Os autores gostariam de agradecer Guido Verhoeven e Ludo Deboel, Leuven, que foram extremamente útil para estabelecer o isolamento de células de Sertoli primárias no laboratório Meinhardt em Giessen. Monika Fijak, Gießen, é reconhecido por sua ajuda com a figura 1A e conselhos. Os estudos foram apoiados pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft através BH concessão 93 / 1-1 (SB) e financiamento do International Research graduado da faculdade JLU Gießen (Alemanha) / Universidade Monash (Melbourne, Austrália) GRK 1871 (SB). O suporte também foi obtido a partir de uma concessão do Estado de Hessen dentro do programa &quot;Exzellenz Landes-ofensiva zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer&quot; (LOEWE) chamou de &quot;Männliche Infertilität bei Infektion &amp; Entzündung&quot; (MIBIE).

Declaração 1. Ética animal Experimentos aqui descritos foram realizados de acordo com as diretrizes do Regierungspräsidium Giessen, Alemanha, como a autoridade local e confirme com o Código alemão de Prática para o Cuidado e Utilização de Animais para Fins Experimentais (Permissão não:. GI 20/23 Nr A 31 / 2012). 2. Preparação de Meios, soluções enzima e Animais <ol><li> Prepare 1% de álcool de iodo através da dissolução de 1 g de iodo em 100 ml de etanol. </li><li> Prepare 2x 500 ml de fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (PBS) sem Ca 2+ e Mg 2+ suplementado cada um com 7,5 ml de D-glicose (100 g / L) e 5 mL de 100 x penicilina / estreptomicina solução-mãe (15 mg / ml de D -glucose, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina final). </li><li> Suplemento 1x 500 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 5 ml de solução stock de 100 x penicilina / estreptomicina (50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina aletaai). </li><li> Prepara-se uma solução de tripsina-I ADNase (2,5 mg / ml de tripsina e 10 ug / ml de DNase I) por adição de 25 mg de tripsina e 0,1 ml de DNase I (1 mg / ml de DNase I) a 9,9 ml de PBS. </li><li> Dissolve-se 50 mg Inibidor de tripsina, em 5 ml de PBS para o inibidor de tripsina Uma solução (10 mg / ml). Dissolve-se 25 mg Inibidor de tripsina, em 10 ml de PBS para uma solução de tripsina inibidor B (2,5 mg / ml). </li><li> Para uma solução de colagenase-hialuronidase-desoxirribonuclease I (ADNase I) dissolver 10 mg de colagenase A (1 mg / mL de concentração final), 10 mg de hialuronidase (1 mg / mL final) e 0,1 ml de DNase I (1 mg / ml de DNase I) ( 10 ug / ml final,) em 10 ml de PBS. </li><li> Prepara-se uma solução de hialuronidase I-ADNase por adição de 10 mg de hialuronidase (1 mg / mL final) e uma solução de 0,1 ml de DNase I (1 mg / ml) (10 ug / ml final,) a 9,9 ml de PBS. </li><li> Encomendar ratos Wistar no tempo de modo que eles são 19 dias de idade no dia do isolamento de células de Sertoli. Nota: O protocolo descrito foi concebido para 10 ratos, mas pode ser modificado para um mínimo de 5 e um máximo de 20 ratos.Os volumes de todas as soluções têm de ser ajustados em conformidade. </li><li> Preparar a solução estoque Oil Red O dissolvendo 0,35 g Oil Red O em 100 ml de isopropanol. Agitar S / N, filtra-se através de 0,2 um e armazenar a temperatura ambiente durante até um ano. </li><li> Preparar solução corante Oil Red O misturando 6 ml de solução de estoque Oil Red O com 4 ml de água (3: 2). Após 10-20 minutos, filtra-se através de 0,2 um. Use no próximo 2 horas. </li><li> Prepara-se uma 4% (w / v) de solução de formaldeído em uma capa ventilado através da adição de 4 g de paraformaldeído em pó (PFA) a 80 ml de 1x PBS, enquanto se agitava gentilmente. Aquece-se a ~ 60 ° C, adiciona-se 1 ml de NaOH 1 M e continuar a agitar até que o paraformaldeído esteja dissolvido. Deixar a solução arrefecer até à TA, ajustar o pH a 7,4 com HCl 1 M e o volume para 100 ml com PBS 1x. Filtra-se a solução (0,45 um) e usar fresco ou armazenar em alíquotas a -20 ° C durante vários meses. Nota: formaldeído polimerizada (PFA) despolimeriza para formaldeído monomérico em água. Este processo écatalisada por aquecimento moderado e um pH ligeiramente alcalino. Preparar todas as soluções de enzima recentemente e filtro de esterilização (0,2 | iM) eles no dia da utilização. Se um fabricante diferente para uma enzima (veja Materiais / Equipamentos Table) é usado, cuidadosamente ajustar a sua concentração / atividade. No protocolo seguinte um &quot;pipeta&quot; significa uma pipeta serológica. </li></ol> 3. Preparação de seminíferos Palhinha <ol><li> 10 Anestesiar ratos Wistar do sexo masculino, uma a uma num exsicador utilizando CO 2 e uma taxa de fluxo que desloca, pelo menos, 20% do volume da câmara por minuto. Espere até que a respiração pára, a anestesia teste apertando a almofada do pé, e se não há reação eutanásia cada rato por deslocamento cervical. Drenar o sangue pelo corte da veia jugular e da artéria carótida (carotica vagina) sob água corrente. Desinfectar o abdómen, limpando com 70% de etanol. </li><li> Utilizando uma pinça levantar a pele do mus abdominalCiclos e cortar um lobo pele em forma oval que se estende a partir da sínfise púbica ao esterno (Figura 2A) e bater para cima sobre o peito. Em seguida, pegue os músculos abdominais e fazer uma incisão medial da sínfise púbica ao esterno. <ol><li> Espremer o abdômen com os polegares de pelve para cima, a fim de empurrar os testículos fora da parte baixa da bacia. Escolha a gordura epididimal (Figura 2B) com uma pinça para puxar para cima o testículo mais. Cortar o cordão espermático (Figura 2B), deixando intacta a túnica albugínea, e recolher todos os testículos em 20 mL de PBS num tubo de 50 ml (Figura 2C). </li></ol></li><li> Depois de recolher todos os testículos, desinfectar los por adição de um volume igual (20 ml) de 1% de iodo em etanol (v / w). Inverter o tubo duas vezes e decanta-se o sobrenadante imediatamente. Lavar os testículos rapidamente duas vezes com 25 ml de PBS de cada (Figura 2D). </li><li> Transferir os testículos para uma placa de Petri conterção 15 ml de PBS (Figura 2E). Segure cada testículo com firmeza por meio de fórceps em uma extremidade, fazer uma pequena incisão na túnica albugínea na extremidade oposta, e esprema os túbulos usando lâminas da tesoura fechados como uma ferramenta de raspagem. Nota: Os túbulos ainda deve formar um feixe em forma de testículo compacto, com apenas alguns túbulos que se prolonga para dentro da solução, a fim de permitir a digestão enzimática homogénea (Figura 2F). </li><li> Transfira os testículos capsuladas-de de um frasco de 100 ml com tampa de rosca contendo 10 ml de tripsina-DNase I solução. Realizar a digestão num banho de água com agitação a 32 ° C (120 oscilações / min). Após 4 min avaliar os túbulos com a olho nu para a dispersão dos túbulos. Uma vez túbulos começam a se dispersar na solução, parar a digestão imediatamente. Se necessário, continue a incubação por até 2 min. </li><li> Pare de digestão com tripsina, adicionando 5 ml de solução de inibidor de tripsina A. Misture bem a solução pipetando cima e para baixo 3-4 vezs usando uma pipeta de 10 mL e transferi-lo para um tubo de 50 ml. </li><li> Após 5 min de incubação observar os túbulos resolver por unidade de gravidade, remover o sobrenadante cuidadosamente usando a pipeta de 10 ml a partir do passo 3.6 e adicionar 10 ml de solução de inibidor de tripsina de B, a fim de parar totalmente a digestão com tripsina. Ressuspender os túbulos pipetando cima e para baixo 2-3 vezes. </li><li> De modo a remover a contaminação de células intersticiais lavar os túbulos 9 vezes com 25 ml de PBS cada uma. Ressuspender túbulos em cada lavagem, utilizando uma pipeta de 25 ml e permitir-lhes a resolver, por unidade de gravidade para 10 min. Sempre usar a mesma pipeta de 25 ml de PBS por pipetagem, ressuspensão e remoção do sobrenadante. </li></ol> 4. Remoção / Isolamento de células peritubulares (PTCs) <ol><li> Transferir todos os túbulos de um frasco de 100 ml com tampa de rosca e adicionar a solução de colagenase I-hialuronidase de ADNase (Figura 3A). Realizar a digestão durante 10 min num banho de água com agitação a 32 ° C (120 oscilações / min). </li><li> Pipeta uma gota de suspensão em uma lâmina de vidro e rapidamente verificar os túbulos sob um microscópio de luz invertida para cultura de células de rotina em 100x. Se a digestão não está suficientemente avançada continuar a incubação durante mais 2 min (não contam o tempo necessário para a verificação microscópica). Nota: Durante esta etapa, todos os túbulos se reduzido em comprimento e tubulares bordas