sistema previamente validado 30. Resumidamente, o número de intervalos de 10 seg, em que os animais necessitaram de mais de 1 ou 2 segundos a atravessar a primeira nova feixe do intervalo (10 seg 1 seg e 2 seg 10 seg, respectivamente) e a latência entre o início de cada intervalo de cinco segundos e a terceira nova interrupção do feixe dentro deste intervalo (Latency3) foram medidos. As percentagens dos intervalos durante o qual o mouse foi congelamento ou a porcentagem da quantidade total de tempo required para quebrar o terceiro photobeam foram calculados. As percentagens de congelamento medidos em cada sistema estão ilustrados na Figura 6. Os grupos foram comparados por meio de duas vias para medidas repetidas ANOVA seguido de teste t (ver Tabela 1). As percentagens de congelamento medidos usando ImageFZ (Figura 6B) foram mais semelhantes aos marcados através da observação humana (Figura 6A) do que os resultados obtidos utilizando um sistema baseado em photobeam (Figuras 6C-E). As percentagens de congelamento medidos utilizando o programa ImageFZ em cada teste foram altamente correlacionados com aqueles marcou através da observação humana (condicionado, r = 0,947, teste de contexto, r = 0,970; cued teste, r = 0,934), enquanto que as correlações entre as percentagens de congelamento medido utilizando o sistema de medição de computador baseado em photobeam (10seg 1s, 2s 10seg, ou Latency3) e o observador humano foram menores (condicionado, r = 0,503, 0,593, e 0,761; contexto test, r = 0,772, 0,819 e 0,912) em comparação com as correlações entre as percentagens de congelamento medidos usando ImageFZ e observação humana (Figuras 7A e 7B). Além disso, a Figura 7 revela que as diferenças entre as percentagens de congelação obtidos através da observação humana e usando ImageFZ em cada rato foram as menores diferenças. Estes resultados indicaram que as percentagens de congelamento medidos usando ImageFZ foram semelhantes aos obtidos através de observação humana e que ImageFZ é altamente preciso, quando a medição da quantidade de congelamento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1.jpg" /> Figura 1. Aparelhos de contextual e cued teste medo condicionado. (A) Uma câmara quadrada de acrílico para o teste de condicionamento e contexto, ( <strong&gt; B) grades de metal sobre um piso de plástico branco para preto, cutia, ou diluir os ratos marrons (em cima) e grades de metal preto electrifiable sobre um piso de plástico preto para ratos brancos (inferior), as imagens ampliadas das grades são mostrados na direita painel, (C) um gerador de ruído / tom branco e um gerador de choque, (D) uma sala à prova de som, e (E) uma câmara triangular acrílica com um piso plano para o teste cued. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2.jpg" /> Figura 2. Representação esquemática do protocolo. (A) Visão geral do contextual e cued teste medo condicionado, (B) condicionado, (C) cCONTEXTO teste, e (D) com pistas de teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3.jpg" /> Figura 3. A análise de imagem pelo software ImageFZ. Para cada par de imagens sucessivas, sendo a quantidade de área (pixels), através do qual o rato é movido calculado ImageFZ. Quando esta área é inferior a um certo limiar (por exemplo, 30 pixels), o comportamento é julgada ser &quot;congelamento&quot;. Quando a quantidade de área igual ou superior ao limiar, o comportamento é considerado &quot;não-congelamento &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Comparações entre as percentagens de congelamento calculados a partir de imagens em diferentes taxas de quadros usando ImageFZ com os medidos através da observação humana. Os testes de medo condicionado foram realizados utilizando camundongos C57BL/6J machos (n = 5). Durante os testes, dois observadores marcou o comportamento de congelamento. Simultaneamente, imagens ao vivo foram capturados em 4 fps usando o programa ImageFZ. Os arquivos capturados em 4 fps foram reduzidos depois de extrair os quadros para corresponder a imagens capturadas em 1 fps ou 2 fps. Os valores dos parâmetros de &quot;Rate (frames / seg)&quot; foram definidos como 1, 2 ou 4 fps, e as porcentagens de congelamento em cada 60 seg bin foram calculados a partir de arquivos de imagem usando análise offline ImageFZ. Cada ponto representa uma porcentagem de congelamento de cada 60 seg bin. Os coeficientes de correlação de Pearson entre os dados obtidos a partir da observação humana e análise ImageFZ foram calculados.