Este trabalho foi parcialmente apoiado por KAKENHI Grants JP22K15795 (para T.F.), JP22K09734 (para N.K.), JP21K07489 (para R.Y.), Kanazawa Medical University (C2022-3, D2021-4, para R.Y.) e The Naito Foundation (para T.F.).

Este protocolo foi conduzido de acordo com os princípios orientadores da Sociedade Fisiológica do Japão e recebeu aprovação do Comitê de Cuidados com Animais da Kanazawa Medical University (2021-32). Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes do ARRIVE. Camundongos adultos machos C57BL/6J (3-6 meses de idade) foram utilizados para o estudo, e foi previamente confirmado que esses camundongos exibiram os comportamentos de voo descritos neste manuscrito15.
1. Preparo dos animais
<ol><li>Camundongos grupo-casa (3-4 por gaiola; mantidos a 23-27 °C; sob um ciclo claro/escuro de 12 h; fornecido acesso ad libitum a comida e água) até o início dos experimentos.</li>
	<li>Alojar individualmente cada rato em uma gaiola de plexiglass (14 cm × 21 cm × 12 cm) por pelo menos 3 dias antes de se submeter a esse condicionamento de medo modificado.</li>
</ol>2. Configuração das ferramentas/equipamentos
<ol><li>Caixa de condicionamento do medo (Figura 1A)<ol><li>Utilizar uma câmara de condicionamento do medo (25 cm × 25 cm × 25 cm) fechada em uma caixa de atenuação de som (67 cm × 53 cm × 55 cm) (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Dois contextos (A e B) são necessários. Para o contexto A, crie listras pretas e brancas nas paredes anexando papelão plástico branco com fitas pretas (3 cm de largura, 4 em um tabuleiro). Use uma placa de plástico lisa branca para o chão.</li>
		<li>Limpe as paredes e o chão com Heptanol (1%) antes de cada sessão. NOTA: Nenhum sistema de ventilação ativa é usado. A limpeza com álcool no final da sessão diminui o odor de Heptanol.</li>
		<li>Para o contexto B, faça a aparência das paredes inteiramente preta, removendo a placa usada no contexto A. O piso é de grade. NOTA: Nenhum odor específico é apresentado além de um leve odor de álcool para limpeza.</li>
		<li>Iluminar a caixa experimental utilizando um diodo emissor de luz branca (LED, 240 lux) (ver Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
	<li>Choque<ol><li>Conecte um amortecedor de embaralhamento (consulte Tabela de Materiais) a um piso de grade composto por hastes de aço inoxidável. Isso é usado para fornecer choques nos pés. A intensidade de choque nos pés foi fixada em 0,9 mA, seguindo os métodos comuns de condicionamento do medo 10,11,12,13.</li>
	</ol></li>
	<li>Gerador de áudio<ol><li>Coloque um alto-falante (consulte Tabela de Materiais) no teto. Todos os estímulos acústicos são amplificados.</li>
		<li>Modificar e calibrar digitalmente as amplitudes totais de cada estímulo para produzir níveis de pressão sonora (NPS, re: 20 μ Pa) na frente de 5 cm do alto-falante com um microfone de 1/4 de polegada. Apresente uma explosão de tom contínuo através deste alto-falante. NOTA: Calibrar o alto-falante sonoro é crucial para examinar o impacto fino do estímulo sonoro nos comportamentos defensivos durante esse condicionamento de medo modificado.</li>
	</ol></li>
	<li>Transdutor<ol><li>Colocar o piso da câmara de ensaio num transdutor (ver Tabela de Materiais) para a detecção de vibrações. O sinal do transdutor é transmitido para uma placa de som com uma frequência de amostragem de 8 kHz para registrar as vibrações comportamentais.</li>
	</ol></li>
	<li>Câmera de vídeo<ol><li>Posicione uma câmera CMOS (consulte Tabela de Materiais) no teto para acompanhar os movimentos do sujeito e gravar o som na caixa de condicionamento.</li>
	</ol></li>
	<li>Sistema de acionamento<ol><li>Use um software de som (consulte a Tabela de Materiais) para acionar tons ou choques nos pés em horários programados. NOTA: Qualquer estimulador disponível comercialmente funcionará para isso.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Experiência comportamental