devem tornar-se áspera (Figura 3B e C). arestas são indicativos para a liberação de células peritubulares. </li><li> Transferir a suspensão com túbulos digerido a um tubo de 50 ml utilizando a pipeta de 25 ml a partir do passo 3.8. Lavar o frasco de 100 ml com 10 ml de PBS e adicioná-lo aos túbulos no tubo cónico. Permitir que os túbulos digeridos resolver por unidade de gravidade durante 10 minutos e, cuidadosamente, aspirar o sobrenadante, contendo os PTCs, usando a 25 ml pipeta de novo, e transferi-lo para um novo tubo cônico. Para a aspiração dos últimos poucos mililitros utilizar uma pipeta de 5 ml em order para evitar qualquer carry-over de túbulos. </li><li> Adiciona-se 20 ml de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS) aos sobrenadantes recolhidos tubulares, misturar e centrifugar a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente sem utilizar a ruptura. </li><li> Cuidadosamente decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet PTCs em 20 ml de meio RPMI 1640 suplementado com FBS inactivado por calor a 10% e 4 ml de cada semente em cinco balões T75 contendo 16 ml de meio de cada um. Incubar a 37 ° C em 5% de CO2 (Figura 4A). </li><li> No dia 3 rd de cultura trypsinize os PTCs e dividi-los 1: 2 em frascos T75 contendo 16 ml de meio RPMI 1640 suplementado com FBS inactivado por calor a 10% cada (rendimento 10 frascos por completo) (Figura 4B). Continuar a incubação a 37 ° C em 5% de CO2. </li><li> No dia 5 dias de cultura das PTCs trypsinize novamente e placa-los em 6 poços ou 24 poços, placas, dependendo da experiência(Um frasco T75 por placa). Experiências pode ser realizado no dia 6. </li></ol> 5. Isolamento de células de Sertoli (SCs) <ol><li> Ressuspender os túbulos estabeleceram a partir do passo 4.3 completamente em 25 ml de PBS usando uma pipeta de 25 ml e permitir-lhes a resolver, por unidade de gravidade para 12 min. Use a mesma 25 ml de pipeta para pipetagem PBS, ressuspensão dos túbulos e remoção do sobrenadante. Repetir a lavagem 3 vezes (4 lavagens no total). </li><li> Após a última lavagem, transferir os túbulos digeridos com mais 100 ml com tampa de rosca frasco contendo a solução de hialuronidase-ADNase I. Realizar a digestão num banho de água com agitação a 32 ° C (120 oscilações / min). </li><li> Após 5 min verificar os túbulos novamente por inspecção microscópica de luz uma ampliação de 100X, tal como descrito na etapa 4.2. Nota: túbulos curtos, agregados tubulares e células libertadas devem ser visíveis (Figura 3D). <ol><li> Permitir que os agregados tubulares depositar durante 10 min, e aspirar o sobrenadante nósing uma pipeta de 25 mL. Lavar agrega 4 vezes utilizando 25 mL de PBS e um tempo de sedimentação de 10 minutos para cada etapa de lavagem (Figura 3E). </li></ol></li><li> Adicionar 20 ml de meio RPMI 1640 e passar a suspensão a 10 vezes através de uma agulha 18 G montado em uma seringa de 20 ml. Evitar bolhas de ar. Nota: Puxando a suspensão dentro e para fora através da agulha é considerado como uma passagem. A ruptura das células e a homogeneização por cisalhamento hidrodinâmico é uma técnica padrão na preparação de células que tendem a agregar-se. A passagem de células através de uma agulha hipodérmica de diâmetro interno pequeno é pouco provável que tenha um impacto sobre suas propriedades funcionais 25. Figura 5C e D mostra a ultra-estrutura normal das células de Sertoli purificadas no dia 4 de cultura. <ol><li> Pipeta uma gota de suspensão em uma lâmina de vidro e rapidamente verificar os túbulos sob um microscópio de luz invertida para cultura de células de rotina no aumento de 10x, se a aggRegates são todos dispersos (Figura 3F). Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 70 uM, a fim de se obter uma suspensão de célula única pura no filtrado. </li></ol></li><li> Centrifuga-se o filtrado do passo de 5,4 a 200 xg durante 10 min à temperatura ambiente sem utilizar a ruptura. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta de 25 ml, e voltar a suspender as células de Sertoli em 40 ml de meio RPMI 1640 (sem soro). </li><li> Misturar 100 ul de suspensão celular com 100 ul de azul de tripano e contagem de células mancha com uma câmara de Neubauer melhorada. Ajustar a concentração de células de 3 x 10 6 culas / ml de acordo com o resultado da contagem. Semente de 1 ml por cavidade em uma placa de 6 poços (= dia 1). Se uma coloração Oil Red O (passo 6) está previsto colocar uma lamela em um ou alguns poços antes da semeadura células de Sertoli. Nota: as células de Sertoli em suspensão assentar rapidamente, de modo que o tubo deve ser agitada brevemente antes de cada vez que um aliquota de células é feita com a pipeta. Até o dia 4 eles firmemente attACH o substrato. </li><li> A fim de remover as células germinativas flutuantes ou aderentes no dia 4 (Figura 4C) lavar cada poço das placas de 6 poços utilizados para cultivar células de Sertoli isolado (passo 5.6) com PBS (Figura 4D). Aspirar o meio, adicionar 1-2 mL de PBS a cada poço e agitar as placas de 6 poços horizontalmente sobre uma mesa vigorosamente, mas sem derramar PBS. Repetir a lavagem 3 vezes e executar o mesmo procedimento de lavagem no dia 5 e 6 (Figura 4E). Nota: No dia 4 células de Sertoli têm firmemente ligado e mostrar um paralelepípedo como padrão sob o microscópio de luz invertida (Figura 4C). As experiências podem ser realizadas a partir do dia 7 em diante. <ol><li> (Alternativa para o passo 5.7), durante a remoção de células germinais e de flutuação aderentes executar um choque hipotónico 3 dias após a sementeira em placas de 6 poços. Remover o meio e adicionar 1 ml de Tris 20 mM pH 7,5 levado diretamente para fora do frigorífico. Aspirar o tampão Tris, após 90 a 120 segundos, mas nãomais tarde. Lavar as células duas vezes com PBS, e adicionar 2 ml de meio RPMI 1640 (sem soro-). Opcionalmente, realizar experimentos no dia seguinte. Nota: A maior for a duração do choque hipotónico é mais células germinais pode ser removido, mas os mais células de Sertoli se perder bem. A primeira lavagem PBS deve ser efectuada rapidamente, mas com cuidado de modo a não deslocar quaisquer células de Sertoli. Imediatamente após o tratamento hipotónico numerosos vacúolos de tamanhos diferentes pode ser observada no citoplasma por meio de microscopia de contraste de fase. Vacúolos desaparecer dentro de algumas horas após o tratamento hipotónico. </li></ol></li></ol> 6. Oil Red O Coloração <ol><li> Execute todas as etapas na RT. No dia 7 de lavagem de células de Sertoli cultivadas em uma lamela (passo 5.6) com PBS duas vezes e corrigi-los com formalina a 10% em PBS. Depois de 10 min com uma solução de formalina a substituir fresco, e continuar a fixação durante mais 60 minutos. Nota: Todas as soluções são adicionadas ao poço (s) com uma lamela de cobertura e aspirado antes do passo seguinte. </li&gt; <li> Aspirar formalina, lavar as células duas vezes com água e adicionar 60% isopropanol. Após 5 min permitir que as células secar ao ar durante alguns minutos. </li><li> Adicionar 1 ml de solução corante Oil Red O por poço e incubar durante 10 min. Aspirar a solução, e lavar as células imediatamente 4 vezes com água e tampa de montagem desliza em glicerol-PBS (9: 1). Tome imagens de campo claro com um microscópio de luz de rotina (figura 4F). </li></ol> 7. Imunofluorescência Coloração <ol><li> Lavar PTCs (a partir do passo 4.5) ou a partir de células de Sertoli (passo 5.5) cultivadas numa lamela de cobertura com PBS duas vezes e corrigi-los com PFA a 4% durante 10 min à TA. </li><li> Incubar com 5% de BSA em PBS durante 1 h à TA. Descartar a solução de BSA-PBS e adicionar solução fresca de BSA-PBS contendo actina (músculo liso) (de PTCs) ou vimentina (para células de Sertoli) anticorpo primário (diluição 1: 100 para ambos os anticorpos) e incubar a 4 ° CO / N. Nota: A incubação com BSA bloqueia a ligação não especifica do anticorpo primário. </li><li> Lavar tampa desliza 3 vezes durante 5 min em PBS-0,1% de Tween 20 e incubar com anticorpo corante verde-fluorescente conjugado de cabra anti-ratinho secundário (diluição 1: 1000) à temperatura ambiente durante 1 h no escuro. </li><li> Lavar tampa desliza 3 vezes durante 5 min em PBS-0,1% de Tween 20 e montá-los em DAPI meio de montagem. </li></ol> 8. Análise ultra-estrutural <ol><li> Lavar as células de Sertoli (do passo 5,6) cultivadas numa placa de cultura de 6 células cm, com PBS e corrigi-los durante 2 horas a 4 ° C numa mistura de 2,5% de glutaraldeido, 2,5% de paraformaldeído e 0,05% de ácido pícrico em tampão cacodilato 67 mM ( pH 7,4) de acordo com Ito e Karnovsky 26. </li><li> Realizar pós-fixação em 1% de tetróxido de ósmio, seguido por uma incubação / N O em 0,3% de acetato de uranilo dissolvido em 50 mM de tampão maleato (pH 5). amostras incorporar ao incorporar mídia de acordo com os procedimentos padrão. Cortar seções finas, contrastá-los com citrato de chumbo e examinar com um microscópio eletrônico. </li></ol>