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. As percentagens de congelamento calculados a partir das imagens em diferentes valores de critério de congelamento, utilizando ImageFZ e os medidos através de observações humanos foram comparados. Os testes de medo condicionado foram conduzidos utilizando ratos C57BL/6J machos (n = 5). Durante os testes, dois observadores registraram o comportamento de congelamento, e as imagens foram capturadas ao vivo usando o programa ImageFZ. As percentagens de congelamento em cada 60 seg bin foram calculados a partir das imagens (1 frame / seg) através de análise offline ImageFZ, definir os valores dos parâmetros do &quot;critério de congelamento (pixels) &#39;a 20, 30 ou 40 pixels. Cada ponto representa uma porcentagem de congelamento de cada 60 seg bin. Co correlação de Pearsonefficients entre os dados obtidos a partir da observação humana ea análise ImageFZ foram calculados em cada teste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6.jpg" /> Figura 6. Os percentuais de congelamento foram medidos usando sistemas automatizados e observação humana em grupos incondicionados e condicionados de camundongos C57BL/6J machos (n = 5, cada grupo). (A) a observação humana, (B) ImageFZ, (C) Bloqueio de Sistema Monitor de 1 (10seg 1seg), (D) Bloqueio de Sistema Monitor 2 (2seg 10seg) e (E) Bloqueio de Sistema Monitor 3 (Latency3). Grupo comparações foram realizadas utilizando duas vias para medidas repetidas ANOVA seguido de teste t (uncovs condicionado grupo nditioned grupo, * P &lt;0,05; †, p &lt;0,01). Os dados obtidos com ImageFZ foram semelhantes aos marcou através da observação humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="4.3in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" width="420" /> Figura 7. Correlação e distribuição das diferenças entre as porcentagens de congelamento, medidos usando sistemas automatizados e de observação humana. (AB) Gráficos de dispersão e os coeficientes de correlação de Pearson entre as porcentagens de congelamento marcados através de sistemas automatizados e observação humana freqüência são mostrados. As percentagens de congelamento, calculados usando ImageFZ, foram altamente correlacionados com os obtidos através da observação humana. (CF) Ocorrências de menos de um dif 10%rença entre as percentagens de congelação obtidos a partir de sistemas automatizados versus observação humana foram maiores quando os dados analisados ​​usando ImageFZ foram comparados com aqueles analisados ​​através da observação humana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem ampliada.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> ANOVAs </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Condição </td><td> Tempo </td><td> Condição x Tempo </td></tr><tr><td> Dia 1 (condicionado) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Humano </td><td> F (1,8) = 28,53, p = 0,0007 </td><td> F (7,56) = 20,79, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 16,58, p &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F (1,8) = 13,97, p = 0,0057 </td><td> F (7,56) = 21,40, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 11,69, p &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (1sec10sec) </td><td> F (1,8) = 5,16, p = 0,0528 </td><td> F (7,56) = 2,39, p = 0,0329 </td><td> F (7,56) = 0,72, p = 0,6572 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (2sec10sec) </td><td> F (1,8) = 4,07, p = 0,0782 </td><td> F (7,56) = 3,44, p = 0,0039 </td><td> F (7,56) = 1,52, p = 0,1803 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (Latency3) </td><td> F (1,8) = 4,44, p = 0,0682 </td><td> F (7,56) = 9,94, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 4,33, p = 0,0007 </td></tr><tr><td> Dia 2 (contexto) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Humano </td><td> F (1,8) = 42,94, p = 0,0002 </td><td> F (4,32) = 1,91, p = 0,1336 </td><td> F (4,32) = 1,48, p = 0,2302 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F (1,8) = 49,61, p = 0,0001 </td><td> F (4,32) = 2,06, p = 0,1087 </td><td> F (4,32) = 0,83, p = 0,5174 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (1sec10sec) </td><td> F (1,8) = 20,28, p = 0,002 </td><td> F (4,32) = 1,63, p = 0.1918 </td><td> F (4,32) = 0,55, p = 0,6997 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (2sec10sec) </td><td>F (1,8) = 40,20, p = 0,0002 </td><td> F (4,32) = 2,66, p = 0,0504 </td><td> F (4,32) = 1,20, p = 0,3306 </td></tr><tr><td> Congelar Monitor (Latency3) </td><td> F (1,8) = 35,30, p = 0,0003 </td><td> F (4,32) = 2,49, p = 0,0626 </td><td> F (4,32) = 1,09, p = 0,3793 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Comparações de estatísticas.