<ol><li>Planeje quatro dias de procedimentos de condicionamento do medo: habituação (1 dia, 5 tentativas), condicionamento (2 dias, 5 tentativas cada) e sessões de teste/extinção (1 dia, 5 ou 15 tentativas). Os intervalos interexperimentais variaram entre 60-75 s (Figura 1B). OBS: Preferencialmente, incluir dez ou mais sujeitos em um grupo para obter tendências comportamentais confiáveis. Dois ou três grupos são necessários, dependendo do objetivo do estudo.<ol><li>Durante a sessão de condicionamento, apresentar o estímulo incondicionado (US) (1 s, 0,9 mA) imediatamente após o término do estímulo condicionado (CS) (contínuo tone burst, 8 kHz, 20 s, 95 dB NPS) como mostra a Figura 1B. Entregue cinco pares CS-US em um dia de condicionamento.</li>
		<li>Após o término do 5º choque nos pés, deixe o sujeito no contexto por 1 min antes de devolvê-lo à gaiola de casa. Limpe a câmara com álcool 70% para limpeza após cada teste comportamental. OBS: A intensidade da CE e da US pode ser modificada dependendo do objetivo do estudo. Relatos anteriores mostraram que a intensidade mais forte do SC desencadeia comportamentos defensivos mais ativos do que os mais suaves15. Os dias de condicionamento também podem ser estendidos.</li>
	</ol></li>
	<li>Induzir comportamentos de voo durante as apresentações de CS seguindo o cronograma mencionado abaixo. NOTA: A CS (95 dB NPS) e a US (0,9 mA) são utilizadas neste experimento.<ol><li>No dia 1, exponha os sujeitos a 5 ensaios clínicos isolados de CE no contexto A.</li>
		<li>Nos dias 2 e 3, condicionar os indivíduos com 5 ensaios de associação CS-US no contexto B.</li>
		<li>No dia 4, expor os sujeitos a 5 tentativas isoladas de EC para a sessão de recordação no contexto B. Em caso de teste de extinção de memória, exponha os sujeitos a 15 testes de CS sozinhos. Observação : para testar a estabilidade da memória, estender sessões de extinção por 2-3 dias ajudará. Além disso, testar a memória uma semana depois, em vez de no dia 4, pode fornecer confirmação adicional da estabilidade da memória.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise de comportamentos defensivos
NOTA: O movimento, a porcentagem de congelamento e o número de saltos durante as apresentações de CS são analisados. Os detalhes estão descritos abaixo. Se possível, analisar de forma duplamente cega seria melhor.
<ol><li>Sincronize os tempos dos eventos no vídeo e os tempos dos estímulos (CS e US) usando o início do tom gravado no vídeo.</li>
	<li>Utilize um código feito sob medida para calcular os movimentos médios e totais dos mouses com base na diferença no centro de massa da silhueta do sujeito entre os quadros. NOTA: Uma unidade arbitrária é usada para essa medição, uma vez que a velocidade do movimento depende da taxa de amostragem do filme.</li>
	<li>Para medir a porcentagem de congelamento, use o sinal do transdutor em tempo.<ol><li>Pré-processe os sinais do transdutor usando um filtro passa-banda de 20-500 Hz.</li>
		<li>Calcular a raiz quadrada da amplitude quadrada média do sinal do transdutor em tempo para cada bino de 50 ms.</li>
		<li>Defina um limite para a amplitude do sinal para detectar o período de imobilidade. A duração da imobilidade é o período de sinal inferior ao limiar para mais de 1 s.</li>
		<li>Meça manualmente a duração do congelamento assistindo ao vídeo.</li>
		<li>Ajuste o limiar de amplitude do sinal para congelamento comparando a porcentagem de congelamento medida manualmente e a porcentagem calculada a partir do sinal do transdutor.</li>
	</ol></li>
	<li>Conte o número de saltos manualmente de arquivos de vídeo. NOTA: Contar o número de dardos também será útil para avaliar a resposta do voo.</li>
</ol>5. Análise estatística
<ol><li>Significância estatística estabelecida em p < 0,05.</li>
	<li>Para comparações entre múltiplos grupos e múltiplos fatores, realizar uma ANOVA multiway seguida de testes post-hoc. Se um dia específico do cronograma de condicionamento for testado, realize vários testes de comparação ou testes de permutação.</li>
</ol>

