Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer (1R21CA141039), BD Biosciences Research Award Grant, a Sociedade Americana de Câncer Research Grant Institucional (IRG # 58-006-53), para o Centro de Purdue University para o cancro Pesquisa, e do Canadian Institutes of a iniciativas de pesquisa Programa de Alberta Cancer Research Board e Saúde. MP foi apoiado pelo National Institutes of Health, National Cancer Institute, Cancer Prevention Programa de Estágio (R25CA128770; PI: D. Teegarden), administrado pelo Centro de Ciências Oncológicas e do Centro de Pesquisa de Aprendizagem Descoberta da Universidade de Purdue.

1. Preparação Prévia <ol><li> Mantenha pipetas sorológicas estéreis e pontas de pipeta a 4 ° C. Solução de problemas: géis Matrigel à temperatura ambiente (RT); usando pipetas frios e dicas impedirá Matrigel de gelificação durante a configuração da cultura. </li><li> Descongelar uma garrafa de Matrigel a 4 ° C durante a noite. </li></ol> 2. Preparação dos Reagentes <ol><li> Preparação da solução de fibronectina: Preparar uma solução de 1 mg / ml de caldo de fibronectina por dissolução de 100 mg de fibronectina humana em 100 ml de água destilada. Uma vez que a fibronectina se dissolva, o filtro esterilizado, alíquota, e armazenar a 4 ° C durante até 6 meses. Solução de problemas: se a fibronectina não se dissolve rapidamente incubar a solução durante alguns minutos, em um conjunto de banho de água a 37 ° C. </li><li> Preparação de 10x PBS: Dissolve-se 80 g de cloreto de sódio NaCl, 14,4 g de Na 2 HPO 4, 2 g de KCl e 2,4 g de KH 2 PO <sub&gt; 4 em 1 L de água destilada. Ajuste o pH para 7,4, filtro esterilizado, e armazenar a 4 ° C durante até 6 meses. </li><li> Preparação do tampão de neutralização 20: Preparar uma solução contendo 100 mM de HEPES em 2x tampão fosfato salino (PBS) utilizando HEPES 1 M e as soluções de reserva 10x de PBS. Ajustar o pH da solução para 7,0. Armazenar a 4 ° C por 2-3 meses. </li><li> Preparação de solução de 2 mg / ml de colagénio tipo I da cauda de rato: Preparar uma solução de 2 mg / ml de colagénio I no tampão de neutralização (passo 2.3). Vortex a solução em baixa velocidade e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo. Como este colágeno é muito viscoso, evitar a geração de bolhas de ar, enquanto a pipetagem. Recomenda-se a preparar solução de colágeno I fresco o tempo todo. Manter a solução em gelo até à utilização. </li><li> Preparação de revestimento endosteal (Rend): Mistura de 1 mg / ml de estoque de fibronectina com 2 mg / ml de colagénio I estoque (passos 2.1 e 2.4) para uma concentração final de 77 ug / ml e 29 ug / ml, respectivamente, em 1x &amp;# 160; PBS estéril. Misturar e armazenar a 4 ° C durante até 1 mês. </li><li> Preparação da matriz óssea reconstruída (RBM): <ol><li> Precool 1,5 ml microtubos em gelo. Mantenha todas as soluções de matriz sobre gelo em todos os momentos. </li><li> Misture 4 partes Matrigel (concentração Matrigel varia de lote para lote, mas as variações foram encontrados para ser insignificante), 2,5 partes de 1 mg / ml fibronectina e 1 parte de 2 mg / ml de colágeno I no gelo pela primeira pipetagem em Matrigel do tubo por meio de pontas de pipeta frio e, em seguida, adicionar a fibronectina e o colagénio I. Matrigel começará solidificar a temperaturas acima de 4 ° C, de modo que funcione rapidamente enquanto pipetando Matrigel. Misture a matriz muito suavemente pipetando cima e para baixo, evitar a introdução de bolhas. Manter os tubos em gelo, enquanto a mistura do RBM. </li></ol></li><li> Preparação do meio de crescimento da medula óssea (BMGM): Adicione 500 ml de BMGM contendo 6,2 x 10 -4 M de CaCl2, 10 succinato de sódio 6 M, de 10 -6 M de hidrocortisona, 20% de plasma humano (, e 1% de penicilina / estreptomicina normal ou maligno recolhido de dadores saudáveis ​​ou de doentes), em meio RPMI-1640. CaCl2, succinato de sódio, e suplementos de hidrocortisona pode ser armazenada a -80 ° C durante&gt; 6 meses como soluções stock x 1000. Ao crescer linhas de células, soro fetal de bovino (FBS) pode ser substituído por plasma humano. </li><li> Preparação de 10% formalina neutra tamponada (NBF): Adicionar solução de estoque de formaldeído 37% de 1x PBS a 10% v / v Misture bem e guarde em temperatura ambiente por 2-3 semanas protegido da luz. </li><li> Preparação de 1% de albumina sérica bovina (BSA): Pesar quantidade adequada de BSA e dissolvê-lo em PBS 1x. Armazenar a 4 ° C e utilizar no prazo de 1 semana. BSA solução tende a se contaminar se mantido refrigerado por períodos mais longos. Alternativamente, a solução de BSA pode ser divididos em alíquotas e congeladas