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Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Este artigo apresenta um protocolo para um teste de condicionamento do medo contextual e cued usando um sistema de vídeo de análise para avaliar o medo de aprendizagem e memória em camundongos.

Contextual e Cued Medo Condicionado Teste Usando um sistema de análise de vídeo em Ratos

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

contextual-cued-fear-conditioning-test-using-video-analyzing-system

Research

JoVE Journal

Behavior

51.2K visualizações.  Fujita Health University.  Este artigo apresenta um protocolo para um teste de condicionamento do medo contextual e cued usando um sistema de vídeo de análise para avaliar o medo de aprendizagem e memória em camundongos. 

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Construction of Microdrive Arrays for Chronic Neural Recordings in Awake Behaving Mice

State-of-the-art electrophysiological recordings from the brains of freely behaving animals allow researchers to simultaneously examine local field potentials (LFPs) from populations of neurons and action potentials from individual cells, as the animal engages in experimentally relevant tasks. Chronically implanted microdrives allow for brain recordings to last over periods of several weeks. Miniaturized drives and lightweight components allow for these long-term recordings to occur in small mammals, such as mice. By using tetrodes, which consist of tightly braided bundles of four electrodes in which each wire has a diameter of 12.5 &mu;m, it is possible to isolate physiologically active neurons in superficial brain regions such as the cerebral cortex, dorsal hippocampus, and subiculum, as well as deeper regions such as the striatum and the amygdala. Moreover, this technique insures stable, high-fidelity neural recordings as the animal is challenged with a variety of behavioral tasks. This manuscript describes several techniques that have been optimized to record from the mouse brain. First, we show how to fabricate tetrodes, load them into driveable tubes, and gold-plate their tips in order to reduce their impedance from M&Omega; to K&Omega; range. Second, we show how to construct a custom microdrive assembly for carrying and moving the tetrodes vertically, with the use of inexpensive materials. Third, we show the steps for assembling a commercially available microdrive (Neuralynx VersaDrive) that is designed to carry independently movable tetrodes. Finally, we present representative results of local field potentials and single-unit signals obtained in the dorsal subiculum of mice. These techniques can be easily modified to accommodate different types of electrode arrays and recording schemes in the mouse brain.

The design and assembly of microdrives for in vivo electrophysiological recordings of brain signals from the mouse is described. By attaching microelectrode bundles to sturdy driveable carriers, these techniques allow for long-term and stable neural recordings. The lightweight design allows for unrestricted behavioral performance by the animal following drive implantation.

Construção de Matrizes Microdrive para gravações Neurais crônica na Awake Mice comportam

State-of-the-art electrophysiological recordings from the brains of freely behaving animals allow researchers to simultaneously examine local field ...

Comportamento

Trace Fear Conditioning in Mice

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings between a neutral stimulus and an unconditioned stimulus. There is a 20 sec trace period that separates each conditioning trial. On the following day freezing is measured during presentation of the conditioned stimulus (CS) and trace period. On the third day there is an 8 min test to measure contextual memory. The representative results are from mice that were presented with the aversive unconditioned stimulus (shock) compared to mice that received the tone presentations without the unconditioned stimulus. Trace fear conditioning has been successfully used to detect subtle learning and memory deficits and enhancements in mice that are not found with other fear conditioning methods. This type of fear conditioning is believed to be dependent upon connections between the medial prefrontal cortex and the hippocampus. One current controversy is whether this method is believed to be amygdala-independent. Therefore, other fear conditioning testing is needed to examine amygdala-dependent learning and memory effects, such as through the delay fear conditioning.

In the following experiment we describe a protocol for trace fear conditioning in mice. This type of associative memory includes a trace period that separates the neutral stimulus and the unconditioned stimulus.

Traçar medo condicionado em ratos

In this experiment we present a technique to measure learning and memory. In the trace fear conditioning protocol presented here there are five pairings ...