Estudando Comportamentos Defensivos Ativos em Camundongos com Condicionamento de Medo Modificado

<ol>
	<li>Fanselow, M. S., Lester, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Evolution and learning. , 185-212 (1988).</li><li>Fanselow, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+organization+of+the+defensive+behavior+system+responsible+for+fear.">Neural organization of the defensive behavior system responsible for fear.</a> Psychonomic Bulletin &amp; Review. 1 (4), 429-438 (1994).</li><li>Mobbs, D., Headley, D. B., Ding, W., Dayan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Space,+time,+and+fear:+Survival+computations+along+defensive+circuits.">Space, time, and fear: Survival computations along defensive circuits.</a> Trends in Cognitive Sciences. 24 (3), 228-241 (2020).</li><li>Black, D. W., Grant, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dsm-5+guidebook:+The+essential+companion+to+the+diagnostic+and+statistical+manual+of+mental+disorders.">Dsm-5 guidebook: The essential companion to the diagnostic and statistical manual of mental disorders.</a> American Psychiatric Pub. , (2014).</li><li>Bienvenu, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+fear+conditioning+as+an+animal+model+of+post-traumatic+stress+disorder:+Learning+from+the+past+to+shape+the+future+of+ptsd+research.">The advent of fear conditioning as an animal model of post-traumatic stress disorder: Learning from the past to shape the future of ptsd research.</a> Neuron. 109 (15), 2380-2397 (2021).</li><li>Johnson, L. R., Mcguire, J., Lazarus, R., Palmer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pavlovian+fear+memory+circuits+and+phenotype+models+of+ptsd.">Pavlovian fear memory circuits and phenotype models of ptsd.</a> Neuropharmacology. 62 (2), 638-646 (2012).</li><li>Yehuda, R., Ledoux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+variation+following+trauma:+A+translational+neuroscience+approach+to+understanding+ptsd.">Response variation following trauma: A translational neuroscience approach to understanding ptsd.</a> Neuron. 56 (1), 19-32 (2007).</li><li>Ledoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emotion+circuits+in+the+brain.">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23 (1), 155-184 (2000).</li><li>Gruene, T. M., Flick, K., Stefano, A., Shea, S. D., Shansky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexually+divergent+expression+of+active+and+passive+conditioned+fear+responses+in+rats.">Sexually divergent expression of active and passive conditioned fear responses in rats.</a> Elife. 4, e11352 (2015).</li><li>Fadok, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competitive+inhibitory+circuit+for+selection+of+active+and+passive+fear+responses.">A competitive inhibitory circuit for selection of active and passive fear responses.</a> Nature. 542 (7639), 96-100 (2017).</li><li>Hersman, S., Allen, D., Hashimoto, M., Brito, S. I., Anthony, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+salience+determines+defensive+behaviors+elicited+by+aversively+conditioned+serial+compound+auditory+stimuli.">Stimulus salience determines defensive behaviors elicited by aversively conditioned serial compound auditory stimuli.</a> Elife. 9, e53803 (2020).</li><li>Trott, J. M., Hoffman, A. N., Zhuravka, I., Fanselow, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+and+unconditional+components+of+aversively+motivated+freezing,+flight+and+darting+in+mice.">Conditional and unconditional components of aversively motivated freezing, flight and darting in mice.</a> Elife. 11, e75663 (2022).</li><li>Borkar, C. D., Fadok, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+pavlovian+fear+conditioning+paradigm+to+study+freezing+and+flight+behavior.">A novel pavlovian fear conditioning paradigm to study freezing and flight behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. 167, e61536 (2021).</li><li>Totty, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+brain+mechanisms+mediating+conditioned+flight+behavior+in+rats.">Behavioral and brain mechanisms mediating conditioned flight behavior in rats.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8215 (2021).</li><li>Furuyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+contribute+to+flight+behaviors+during+fear+conditioning.">Multiple factors contribute to flight behaviors during fear conditioning.</a> Scientific Reports. 13 (1), 10402 (2023).</li><li>Cain, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoidance+problems+reconsidered.">Avoidance problems reconsidered.</a> Current Opinion in Behavioral Sciences. 26, 9-17 (2019).</li><li>Ledoux, J. E., Moscarello, J., Sears, R., Campese, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+birth,+death+and+resurrection+of+avoidance:+A+reconceptualization+of+a+troubled+paradigm.">The birth, death and resurrection of avoidance: A reconceptualization of a troubled paradigm.</a> Molecular Psychiatry. 22 (1), 24-36 (2017).</li><li>Bouchekioua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+5-ht2c+receptor+knockout+in+mice+attenuates+fear+responses+in+contextual+or+cued+but+not+compound+context-cue+fear+conditioning.">Serotonin 5-ht2c receptor knockout in mice attenuates fear responses in contextual or cued but not compound context-cue fear conditioning.</a> Translational Psychiatry. 12 (1), 58 (2022).</li><li>Bouchekioua, Y., Nishitani, N., Ohmura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioned+lick+suppression:+Assessing+contextual,+cued,+and+context-cue+compound+fear+responses+independently+of+locomotor+activity+in+mice.">Conditioned lick suppression: Assessing contextual, cued, and context-cue compound fear responses independently of locomotor activity in mice.</a> Bio-Protocol. 12 (23), e4568 (2022).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

