Somos gratos aos cirurgiões do Departamento de Cirurgia Torácica e Cardiovascular, Clínica Universitária Tuebingen por nos fornecer as amostras de timo e Bruno Kyewski (DKFZ, Heidelberg, Alemanha) para fornecer o anticorpo CDR2. Gostaríamos também de agradecer a Hans-Jörg Bühring e Sabrina Grimm a partir da instalação de triagem (Universidade de Tuebingen). Este trabalho foi apoiado pelo SFB 685 e da Fundação Hertie.

<ol>
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V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells.">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).</li><li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathepsin+S+dominates+autoantigen+processing+in+human+thymic+dendritic+cells.">Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells.</a> Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).</li><li>Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. 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L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium.">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).</li><li>Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+MHC-peptide+matrix+of+central+tolerance+in+the+human+thymus.">Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus.</a> Nature Communications. , (2013).</li></ol>

Não há conflito de interesse declarados.

O protocolo aqui descrito é uma modificação do protocolo publicado por Gotter et al 4. As etapas críticas no protocolo são a condição e a preparação inicial do tecido, bem como a separação de densidade de Percoll. É altamente recomendável para processar o tecido, assim que possível após a colheita. É importante trabalhar rapidamente mas cuidadosamente durante a limpeza e corte do tecido. Durante a lavagem de timócitos descrito na etapa 2.3, é crucial para encontrar o equilíbrio cer...

O timo é o órgão em que o desenvolvimento de células T ocorre. O seu tamanho relativo e absoluto diminui com a idade, quando se torna sucessivamente substituído por gordura, embora a actividade do timo pode ainda ser detectado na velhice. A sua importância para a resposta imune foi demonstrado na década de 1960 1. O repertório de células T é formada através da interacção dos receptores de células T com complexos de peptídeo-MHC em diferentes tipos de APC do timo, que fornecem sinais de sobrevivência ou morte para o desenvolvimento de células T, resultando em um repertório de células T funcionais e são amplamente auto-tolerante 2. Aproximadamente 98% das células do timo humano estão a desenvolver células T referidos como timócitos. Os restantes 2% são constituídos por um número de diferentes tipos de células, incluindo uma variedade de TCE (cortical, medular, subcapsular), mielóide e plasmocitï DC (MDC, pDC), macrófagos, células B, células T re-circulação maduras, granulócitos, fibroblasts, células endoteliais e células epiteliais muito raras com um fenótipo de expressão semelhante ao de células de outros tecidos tais como o músculo, os neurónios e epitélio respiratório (Figura 1). Destes, TEC e DC são os principais tipos de APC encontrados em um timo normal. Nos últimos anos, a purificação destes tipos da APC para a cultura e perfil molecular ganhou mais e mais interesse. Devido à sua baixa frequência, o isolamento de qualquer um destes tipos de células para análise detalhada requer um processo eficiente, reprodutível e de baixo custo. O método aqui apresentado é uma modificação a partir de estudos publicados anteriormente 3,4. Tal como acontece com qualquer outro tecido, extracção a partir de células do timo pode ser conseguida por via enzimática a desagregar-célula e redes de interacção célula-matriz, a fim de obter uma suspensão de células individuais. Existem certos parâmetros, como uma boa eficiência de dissociação, o rendimento celular, viabilidade celular e retenção de célula smarcadores urface que são cruciais e devem ser otimizados para o isolamento de sucesso destas populações de células raras. Neste protocolo, o isolamento de DC e subconjuntos TEC é realizada através de uma suspensão de uma única célula do tecido por perturbação mecânica e de digestão enzimática. Usamos colagenase A de Clostridium histolyticum, que tem uma proporção equilibrada de diferentes actividades enzimáticas, para quebrar o colagénio nativo que mantém o tecido em conjunto. ADNase I está incluído na solução de enzima para reduzir a agregação das células, devido a ADN isento de células mortas (timócitos são muito sensíveis). Também proporcionam uma abordagem alternativa para a digestão enzimática do tecido típica envolve o tratamento de tecidos mecânica e enzimática assistida por um Dissociator tecido. A suspensão de célula única é então sujeito a uma única centrifugação de densidade de Percoll para o enriquecimento da fracção de baixa densidade (LDF) de células. A partir desta fracção de células, DC pode ser isolado através de coloração fou DC marcadores de superfície (isto é, CD11c +) e utilizando separação magnética ou de células activadas por fluorescência (FACS). Ao contrário das células linfóides que compreendem a maioria das células no timo, o TEC não expressam CD45 em níveis elevados, mas são positivas para a adesão da célula epitelial molécula EpCAM. CTECs pode ser distinguido do TCE medular pela expressão de um antigénio ainda indefinido reconhecido pelo CDR-2 (dendrítica reticulócitos-2 cortical) de anticorpo de 4,5 e um pouco menor expressão EpCAM. O diferencial de co-expressão de EpCAM e CDR2 permite o isolamento eficaz desses subconjuntos TEC através de células de elevada velocidade de triagem 6. O protocolo aqui apresentado é otimizado para o tecido do timo humano. A duração do processo depende da quantidade de tecido e a capacidade do experimentador, bem como a velocidade do classificador de células, se for utilizado separação FACS. Normalmente, o protocolo para o isolamento de DC pode ser concluída dentro de 5Hr -6 e para o isolamento do TCE em 8-10 horas. O isolamento de DC e subconjuntos do TEC a partir de tecido do timo é sensível ao tempo. Quanto mais rápido o processo de isolamento, a melhor o estado das células. Finalmente, as células isoladas podem ser utilizadas para outras investigações, como estudos comparativos de ARNm e a expressão da proteína, as experiências de PCR, o isolamento da proteína, o perfil molecular (isto é, transcritômica, análise de micro RNA), assim como a cultura de 6 células. Declaração de Ética A fim de ser capaz de trabalhar com o tecido do timo humano o pesquisador precisa obter a aprovação do comitê de ética local ou autoridades responsáveis, bem como um consentimento informado por escrito do doador (ou geralmente seus pais, uma vez que o tecido é geralmente obtida a partir de menor de idade crianças). Além disso, todos os tecidos humanos devem ser tratadas como sendo devem ser tomadas medidas potencialmente infecciosas e apropriados, tais como trabalhar com luvas, etc.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents and Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>H15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum-Gold</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>PAA</td>
			<td>K41-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 103 586 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I, grade II bovine pancreatic</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 104 159 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 10x in PBS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-001</td>
			<td>stock conc. 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Protein Labelling kit</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-10235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CDR2 (purified)</td>
			<td>Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Germany</td>
			<td></td>
			<td>labeled with Alexa Fluor 488</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD45 (Pacific Blue)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human EpCAM (APC)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human CD11c (PE)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PE Microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-048-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD45 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>for tissue dissociator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1.130 g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare, Life Sciences</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled Water (DNAse/ RNAse free)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamunex 10%</td>
			<td>Tajecris-Biotherapeutics</td>
			<td>G120052</td>
			<td>1:10 pre-dilution, use 20 &#956;l/1 x 106cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millex GS</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td>Syringe driven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td>Pump driven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml PC oak ridge centrifuge tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3118-0050</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml PP conical tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm x 75 mm 5 ml test tubes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td>FACS stainings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>INSTRUMENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Evolution R6 (rotor)</td>
			<td>Kendro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator REAX 2</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093 235</td>
			<td>tissue dissociator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus

Neste protocolo, proporcionar um método para isolar as células dendríticas (DC) e células epiteliais (TEC) a partir do timo humano. DC e TEC são a principal célula apresentadoras de antígenos (APC) tipos encontrados em um timo normal e está bem estabelecido que desempenham papéis distintos durante a seleção do timo. Essas células estão localizadas em microambientes distintos no timo e cada tipo APC representa apenas uma pequena população de células. Para melhor compreender a biologia destes tipos de células, a caracterização dessas populações de células é altamente desejável, mas devido à sua baixa frequência, o isolamento de qualquer um destes tipos celulares requer um procedimento eficiente e reprodutível. Este protocolo detalha um método para obter células adequadas para a caracterização de diversas propriedades celulares. Tecido do timo é mecanicamente perturbado e após diferentes passos de digestão enzimática, a suspensão de células resultante é enriquecida com um passo de centrifugação de densidade de Percoll. Para o isolamento de mielóide DC (CD11c &lt;sup&gt; +), células da fração de baixa densidade (FDL) são immunoselected por separação de células magnéticas. O enriquecimento de populações TEC (Mtec, CTEC) é alcançada por esgotamento de hematopoiéticas (CD45 hi), as células da fração de baixa densidade celular Percoll permitindo a sua posterior isolamento através de fluorescência de células ativadas (FACS) utilizando marcadores específicos de células. As células isoladas podem ser usadas para diferentes aplicações a jusante.

Como material de partida neste protocolo que usamos tecido do timo removido crianças submetidas à cirurgia cardiovascular corretiva (Departamento de Cirurgia Torácica e Cardiovascular da Universidade Tuebingen Clinic) obtidos após consentimento informado e sob as diretrizes institucionais. Este material descartado pode variar muito em tamanho 2-30 g ou mais. O número de subconjuntos e mDC TEC (CTEC e Mtec) que são obtidos depende do tamanho assim como da idade da amostra de tecido do timo para o isolamento. <p...

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Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

isolation-myeloid-dendritic-cells-epithelial-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.1K visualizações.  Hertie Institute for Clinical Brain Research.  Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse. 