Using the Threat Probability Task to Assess Anxiety and Fear During Uncertain and Certain Threat

Fear of certain threat and anxiety about uncertain threat are distinct emotions with unique behavioral, cognitive-attentional, and neuroanatomical components. Both anxiety and fear can be studied in the laboratory by measuring the potentiation of the startle reflex. The startle reflex is a defensive reflex that is potentiated when an organism is threatened and the need for defense is high. The startle reflex is assessed via electromyography (EMG) in the orbicularis oculi muscle elicited by brief, intense, bursts of acoustic white noise (i.e., &#8220;startle probes&#8221;). Startle potentiation is calculated as the increase in startle response magnitude during presentation of sets of visual threat cues that signal delivery of mild electric shock relative to sets of matched cues that signal the absence of shock (no-threat cues). In the Threat Probability Task, fear is measured via startle potentiation to high probability (100% cue-contingent shock; certain) threat cues whereas anxiety is measured via startle potentiation to low probability (20% cue-contingent shock; uncertain) threat cues. Measurement of startle potentiation during the Threat Probability Task provides an objective and easily implemented alternative to assessment of negative affect via self-report or other methods (e.g., neuroimaging) that may be inappropriate or impractical for some researchers. Startle potentiation has been studied rigorously in both animals (e.g., rodents, non-human primates) and humans which facilitates animal-to-human translational research. Startle potentiation during certain and uncertain threat provides an objective measure of negative affective and distinct emotional states (fear, anxiety) to use in research on psychopathology, substance use/abuse and broadly in affective science. As such, it has been used extensively by clinical scientists interested in psychopathology etiology and by affective scientists interested in individual differences in emotion.

Potentiation of the startle reflex is measured via electromyography of the orbicularis oculi muscle during low (uncertain) and high (certain) probability electric shock threat in the Threat Probability Task. This provides an objective measure of distinct negative emotional states (fear/anxiety) for research on psychopathology, substance use/abuse, and broad affective science.

Usando o Task Threat Probabilidade para avaliar a ansiedade eo medo Durante Threat incerto e Certain

Fear of certain threat and anxiety about uncertain threat are distinct emotions with unique behavioral, cognitive-attentional, and neuroanatomical ...

Quantifying Social Motivation in Mice Using Operant Conditioning

In this protocol, social motivation is measured in mice through a pair of operant conditioning paradigms. To conduct the experiments, two-chambered shuttle boxes were equipped with two operant levers (left and right) and a food receptacle in one chamber, which was then divided from the second chamber by an automated guillotine door covered by a wire grid. Different stimulus mice, rotated across testing days, served as a social stimulus behind the wire grid, and were only visible following the opening of the guillotine door. Test mice were trained to lever press in order to open the door and gain access to the stimulus partner for 15 sec. The number of lever presses required to obtain the social reward progressively increased on a fixed schedule of 3. Testing sessions ended after test mice stopped lever pressing for 5 consecutive minutes. The last reinforced ratio or breakpoint can be used as a quantitative measure of social motivation. For the second paradigm, test mice were trained to discriminate between left and right lever presses in order to obtain either a food reward or the social reward. Mice were rewarded for every 3 presses of each respective lever. The number of food and social rewards can be compared as a measurement of the value placed upon each reward. The ratio of each reward type can also be compared between mouse strains and the change in this ratio can be monitored within testing sessions to measure satiation with a given reward type. Both of these operant conditioning paradigms are highly useful for the quantification of social motivation in mouse models of autism and other disorders of social behavior.

This article describes a new protocol for the quantitative measurement of social motivation in mice using operant conditioning for a social reward. The protocol is useful for the measurement of social motivation in mouse models of autism and other disorders of social behavior.

Quantificar motivação social em ratos usando Condicionamento Operante

In this protocol, social motivation is measured in mice through a pair of operant conditioning paradigms. To conduct the experiments, two-chambered ...

Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback Test

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, sex, condition, and genetic background of the emitting animal. Although many studies have characterized these differences, whether receiver mice can discriminate among objectively different USVs and show preferences for particular sound traits remains to be elucidated. To determine whether mice can discriminate between different characteristics of USVs, a playback experiment was developed recently, in which preference responses of mice to two different USVs could be evaluated in the form of a place preference.
First, USVs from mice were recorded. Then, the recorded USVs were edited, trimmed accordingly, and exported as stereophonic sound files. Next, the USV amplitudes generated by the two ultrasound emitters used in the experiment were adjusted to the same sound pressure level. Nanocrystalline silicon thermo-acoustic emitters were used to play the USVs back. Finally, to investigate the preference of subject mice to selected USVs, pairs of two differing USV signals were played back simultaneously in a two-choice test box. By repeatedly entering a defined zone near an ultrasound emitter and searching the wire mesh in front of the emitter, the mouse reveals its preference for one sound over another. This model allows comparing the attractiveness of the various features of mouse USVs, in various contexts.

Ultrasonic vocalizations (USVs) in mice differ depending on age, sex, condition, and genetic background. Using two ultrasound emitters broadcasting simultaneously in different locations, this two-choice test can evaluate murine recognition and preference responses to different characteristics of USVs.

Determinando Preferências Ultrasonic vocalização em ratos utilizando um teste de reprodução de dois escolha

Mice emit ultrasonic vocalizations (USVs) during a variety of conditions, such as pup isolation and adult social interactions. These USVs differ with age, ...

Whisker-signaled Eyeblink Classical Conditioning in Head-fixed Mice

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive repertoire of scientific techniques available to study learning and memory at the cellular level, it is ideal to have a stable cranial platform. Because mice do not readily tolerate restraint, they are usually trained while moving about freely in a chamber. Conditioned stimulus (CS) and unconditioned stimulus (US) information are delivered and eyeblink responses recorded via a tether connected to the mouse's head. In the head-fixed apparatus presented here, mice are allowed to run as they desire while their heads are secured to facilitate experimentation. Reliable conditioning of the eyeblink response is obtained with this training apparatus, which allows for the delivery of whisker stimulation as the CS, a periorbital electrical shock as the US, and analysis of electromyographic (EMG) activity from the eyelid to detect blink responses.

The preparation presented here for whisker-signaled eyeblink conditioning in head-fixed mice precisely stimulates specific whiskers while allowing mice to ambulate on a cylindrical treadmill. A whisker stimulation conditioned stimulus (CS) paired with a periorbital shock unconditioned stimulus (US) results in reliable associative learning on this apparatus.

sinalizado-Bigode Eyeblink condicionamento clássico em Ratos fixo-Cabeça

Eyeblink conditioning is a common paradigm for investigating the neural mechanisms underlying learning and memory. To better utilize the extensive ...

Use of a Video Scoring Anchor for Rapid Serial Assessment of Social Communication in Toddlers

Reciprocal social behavior (RSB), an early-emerging capacity to engage in social contingency&#8212;which is foundational for both social learning and social competency&#8212;is hypothesized to be disrupted in autism spectrum disorder (ASD). The ability to quantify the full range of RSB during the toddler period, when core symptoms of ASD often arise, is pivotal for evaluating early risk for ASD, characterizing social development, and tracking response to early interventions. However, important parameters of variation in RSB&#8212;especially prior to the development of verbal language&#8212;can be nuanced and difficult to characterize using questionnaire-based methods. To address this challenge, we developed a system for measuring quantitative variation in RSB in toddlers (ages 18 - 30 months) that incorporated not only standard questionnaire data from caregivers but also a novel set of video-referenced items, through which a respondent compares the behavior of a subject to that observed in a short video of a young child manifesting a highly competent level of social communication. Testing of this measure in a general population sample of twins confirmed that both the video-referenced items and the RSB Total Score (video-referenced items plus non-video-referenced items) displayed unimodal, continuous distributions, strong internal consistency, marked preservation of individual differences, and extremely high heritability. In addition, video-referenced items were particularly sensitive to quantifying incremental changes in social communication, a major element of RSB, over the course of early childhood development. Scores on the vrRSB clearly differentiated children with and without ASD and these data comprise an initial validation of this promising method for quantifying early RSB&#8212;cross-sectionally, over time, and as a function of early intervention.

Here we present a protocol for administration of the video-referenced rating of reciprocal social behavior (vrRSB) using a paper or online version. This survey quantifies RSB, a prerequisite for social competence, in toddlers through &#34;video-referenced&#34; items whereby a subject is compared to a reference child shown in a three-minute video.

Utilização de um vídeo marcador de âncora para rápida avaliação Serial de Comunicação Social nas crianças

Reciprocal social behavior (RSB), an early-emerging capacity to engage in social contingency&#8212;which is foundational for both social learning and ...