O protocolo modificado de condicionamento do medo introduzido neste artigo é um método estável para investigar comportamentos de voo em um contexto de medo. Ao empregar este protocolo, descobrimos que os comportamentos de fuga de camundongos no contexto de medo são desencadeados por estímulos salientes e dependem do contexto. As características do comportamento de voo não foram bem investigadas, pois não havia um protocolo adequado para observar os comportamentos de voo. Este protocolo será um dos métodos adequ...

<a href="https://app.jove.com/t/6598">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/66272">10.3791/66266</a>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/66266">Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice</a>. The Abstract section was updated.

Erratum: Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice

A seleção adequada de comportamentos defensivos em circunstâncias ameaçadoras é crucial para a sobrevivência de todos os animais. Os comportamentos defensivos mudam gradualmente de um para outro com base na proximidade da ameaça, como a transição entre os comportamentos de congelamento e fuga 1,2,3. A desregulação desses comportamentos é frequentemente observada em vários transtornosmentais4. O transtorno de estresse pós-traumático (TEPT) é um desses transtornos caracterizado por comportamentos defensivos exagerados, como respostas de pânico a estímulos não ameaçadores4.
O condicionamento clássico do medo em roedores é comumente usado como modelo para TEPT 5,6,7, mas os roedores não expressam comportamentos de voo (semelhantes ao pânico) nesse modelo8. Consequentemente, o modelo clássico de condicionamento do medo, muitas vezes referido como o "modelo de TEPT de roedores", carece de validade facial para TEPT em humanos, particularmente na captura de sintomas semelhantes ao pânico, que não foram bem estudados.
Recentemente, vários protocolos modificados de condicionamento do medo demonstraram com sucesso que os roedores exibem comportamento de voo durante esses procedimentos. Por exemplo, associações repetitivas de um estímulo condicionado (FC) e um estímulo incondicionado (US) sete vezes ao dia permitiram que ratas exibissem comportamentos de darting semelhantesaos comportamentos de voo9. Em dois dias de condicionamento de medo utilizando estímulos compostos seriados (ECE; composto de tom seguido de ruído), camundongos começaram a apresentar comportamentos de fuga durante a parte de ruído das apresentações de ECS 10,11,12. A descrição detalhada do método SCS é fornecida em um relatório de protocolo13. Um condicionamento de medo de três dias com SCS também funcionou para ratos induzirem comportamentos de voo14. No entanto, esses novos protocolos apresentam algumas limitações. Por exemplo, o uso da apresentação seriada de pistas não permite excluir a influência da estimativa de proximidade no comportamento defensivo. No caso de sete vezes a associação de US-SC em ratos, a maioria das respostas de voo foi observada em fêmeas e não em machos.