a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. Evite ciclos de congelamento e descongelamento. </li><li> Preparação de solução de recuperação de células (CRS): Fazer EDTA 5 mM, vanadato de sódio 1 mM (Na &lt;solução sub&gt; 3 VO 4) e 1,5 mM de fluoreto de sódio (NaF) em PBS 1x. Filtro estéril e armazenar a 4 ° C até 6 meses. </li></ol> 3. Incorporado Cultura 3-D de Células BM Humano não malignas e malignas <ol><li> Purificar pilhas mononucleares BM por Ficoll-Plaque centrifugação em gradiente de acordo com as instruções do fabricante. Passo opcional: as células podem ser marcadas com 0,25 uM de diacetato de carboxifluoresceína, éster de succinimidilo (CFSE) segundo as instruções do fabricante para seguir a proliferação de células ao longo do período de cultura. Solução de problemas: Se as células morrem após coloração CFSE, titular a quantidade de CFSE como a concentração depende do tipo de célula; 0,25 mM funciona bem para pilhas mononucleares BM. </li><li> Adicionar 65 ml de solução de rend em cada poço de uma cultura tratada placa tecido 48 poços. Espalhar a solução uniformemente para cobrir toda a superfície do poço e incubar durante&gt; 30min à temperatura ambiente. </li><li> Prepare a suspensão de células a uma densidade de 0,5 x 10 6 células em 10 ul de 1x PBS por poço de uma placa de 48 poços. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml misturar a suspensão de células com 100 ul de matriz RBM por poço. Misture as células e matriz RBM cuidado pipetando para cima e para baixo; evitar a introdução de bolhas. Manter a mistura de células / matriz em gelo para evitar a gelificação da matriz. Nota: o sistema RBM é totalmente escalável, para configurar o sistema em um formato não-48-bem, ajustar as quantidades de todos os reagentes (matrizes e médio) com base na área da superfície da placa utilizada. Dimensionar o número de células a ser revestida em conformidade. </li><li> Aspirar o restante Rend e adicionar a mistura de células / matriz para o centro de um poço. Rapidamente, espalhou-se a mistura de células / matriz para cobrir toda a superfície do poço de forma uniforme. Colocar a placa durante 30-60 minutos em 37 ° C, 5% de CO 2 de tecido de cultura incubadora para permitir que a matriz para solidificar. Não agite ou disTurb a placa durante a incubação. Solução de problemas: Para evitar a distribuição desigual de células em RBM, misture bem antes de plaqueamento. Misturar após cada 5 th bem preparada para evitar células de decantação para o fundo do tubo. Uma vez banhado, as células não se afundam para o fundo do poço, devido à tensão superficial na matriz. Solução de problemas: Para evitar a distribuição desigual de células em RBM, misture bem antes de plaqueamento. Misturar após cada 5 th bem preparada para evitar células de decantação para o fundo do tubo. Uma vez banhado, as células não se afundam para o fundo do poço, devido à tensão superficial na matriz. </li><li> Pré-aquecer BMGM em um banho de água regulado para 37 ° C. </li><li> Após 30 minutos, verifique se a matriz não definiu corretamente, que irá formar um gel macio como camada que não se move quando a placa é inclinada. Sobreponha a camada de células / matriz com 1 ml de quente BMGM. Para evitar o rasgar da pipeta matriz do meio muito suavemente (distribuição gota-a-gota) usandouma pipeta serológica. Coloque a cultura RBM montado em um de 37 ° C, 5% de CO 2 de tecido de cultura de incubação e cultura para o período de tempo desejado. Nota: a viabilidade celular seja mantida durante pelo menos 30 dias, sem alterar médio, se for necessária uma mudança de meio apenas alterar 50% de meio de cada vez. Passo crítico: É fundamental que o meio não é frio como a temperatura fria possa perturbar a matriz já definida. Tome cuidado para não fazer jorrar o meio em cima da matriz em que poderia quebrar a camada de matriz macia. Solução de problemas: Se a viabilidade das células no sistema RBM é baixa, densidade celular pode ter que ser determinada experimentalmente quando se trabalha com diferentes células mononucleares primários de aspirados BM células. Quando trabalhar com as linhas de células, diminuir o número de células de 10 vezes, como as linhas de células imortalizadas proliferam mais rapidamente do que as células primárias. </li></ol> 4. Imagem &#39;In-matriz&#39; <ol><li><strong&gt; A microscopia de luz <ol><li> Imagem células cultivadas diretamente em RBM usando campo claro, contraste de interferência diferencial (DIC), confocal ou quaisquer outras técnicas de imagem que permitem imagens de longa distância como a matriz é de cerca de um milímetro de espessura. Use o recurso Z-stack disponível