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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotransplantation+of+allogeneic+islets+with+allogeneic+testicular+cell+aggregates+allows+long-term+graft+survival+without+systemic+immunosuppression.">Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression.</a> Diabetes. 46, 317-322 (1997).</li><li>Fritz, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cell-germ+cell+relationships+in+mammalian+testes+during+development+and+spermatogenesis.">Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis.</a> Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).</li><li>Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+specific+response+elements+of+the+c-fos+promoter+and+involvement+of+intermediate+transcription+factor(s)+in+the+induction+of+Sertoli+cell+differentiation+(transferrin+promoter+activation)+by+the+testicular+paracrine+factor+PModS.">Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS.</a> Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).</li><li>Bhushan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uropathogenic+Escherichia+coli+block+MyD88-dependent+and+activate+MyD88-independent+signaling+pathways+in+rat+testicular+cells.">Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells.</a> J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).</li><li>Meinhardt, A., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+paracrine+and+endocrine+aspects+of+testicular+immune+privilege.">Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).</li><li>Fijak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Testosterone+on+Inflammatory+Response+in+Testicular+Cells+and+Expression+of+Transcription+Factor+Foxp3+in+T+Cells.">Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells.</a> Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).</li><li>Mamidi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+passing+mesenchymal+stem+cells+through+smaller+bore+size+needles+for+subsequent+use+in+patients+for+clinical+or+cosmetic+indications.">Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications.</a> J. Transl. Med. 10, 229 (2012).</li><li>Ito, S., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-glutaraldehyde+fixatives+containing+trinitro+compounds.">Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds.</a> J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).</li><li>Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pure+Sertoli+cell+cultures:+a+new+model+for+the+study+of+somatic-germ+cell+interactions.">Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions.</a> J. Androl. 5, 249-254 (1981).</li><li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+testis+in+immune+privilege.">The testis in immune privilege.</a> Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).</li><li>Jegou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sertoli+cell+in+vivo+and+in+vitro.">The Sertoli cell in vivo and in vitro.</a> Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).</li><li>Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+in+vitro+the+phagocytic+function+of+Sertoli+cells+in+the+rat.">Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat.</a> Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).</li><li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+the+importance+of+being+eaten.">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).</li><li>Ducray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+mouse+Sertoli+cell+line+producing+rat+androgen-binding+protein+(ABP).">Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP).</a> Steroids. 63, 285-287 (1998).</li><li>Konrad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+Sertoli+cells+express+epithelial+but+also+mesenchymal+genes+after+immortalization+with+SV40.">Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh...