À luz dessas considerações, introduzimos um protocolo modificado de condicionamento do medo para camundongos para investigar comportamentos de voo em um contexto de medo. Camundongos machos exibem consistentemente comportamento de voo durante nosso condicionamento de medo modificado. Neste protocolo, o tom saliente é usado como o CS em vez de SCS. Além disso, é necessário um mínimo de cinco pares de CS-US em um dia por pelo menos dois dias, juntamente com a potencialização do medo pelo contexto condicionado. O protocolo fornece mais uma opção para investigar comportamentos de voo, complementando protocolos anteriores, dependendo do objetivo da pesquisa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Audio speaker</td>
			<td>Fostex</td>
			<td>FT17H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Sony</td>
			<td>TA-F500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera</td>
			<td>Sanwa Supply Inc.</td>
			<td>CMS-V43BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fear conditioning chamber</td>
			<td>Panlab S.L.U.</td>
			<td>LE116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food pellets</td>
			<td>Nosan</td>
			<td>Labo MR standard</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>Yamazen</td>
			<td>LT-B05N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microphone</td>
			<td>ACO</td>
			<td>type 4156N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scramble shocker</td>
			<td>Panlab S.L.U.</td>
			<td>LE 100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sound card</td>
			<td>Behringer</td>
			<td>UMC202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sound software</td>
			<td>Syntrillium Software</td>
			<td>Cool Edit 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer</td>
			<td>Panlab S.L.U.</td>
			<td>LE 111</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified fear conditioning for inducing flight behaviors in mice

A manifestação apropriada de comportamento defensivo em uma situação ameaçadora é fundamental para a sobrevivência. A teoria predominante sugere que um comportamento defensivo ativo, como saltar ou ousar rápido, é expresso sob alta ameaça iminente ou ameaça real, enquanto o comportamento defensivo passivo, como congelamento, é expresso quando a ameaça é prevista, mas a iminência da ameaça é relativamente baixa. No condicionamento clássico do medo, os indivíduos tipicamente exibem o congelamento como uma resposta defensiva condicionada, com pouca expressão de comportamento defensivo ativo na maioria dos casos. Aqui, apresentamos um procedimento modificado de condicionamento do medo para camundongos observarem a transição do congelamento para o voo e vice-versa, envolvendo cinco pares repetitivos de estímulos condicionados (CS; tônus contínuo, 8 kHz, 95 dB NPS (níveis de pressão sonora)) e estímulos não condicionados (US; choque podal, 0,9 mA, 1,0 s) durante dois dias. Este procedimento modificado de condicionamento do medo requer um número relativamente grande de sessões de condicionamento e dias de condicionamento, mas não requer um choque de pé de alta intensidade para expressão modesta do comportamento de voo. Usar o mesmo contexto para condicionantes e apresentações salientes de CS é essencial para eliciar comportamentos de voo. Este procedimento modificado de condicionamento do medo é um método confiável para observar comportamentos defensivos ativos em camundongos, fornecendo uma oportunidade para elucidar os mecanismos finos e características de tais comportamentos em um contexto de medo.