em muitos dos microscópios para a imagem de toda a cultura de cima para baixo. </li></ol></li><li> Imunofluorescência Dica: Para o protocolo immunostaining abaixo evitar aspiração de soluções de coloração / lavar, em vez inclinar o prato e retire soluções usando uma pipeta. <ol><li> Remover o BMGM usando uma pipeta e lava-se 2 a 3 vezes com 100 ul / lavagem / poço de RT de 1x PBS. Certifique-se de que um número suficiente de PBS é utilizado para cobrir toda a superfície do poço. </li><li> Fix células na matriz através da adição de 100 uL / ​​poço (para uma placa de 48 poços) de NBF a 10% durante 15 min à temperatura ambiente. Retirar NBF e lavar as células duas vezes com 100 ul / lavagem / poço de RT de 1x PBS. Nota: Evite o uso de frio NBF como pode liquefazer a matriz. </li><li> Remover PBS, adicionar 1% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente ou a 4 ° C durante a noite, a fim de bloquear a ligação não específica de anticorpos. </li><li> Preparar a solução de anticorpo primário em 1% de BSA a uma diluição necessária. Diluição irá variar para cada anticorpo, verifique com o fabricante ou o titular para determinar a concentração de anticorpos ideal. Adicionam-se 100 ul / poço de solução de anticorpo primário e incubar de acordo com as instruções do fabricante. Passo crítico: Todas as incubações envolvendo anticorpos conjugados com fluoróforos ou corantes fluorescentes deve ser realizada no escuro. </li><li> Retirar solução de anticorpo primário e lava-se 3x com 1x PBS durante 5 min. </li><li> Para coloração por imunofluorescência indirecta, incubar com um anticorpo secundário conjugado com marcador fluorescente durante 1 hora a RT. Dilui-se os anticorpos em BSA a 1% em concentração sugerido pelo fabricante. </li><li> Retirar a um derivadontibody solução e lavar 3x com 1x PBS durante 5 min. Solução de problemas: Para evitar a alta fundo durante o exame, titular anticorpos secundários conjugados fluorescentes e utilizar a menor concentração que fornece sinal é adequada. Se a alta fundo ainda é um problema, aumentar o número ea duração das etapas de lavagem, ou utilizar anticorpos primários diretamente conjugados, e ignore o passo 4.2.6. </li><li> Para corar os núcleos adicionar 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) de solução de coloração nuclear, na diluição recomendada pelo fabricante, e incubar durante 7-10 min à temperatura ambiente. </li><li> Retirar solução de coloração nuclear e lavar 2x com PBS 1x, durante 5 min. </li><li> Remover o PBS a partir da última lavagem e adicionar uma gota de meio de montagem (conjunto regular), por exemplo para preservar a fluorescência. Imagem usando as configurações de excitação / emissão adequadas em um microscópio fluorescente ou confocal. Nota: Imagem deve ser feito no prazo de 2 dias de coloraçãopara evitar a degradação da matriz e a perda da integridade e da perda de sinal fluorescente RBM. Se não fotografada imediatamente, as amostras coradas devia ser mantida a 4 ° C, protegida da luz, até imagiologia. </li></ol></li></ol> 5. Isolamento de Células de RBM <ol><li> Remova o meio suavemente, sem perturbar a camada de matriz. Não aspirar. </li><li> Lave as células 2x com PBS 1x estéril. Não aspirar. </li><li> Adicionar 0,5 ml de CRS gelada a cada poço e remover toda a camada da matriz, juntamente com as células, por vigorosamente pipetando para cima e para baixo. Coletar as células, matriz e CRS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Coloque no gelo. </li><li> Adicionar um adicional de 0,5 ml CRS para o mesmo bem e recolher todo o material restante. Transferência para o mesmo tubo de microcentrífuga. </li><li> Vortex da mistura de células, matriz e CRS e incubar no gelo por 1 hora. Células de vórtice cada 15 min para facilitar a libertação a partir da matriz. </li><li> Verifique a mistura depois de 1 hora, sem aglomerados visíveisde matriz deve estar presente. Solução de problemas: se contiver pedaços de matriz ainda são visíveis depois de 1 hora, as células de transferência / matriz / CRS mistura para um tubo maior, adicionar adicional 2-5 ml de CRS, e incubar por um 30-60 min. </li><li> Centrifugar células em CRS a 1.000 rpm para 5-10 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS 1x frio. </li><li> Centrifugar a 1000 rpm durante 5-10 min e remover o sobrenadante. Repetir a lavagem de PBS mais uma vez. </li><li> A segunda lavagem PBS completa a recuperação das células a partir da matriz e as células isoladas podem ser usadas para todas as aplicações a jusante, tais como o isolamento de DNA / RNA / proteína, a citometria de fluxo in vivo de transplante, etc. </li></ol>