Testículos produzem gametas masculinos e hormônios sexuais, ou seja, os andrógenos. O órgão é composto de dois compartimentos. No compartimento intersticial, que representa cerca de 10-12% do volume total de testículo 1, a esteroidogénese tem lugar no interior das células de Leydig. O compartimento tubular representa cerca de 60-80% do volume de testículo 1 e contém células germinais, de dois tipos de células somáticas - peritubulares células de Sertoli e as células. O testículo é dividido por septos de tecido conjuntivo em 250-300 lóbulos, cada um contendo 1-3 túbulos seminíferos altamente complicadas. Estes tubos são fechados por uma membrana basal, uma folha de colagénio, e uma camada periférica de células peritubulares (Figura 1A). O epitélio germinal está localizada no lado luminal da membrana basal. células de Sertoli são grandes células alongadas que se estendem por todo o epitélio germinal da membrana basal para o lúmen. Eles são fortemente attdoía para a membrana basal e formar uma folha contínua celular através de junções apertadas organizados basolaterais que oclui o epitélio germinal do interstício e representa a barreira hemato-testicular. células de Sertoli têm projeções citoplasmáticas proeminentes e ramificações que lhes permitam entrar em contato morfológica e funcional apertado com um número específico da espécie, mas constante de células germinativas. células-tronco germinais diplóides proliferam e se diferenciam em espermatogônias. Durante a meiose I curta duração espermatócitos tetraplóides são gerados que desenvolvem ainda mais em quatro espermátides haplóides durante a meiose II. Todas as células germinais são interligadas por pontes citoplasmáticas de modo que eles formam uma rede celular. O principal evento durante a maturação dos espermatídeos é a extrusão de grandes partes do citoplasma, formação de corpos residuais, num processo denominado spermiogenesis. organismos residuais são fagocitadas pelas células de Sertoli. spermatids tardias são, em seguida, liberado paraa luz tubular e transportado para o epidídimo para posterior maturação. células de Sertoli e células germinativas parecem coordenar mutuamente espermatogênese topograficamente e funcionalmente. Preparação de tipos de células testiculares individuais começou quase um século atrás, quando pequenos pedaços testiculares foram cultivadas e tipos de células identificadas por microscopia 2. Por dissecção cuidadosa dos túbulos após a abertura da túnica albugínea usando uma pinça de ponta fina foi mais tarde possível separar tubular e compartimentos intersticial 3. Em 1975 e Welsh Wiebe introduzido um tratamento de colagenase, a fim de libertar os túbulos de tecido aderente intersticial e um tratamento de pancreatina para a remoção da camada de células peritubular exterior 4. Desde cedo ratos jovens imaturos (cerca de 20 dias de idade) foram usadas no qual as células de Sertoli compreendem uma grande fracção da população celular tubular porque a espermatogénese ainda não começou. Neste Sert rato idadeoli células deixam de se dividir, e junções apertadas entre as células vizinhas formar de modo que a barreira hemato-testicular é estabelecida 5. Independente do galês e Wiebe Dorrington et al. Introduziram uma combinação de tripsina e desoxirribonuclease seguido por inibidor soybeen tripsina e tratamento colagenase, que foi publicado no mesmo ano 6. Ambos os grupos também utilizada força mecânica (desenho os fragmentos digeridos tubulares repetidamente através de uma agulha de seringa ou uma pipeta de Pasteur, respectivamente), a fim de produzir uma suspensão de células homogéneas para revestimento que contém aproximadamente 70% de células de Sertoli. Após 3 dias em cultura, utilizando um meio que é isento de soro, a percentagem de células de Sertoli aumenta para aproximadamente 90%. Isto poderia ser atribuído principalmente à morte de contaminar células germinativas. peritubulares células residuais (PTCs), no entanto, manter-se firmemente ligado através de sua matriz extracelular. PTCs, mas não de células de Sertoli, são conhecidos para produzirfibronectina que pode servir como uma proteína marcadora para estimar a contaminação com PTCs. Portanto, Tung et al. fundamentado que um tratamento adicional hialuronidase pode melhorar a pureza da fracção de células de Sertoli 7. Na verdade, eles