The appropriate selection of defensive behaviors under threatening circumstances is crucial for the survival of all animals. Defensive behaviors gradually shift from one to another based on threat proximity, such as the transition between freezing and flight behaviors1,2,3. Dysregulation of these behaviors is often observed in various mental disorders4. Post-traumatic stress disorder (PTSD) is one such disorder characterized by exaggerated defensive behaviors, like panic responses to non-threatening stimuli4.
Classical fear conditioning in rodents is commonly used as a model for PTSD5,6,7, but rodents do not express flight (panic-like) behaviors in this model8. Consequently, the classical fear conditioning model, often referred to as the &#39;rodent PTSD model,&#39; lacks face validity for PTSD in humans, particularly in capturing flight or panic-like symptoms, which have not been well-studied.
Recently, several modified fear conditioning protocols have successfully demonstrated that rodent subjects exhibit flight behavior during these procedures. For instance, repetitive associations of a conditioned stimulus (CS) and an unconditioned stimulus (US) seven times in a day allowed female rats to exhibit darting behaviors similar to flight behaviors9. In two-day fear conditionings using serial compound stimuli (SCS; composed of tone followed by noise), mice began showing flight behaviors during the noise part of SCS presentations10,11,12. The detailed description of the SCS method is provided in a protocol report13. A three-day fear conditioning with SCS also worked for rats to induce flight behaviors14. However, these new protocols have some limitations. For example, the use of serial cue presentation does not allow for the exclusion of the influence of proximity estimation on defensive behavior. In the case of seven times association of CS-US in rats, the majority of flight responses were observed in females rather than males.
In light of these considerations, we introduce a modified fear conditioning protocol for mice to investigate flight behaviors in a fearful context. Male mice consistently exhibit flight behavior during our modified fear conditioning. In this protocol, the salient tone is used as the CS instead of SCS. Additionally, a minimum of five pairings of CS-US in a day for at least two days, along with fear potentiation by the conditioned context, is required. The protocol provides another option for investigating flight behaviors, complementing previous protocols, depending on the research purpose.

Autor em destaque: Explorando correlatos neurais de comportamentos defensivos na aprendizagem e extinção do medo

Condicionamento de medo modificado para induzir comportamentos de voo em camundongos

1 We are investigating the neural correlation<v>2 for various defensive behaviors 3 in fear learning and extinction. 4 The present protocol could aid in the development 5 of new treatment for anxiety disorder 6 and post-traumatic stress disorder. 7 Our protocol uses two sound pressure levels 8 of conditioning stimuli to reset 9 freezing, darting, and flight.10 So our technique can assess various defensive behaviors 11 better than classical fear conditioning. 12 Our laboratory focuses on neural correlates 13 for fear learning and extinction. 14 The neural mechanisms of various defensive behaviors 15 to threats could support the development of new treatment 16 for anxiety disorder and PTSD.

Os resultados obtidos com o condicionamento do medo modificado em camundongos machos (C57BL/6J; 3-6 meses de idade) são apresentados, seguindo o esquema mostrado na Figura 1C. O experimento foi projetado para investigar como o contexto condicionado influencia a expressão de comportamentos de voo. Foram constituídos dois grupos: Grupo 1 (n = 10) e Grupo 2 (n = 10). Um SC (95 dB NPS) e um US (0,9 mA) foram utilizados neste experimento.
No dia 1, todos os camundon...

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Para estudar comportamentos de voo em um contexto de medo, introduzimos um protocolo modificado de condicionamento do medo. Esse protocolo garante que os camundongos exibam consistentemente comportamentos de voo durante a apresentação da pista no condicionamento do medo.

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active ...

modified-fear-conditioning-for-inducing-flight-behaviors-in-mice

Research

JoVE Journal

Behavior

Modified Fear Conditioning for Inducing Flight Behaviors in Mice

586 visualizações.  Kanazawa Medical University. 1 Estamos investigando a correlação neural2 para vários comportamentos defensivos 3 na aprendizagem e extinção do medo. 4 O presente protocolo pode ajudar no desenvolvimento 5 de um novo tratamento para transtorno de ansiedade 6 e transtorno de estresse pós-traumático. 7 Nosso protocolo usa dois níveis de pressão sonora 8 de estímulos condicionantes para redefinir 9 congelamento, dardo, e voo.10 Portanto, nossa técnica pode avaliar v...