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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

O modelo RBM fornece um sistema completo onde a composição celular da BM é mantida ex vivo por até 30 dias. BM células cultivadas em RBM auto-estratificar de acordo com a sua função mimetizando a arquitetura BM encontrado in vivo. Além disso, este é o primeiro sistema que permite a expansão do clone de mieloma múltiplo de 8. Os passos mais críticos para assegurar o crescimento robusto de células de MO e o sucesso global da cultura são: 1) para obter uma população saudável da...

A cultura de tecidos foi desenvolvido para estudar o comportamento de células num ambiente controlado, para minimizar a variabilidade sistémica quando se comparam diversos processos em organismos intactos. Este método foi estabelecido pela primeira vez no início de 1900 e 1,2 se refere a uma técnica onde explantes de tecido foram cultivadas ex vivo em um prato de vidro. Em meados de 1900 o sistema foi adaptado para cultivar células dispersas em vez de fragmentos de tecidos intactos, e &#39;cultura de tecidos »e de&quot; cultura de células &quot;tornou-se sinônimo 3. Nestes sistemas de cultura celular convencionais células são cultivadas na superfície de plástico de cultura de tecido revestida com meio de crescimento suplementado com vários factores de crescimento. Dois tipos de culturas surgiram com base na capacidade de adesão de várias células: A cultura de células aderentes, em que as células anexar e espalhada sobre o plástico de cultura de tecidos e as culturas não aderentes, em que as células são propagadas em suspensão. Desde os primeiros dias da célulacultura, várias linhas celulares imortais foram criados, tais como HeLa 4, a primeira linha celular de cancro humano. Estas linhas de células têm a capacidade de proliferar indefinidamente em cultura de células, e a maioria não necessitam de qualquer tratamento especial para manter a viabilidade. A abordagem redutora dos métodos de cultura de células originais foi concebido para simplificar o sistema, tanto quanto possível, incluindo apenas os componentes mínimo necessário para manter a viabilidade e a proliferação celular. No entanto, as abordagens de cultura de células simplificadas não suporta ex vivo a maioria dos tipos de células primárias humanas, com tempo de vida finito. Portanto, os novos sistemas de cultura estão a ser concebidos para aproximar o microambiente do tecido, tanto quanto possível, permitindo assim que explantes de células de crescer sob condições fisiológicas. Em contraste com as abordagens convencionais redutoras / cultura de células, 3-dimensional (3-D) de sistemas de cultura estão agora a tornar-se um método preferido para a cultura de forma eficiente várioslinhas de células humanas e células primárias para estudar posteriormente mecanismos envolvidos na saúde e na doença, no contexto de um microambiente de suporte. Tais sistemas 3-D são normalmente configurados usando matrizes e / ou médio reconstruídos suplementadas com fatores de crescimento, a fim de recapitular o microambiente do tecido para estudar os tipos de células de interesse. O primeiro destes três-dimensional (3-D) modelos de cultura foi desenvolvida para estudar o desenvolvimento da glândula mamaria. Para fornecer as células com condições nativas células epiteliais mamárias foram embutidos em Matrigel, colágeno IV e fonte rica em laminina de matriz extracelular (ECM), e coberto com meio de crescimento. Sob tais condições, as células epiteliais mamárias formado aglomerados que se assemelham a ácinos mamaria, e após estimulação com hormonas lactogênica, estes ácinos secretada caseína, e outras proteínas do leite, no Lumena oco das estruturas acini semelhante. Secreção de caseína não foi observada em culturas convencionais, mesmo após a adição de 5 prolactina, Enfatizando ainda mais o papel do microambiente em preservar as características morfológicas e fenotípicas das células. Outra demonstração da perda da função celular normal, quando as células são retiradas do contexto do seu microambiente fisiológico é uma demonstração que o microambiente sem suporte, queratinócitos não conseguem formar epiderme estratificada 6. Um número de outros modelos de 3-D, foram criados para permitir ex vivo a propagação de células primárias 7,8. O papel crucial dos microambiente no comportamento celular foi elegantemente demonstrada num estudo em que as células epiteliais mamárias formado &quot;inside-out&quot; ácinos quando cultivadas em matriz de colagénio I, em comparação com os ácinos correctamente polarizado que foram formados em Matrigel. Esta perda de morfologia adequada foi revertido quando as células mioepiteliais produtoras laminina foram adicionados às culturas de colagénio I 9. Além disso, microambiente correcta é necessário para a exactamanifestação genótipo. Crescido em um prato, as células cancerosas da mama MCF7 transfectadas com uma célula-célula molécula de adesão CEACAM1 comportam-se exatamente o mesmo que as células