Using Electroencephalography Measurements and High-quality Video Recording for Analyzing Visual Perception of Media Content

This article explores a method to detect differences in visual perception in humans. The method used is based on the psychological (or "cognitive") function of eyeblinks. Participants' eyeblinks are detected and acquired while watching videos specifically created for the investigation. The detection and acquisition of eyeblinks are carried out with the help of a 20-channel electroencephalographic (EEG) wireless device. The international 10-20 system for electrode placement is followed. A high-definition (HD) video camera is used to record participants' facial expressions, for contrast purposes. Instead of using pre-existing media content, purpose-made video content has been created following specific criteria of interest for this investigation, with stimuli enabling researchers to manage the precise parameters of interest. Otherwise, results could be contaminated with uncontrolled variables. The synchronization of the presentation of video stimuli with EEG recordings needs to be done in milliseconds. Analysis of collected data is performed with robust software for working with big matrices. Statistically significant differences in eyeblink rate related to media professionalization and editing style are found with the reported experimental procedures.

We present detection, acquisition, and analysis of eyeblink rates while watching media content.

Usando medições de Eletroencefalografia e gravação de vídeo de alta qualidade para analisar a percepção Visual de conteúdo de mídia

This article explores a method to detect differences in visual perception in humans. The method used is based on the psychological (or "cognitive") ...

Analyzing Spatial Learning and Prosocial Behavior in Mice Using the Barnes Maze and Damsel-in-Distress Paradigms

The Barnes maze is a reliable measure of spatial learning and memory that does not require food restriction or exposure to extremely stressful stimuli. The Barnes maze can also assess other mouse behaviors, such as general motivation to escape from the maze platform and exploratory behavior. The Barnes maze can measure whether a genetic mutation or environmental variable can impact the acquisition and retention of spatial memories, as well as provide information about the search strategy employed by the mice. Here we use the Barnes maze to detect a memory deficit in adult mice following a single developmental ethanol exposure event. The newly described Damsel-in-Distress paradigm exposes a male mouse to a female mouse trapped in a chamber in the open center field of the arena. It provides an opportunity for the mouse to socially respond to the trapped female and exhibit prosocial behavior. The Damsel-in-Distress paradigm can also be used to examine mouse behavior in a novel arena and measure locomotor activity. Both the Barnes Maze and the Damsel-in-Distress protocols require minimal financial investment and most aspects of the tests can be constructed from common lab supplies. These flexible and accessible tools can also be used to detect behavioral changes over the course of development.

This protocol measures spatial learning and memory using the Barnes maze. A novel Damsel-in-Distress paradigm is used to assess locomotor activity and prosocial behavior in mice.

Analisando a aprendizagem espacial e comportamento pró-social nos ratos usando o labirinto de Barnes e paradigmas de donzela em apuros

The Barnes maze is a reliable measure of spatial learning and memory that does not require food restriction or exposure to extremely stressful stimuli. ...

Visual Classical Conditioning in Wood Ants

Several species of insects have become model systems for studying learning and memory formation. Although many studies focus on freely moving animals, studies implementing classical conditioning paradigms with harnessed insects have been important for investigating the exact cues that individuals learn and the neural mechanisms underlying learning and memory formation. Here we present a protocol for evoking visual associative learning in wood ants through classical conditioning. In this paradigm, ants are harnessed and presented with a visual cue (a blue cardboard), the conditional stimulus (CS), paired with an appetitive sugar reward, the unconditional stimulus (US). Ants perform a Maxilla-Labium Extension Reflex (MaLER), the unconditional response (UR), which can be used as a readout for learning. Training consists of 10 trials, separated by a 5-minute intertrial interval (ITI). Ants are also tested for memory retention 10 minutes or 1 hour after training. This protocol has the potential to allow researchers to analyze, in a precise and controlled manner, the details of visual memory formation and the neural basis of learning and memory formation in wood ants.

We present a protocol for the classical conditioning of harnessed ants that permits researchers to study visual learning and memory formation at a level of analysis not possible with freely moving individuals.

Visual condicionamento clássico em madeira formigas

Several species of insects have become model systems for studying learning and memory formation. Although many studies focus on freely moving animals, ...