Vídeo: Autor em destaque: Explorando correlatos neurais de comportamentos defensivos na aprendizagem e extinção do medo

The appropriate manifestation of defensive behavior in a threatening situation is critical for survival. The prevailing theory suggests that an active defensive behavior, such as jumping or rapid darting, is expressed under high threat imminence or actual threat, whereas passive defensive behavior, such as freezing, is expressed when the threat is predicted, but the threat imminence is relatively low. In classical fear conditioning, subjects typically exhibit freezing as a conditioned defensive response, with little expression of active defensive behavior in most cases. Here, we introduce a modified fear conditioning procedure for mice to observe the transition from freezing to flight and vice versa, involving five repetitive pairings of conditioned stimuli (CS; continuous tone, 8 kHz, 95 dB SPL (sound pressure levels)) and unconditioned stimuli (US; foot shock, 0.9 mA, 1.0 s) over two days. This modified fear conditioning procedure requires a relatively large number of conditioning sessions and conditioning days but does not necessitate a high-intensity foot shock for modest expression of flight behavior. Using the same context for conditioning and salient CS presentations is essential to elicit flight behaviors. This modified fear conditioning procedure is a reliable method for observing active defensive behaviors in mice, providing an opportunity to elucidate the fine mechanisms and characteristics of such behaviors in a fearful context.

To study flight behaviors in a fearful context, we introduce a modified fear conditioning protocol. This protocol ensures that mice consistently exhibit flight behaviors during cue presentation in the fear conditioning.

Comportamento

Induction of Modified Fear Conditioning in Mice for the Analysis of Flight Behavior

1 To begin, set up a fear conditioning chamber<v>2 enclosed in a sound-attenuating box. 3 Next, create two contexts:A and B.4 For context A, attach black stripes 5 on a white plastic board. 6 For context B, make the wall entirely black.7 Use an overhead white light-emitting diode 8 to illuminate the experimental box. 9 Then, connect a scramble shocker to a grid floor 10 with stainless steel rods. 11 Now fix a speaker onto the box's ceiling.12 Then, digitally modify and calibrate the amplitudes 13 of each stimulus. 14 Place the floor of the test chamber on a transducer 15 to detect vibrations. 16 Then place a CMOS camera on the chamber's ceiling 17 to track the subject's motion and record sound.18 Set up the sound software to trigger tones or foot shocks 19 at scheduled time intervals. 20 Plan four days of fear conditioning, 21 with the first day assigned to habituation, 22 the next two days allocated to conditioning, 23 and the last day assigned to test or extinction sessions. 24 For the conditioning session, 25 present the unconditioned stimulus 26 immediately after terminating the conditioned stimulus.27 After ending the fifth shock, 28 leave the subject in the context for one minute 29 before returning to its home cage. 30 To induce flight behaviors, on day one, 31 expose the subjects to five conditioned stimuli only 32 in context A.33 On days two and three, condition the subjects 34 with five conditioned and unconditioned 35 stimuli association trials in context B.36 On the last day, expose the animal to five trials 37 of only conditioned stimuli in context B.38 The group one mice displayed pronounced flight behaviors 39 on days three and four. 40 The total motion increased with increased conditioning.41 Freezing during conditioned stimuli increased on day two 42 and remained constant in subsequent trials. 43 The animals demonstrated increased movements 44 at the onset of the condition stimuli 45 and were consistent throughout. 46 The group two mice showed flight behaviors 47 almost identical to group one on days two and three.48 However, the animals did not show any flight behavior 49 during conditioned stimuli presentations in context A.50 The group one mice displayed significantly higher motion 51 and total number of jumps relative to group two. 52 However, the group two mice froze more.