negativas CEACAM untransfected. No entanto, quando cultivadas em Matrigel, em contato com a ECM, estruturas semelhantes a tumores formulário wildtype MCF7 enquanto as células MCF-7 transfectadas com CEACAM1 reverter para um fenótipo e forma ácinos normais com Lumena oco, como tem sido estabelecida com nonmalignant epitélio mamário 10. Da mesma forma, o bloqueio em células de cancro da mama-integrina β1 não alterar o seu comportamento em condições padrão de cultura, mas a mesma experiência realizada em culturas de 3-D demonstra que o bloqueio da integrina β1 reverte células malignas para um fenótipo normal 11. Portanto, microambiente tecido não é apenas necessário para manter a viabilidade das células, mas também para manter o funcionamento adequado das células. Para além de proporcionar um sistema em que o comportamento de células pode ser estudado sob condições fisiológicass, culturas 3-D funciona meio como robusto e confiável para testes pré-clínicos de novas terapias 8,12,13. A cultura de células em 3-D permite a triagem de compostos de investigação sob as condições do ambiente mediado por droga-resistência 14, onde a contribuição de célula-célula e célula-ECM adesão poderia ser avaliado. Além disso, a toxicidade não-alvo de novos compostos pode ser determinada pela incorporação de múltiplos compartimentos celulares de vários tecidos. Essas telas podem ser realizadas mais rapidamente e são mais rentáveis ​​do que os estudos comparativos in vivo 8. Aqui apresentamos uma configuração de um modelo 3-D de medula óssea reconstruída (RBM), onde a medula óssea normal e maligno (BM), as células proliferam ex vivo em um sistema que imita de perto o microambiente da BM humano. Tentativas anteriores de crescimento de células primárias BM humanas em culturas de 2-D, líquido ou co-culturas aderentes com vários componentes do estroma BMOu 3-D, as culturas de ágar semi-sólidos tiveram um sucesso limitado devido à sua incapacidade para suprir as células com os componentes do microambiente tecido 15-18. Nestes sistemas de células de MO primários tinham viabilidade pobre e não conseguiram proliferar ex vivo. Um outro sistema em que as células progenitoras BM humanas são cultivadas em co-culturas de esferóide com células estromais da BM é um sistema de 3-D em que a viabilidade e proliferação de células estaminais hematopoiéticas foi mantida durante pelo menos 96 h 19. No entanto, apesar de altamente benéfico para a compreensão da biologia de células progenitoras hematopoiéticas, este sistema não recapitular fielmente o microambiente da BM, devido à ausência de componentes da matriz extracelular, por conseguinte, limita a sua utilidade. O modelo RBM aqui descrito apresenta um sistema global em que ambos os compartimentos celulares e extracelulares da BM humano são reconstruídos in vitro. Mostramos que as culturas RBM pode suportar ex vivo crescimento de células BM humanos normais, como nósll como células isoladas a partir de doentes com vários distúrbios hematológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="877">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">CellTrace CFSE proliferation kit-for flow cytometry</td>
			<td style="width:239px;">Invitrogen/Life technologies</td>
			<td style="width:108px;">C34554</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>NG1884448</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Matrigel basement membrane matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354234</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:328px;">Rat tail collagen type I</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:203px;">Collagen I from Millipore does not polimerize properly using this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Vectashield mounting medium for fluorescence (regular set)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4648</td>
			<td style="width:203px;">For TRAP staining</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">SigmaFast BCIP/NBT tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5655</td>
			<td style="width:203px;">For alkaline phosphatase staining</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss confocal LSM 510 microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">Zeiss 510 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for confocal analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">Zeiss Axiovert 200M inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">MetaMorph software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Image analysis software for Axiovert 200M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:328px;">FACSort flow cytometer&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:328px;">CellQuest Pro software&#160;</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td></td>
			<td style="width:203px;">Software for the analysis of flow cytometry data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional tissue culture model to study primary human bone marrow and its malignancies

A cultura de tecidos tem sido uma ferramenta valiosa para estudar vários aspectos da função celular, a partir de desenvolvimento normal para a doença. Os métodos de cultura de células convencionais contam com a capacidade das células, quer para fixar a um substrato sólido de um prato de cultura de tecido ou de crescer em suspensão num meio líquido. Várias linhas de células imortais foram criados e cresceram utilizando tais abordagens, no entanto, esses métodos falham freqüentemente quando pilhas precisam ser cultivadas ex vivo. Tal falha é atribuída à ausência de componentes de matriz extracelular apropriados do microambiente do tecido a partir de sistemas de cultura de tecido padrão em plástico é utilizado como uma superfície para o crescimento celular. A matriz extracelular é um componente integral do microambiente do tecido e a sua presença é essencial para a manutenção de funções fisiológicas, tais como a polarização celular, sobrevivência e proliferação. Aqui apresentamos um método de cultura de tecido 3-dimensional, onde cel medula óssea primárials são cultivadas em matriz extracelular formulado para recapitular o microambiente do osso humano (sistema RBM). Incorporado na matriz extracelular, as células são fornecidos com os nutrientes através do meio suplementado com plasma humano, proporcionando, assim, um sistema global em que a sobrevivência e proliferação das células podem ser mantidas durante 30 dias, mantendo a composição celular do tecido primário. Usando o sistema RBM que cresceram com sucesso de células de medula óssea primárias de dadores normais e de pacientes com amiloidose, e várias doenças malignas hematológicas. O sistema RBM permite a visualização directa, na matriz em tempo real do comportamento celular e da avaliação da eficácia pré-clínico de novas terapias. Além disso, as células podem ser isoladas a partir da RBM e subsequentemente utilizada para a transplantação in vivo, separação de células, citometria de fluxo, e de ácidos nucleicos e a análise de proteínas. Tomados em conjunto, o método RBM fornece um sistema confiável para o crescimento de marro ósseo primáriow células sob condições fisiológicas.

Uma vez que as células de medula óssea primária não proliferam em condições de cultura de tecidos padrão, o sistema RBM foi criado para imitar de perto o microambiente do osso, proporcionando um sistema de cultura e expandir células BM ex vivo. Os principais componentes da matriz extracelular BM, fibronectina, colagénio I, colagénio IV e laminina 21, foram incorporados em matriz RBM para fornecer o andaime estrutural para esta cultura em 3-D. Endósteo, o interface entre o osso e a BM, rico...

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A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Nos métodos padrão de cultura de células são retiradas do seu ambiente fisiológico e cultivadas na superfície de plástico de um prato. Para estudar o comportamento de células de medula óssea humana primária foi criado um sistema de cultura de 3-D, onde as células são cultivadas sob condições sintetizando o microambiente nativa do tecido.

A Cultura de Tecidos modelo tridimensional para estudar primária da medula óssea humana e suas Malignancies

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

16.6K visualizações.  Purdue University.  Nos métodos padrão de cultura de células são retiradas do seu ambiente fisiológico e cultivadas na superfície de plástico de um prato. Para estudar o comportamento de células de medula óssea humana primária foi criado um sistema de cultura de 3-D, onde as células são cultivadas sob condições sintetizando o microambiente nativa do tecido. 

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Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos Linhas tumor neuroendócrino de células como um modelo tridimensional para o estudo da terapia de tumores humanos Neuroendócrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Medicina

Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are attractive druggable therapeutic targets. Here we describe an efficient four-step strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in the treatment of acute leukemia. Initially, western blot analysis is used to confirm target inhibition in cultured leukemia cells. Functional activity is then evaluated using clonogenic assays in methylcellulose or soft agar cultures. Experimental compounds that demonstrate activity in cell culture assays are evaluated in vivo using NOD-SCID-gamma (NSG) mice transplanted orthotopically with human leukemia cell lines. Initial in vivo pharmacodynamic studies evaluate target inhibition in leukemic blasts isolated from the bone marrow. This approach is used to determine the dose and schedule of administration required for effective target inhibition. Subsequent studies evaluate the efficacy of the TKIs in vivo using luciferase expressing leukemia cells, thereby allowing for non-invasive bioluminescent monitoring of leukemia burden and assessment of therapeutic response using an in vivo bioluminescence imaging system. This strategy has been effective for evaluation of TKIs in vitro and in vivo and can be applied for identification of molecularly-targeted agents with therapeutic potential or for direct comparison and prioritization of multiple compounds.

Receptor tyrosine kinases are ectopically expressed in many cancers and have been identified as therapeutic targets in acute leukemia. This manuscript describes an efficient strategy for pre-clinical evaluation of tyrosine kinase inhibitors for the treatment of acute leukemia.

A avaliação pré-clínica da tirosina quinase inibidores para o tratamento de leucemia aguda

Receptor tyrosine kinases have been implicated in the development and progression of many cancers, including both leukemia and solid tumors, and are ...

Primary Culture of Human Vestibular Schwannomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in either sporadic or familial (neurofibromatosis type 2, NF2) forms, both associated with inactivating defects in the NF2 tumor suppressor gene. Treatment for VSs is generally surgical resection or radiosurgery, however the morbidity of such procedures has driven investigations into less invasive treatments. Historically, lack of access to fresh tissue specimens and the fact that schwannoma cells are not immortalized have significantly hampered the use of primary cultures for investigation of schwannoma tumorigenesis. To overcome the limited supply of primary cultures, the immortalized HEI193 VS cell line was generated by transduction with HPV E6 and E7 oncogenes. This oncogenic transduction introduced significant molecular and phenotypic alterations to the cells, which limit their use as a model for human schwannoma tumors. We therefore illustrate a simplified, reproducible protocol for culture of primary human VS cells. This easily mastered technique allows for molecular and cellular investigations that more accurately recapitulate the complexity of VS disease.

Vestibular Schwannomas (VSs) are non-malignant tumors of Schwann cell (SC) origin, associated with mutations in the NF2 tumor suppressor gene. We report a reproducible, efficient protocol for primary human VS cell culture that allows for molecular and cellular experimental manipulation and analysis and recapitulates the heterogeneous nature of human disease.

Cultura primária de Vestibular Humano Schwanomas

Vestibular schwannomas (VSs) represent Schwann cell (SC) tumors of the vestibular nerve, compromising 10% of all intracranial neoplasms. VSs occur in ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Tridimensional Cultura Ensaio para Explorar Cancer Invasividade celular e formação de tumor Satélite

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Using a Knee Arthrometer to Evaluate Tissue-specific Contributions to Knee Flexion Contracture in the Rat

Normal knee range of motion (ROM) is critical to well-being and allows one to perform basic activities such as walking, climbing stairs and sitting. Lost ROM is called a joint contracture and results in increased morbidity. Due to the difficulty of reversing established knee contractures, early detection is important, and hence, knowing risk factors for their development is essential. The rat represents a good model with which the effect of an intervention can be studied due to the similarity of rat knee anatomy to that of humans, the rat's ability to tolerate long durations of knee immobilization in flexion, and because mechanical data can be correlated with histologic and biochemical analysis of knee tissue.
Using an automated arthrometer, we demonstrate a validated, precise, reproducible, user-independent method of measuring the extension ROM of the rat knee joint at specific torques. This arthrometer can be used to determine the effects of interventions on knee joint ROM in the rat.

The goal of the protocol is to measure the extension range of motion of the rat knee. The effects of various diseases that increase the stiffness of the knee joint and the effectiveness of treatments can be quantified.

Usando um artrômetro de joelho para avaliar as contribuições de tecido-específica para contratura de flexão do joelho em ratos

Normal knee range of motion (ROM) is critical to well-being and allows one to perform basic activities such as walking, climbing stairs and sitting. Lost ...