poderiam mostrar que um tratamento adicional foi capaz de reduzir a contaminação por PTCs aproximadamente 20 vezes, o que se torna particularmente evidente quando em comparação com um meio contendo soro é utilizado para a cultura de células de Sertoli purificados. A partir de então o procedimento melhorado de Tung et al. tornou-se o protocolo vigente e foi amplamente utilizado por outros grupos importantes no campo 8 (Figura 1B). Durante o tratamento com colagenase a maioria dos PTCs são libertados e podem ser isolados em paralelo para células de Sertoli. Considerando que os PTCs vigorosamente proliferar e não respondem à hormona folículo-estimulante (FSH), células de Sertoli não sofrem mitose mais e responder aos FSH por alterações morfológicas característicose um aumento da adenosina monofosfato cíclico (cAMP) 9 concentração. Protocolos de digestão enzimática muito semelhantes pode ser usado para o isolamento de células de Sertoli primárias a partir de outros animais como o homem 10, 11,12 rato, hamster Siberiano 13 ou 14 Yak. Para a remoção de grandes quantidades de contaminantes de células germinais um choque hipotónico pode ser empregada, no final do procedimento de isolamento 15. Isto permite também o isolamento eficiente de células de Sertoli de testículos de rato adulto 16. Uma suspensão de células de Sertoli enriquecido também pode ser separado a partir de células germinais por plaqueamento da suspensão em pratos revestidos com lectina de aglutinina de Datura stramonium 17. Apenas as células de Sertoli e algumas PTCs residuais aderir às placas de lectina. culturas de células de Sertoli primário, principalmente a partir do rato, foram utilizados inicialmente para investigar a capacidade de resposta aos hormônios ou o estabelecimento de linhas celulares como o li células de Sertoline TM4 18. Esta linha celular foi investigada em mais do que uma centena de estudos até hoje. Numa abordagem as células de Sertoli de translação têm sido utilizados para a imuno-protecção de células e tecidos, como no processo de co-transplante de ilhéus pancreáticos alogénicos ou xeno- para a sobrevivência do enxerto a longo prazo co-cultivados sem imunossupressão sistémica 19. Células de Sertoli isolados foram também usados ​​em experimentos de co-cultura para o estudo epitelial-mesenquimal (células de Sertoli - PTCC) e de células somáticas de germes (células de Sertoli - células germinativas) interações 20, 21. Células de Sertoli recentemente primários foram utilizados para investigar a expressão de receptores de tipo Toll e a secreção de citoquinas pró-inflamatórias, bem como as cascatas de transdução do sinal que conduz à expressão de citocinas após infecção com E. não patogénico e uropatogênica coli 22. Outras investigações recentes estavam usando células de Sertoli para estudar testicular p imunológicorivilege 23 e demonstraram que a testosterona pré-tratamento suprime a resposta inflamatória induzida por LPS 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="813">
	<tbody>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:289px;">Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4</td>
			<td style="width:111px;">Dako</td>
			<td style="width:124px;">M0851</td>
			<td style="width:289px;">Monoclonal mouse anti human antibody. 
			Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Albumin bovine fraction V 
			Standard grade, lyophilized</td>
			<td style="width:111px;">Serva</td>
			<td style="width:124px;">11930.04</td>
			<td style="width:289px;">Filter (0.45 &#181;m) BSA solutions used for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Corning&#8482; Cell Strainers 70&#160;&#181;m</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:124px;">431751</td>
			<td>White color</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Collagenase A from Clostridium histolyticum</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">DAPI mountant ProLong&#174; Gold Antifade</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:124px;">P-36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">D-glucose</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">G8644</td>
			<td>100 g/l</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Dulbecco&#180;s PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">DNase I</td>
			<td style="width:111px;">Roche</td>
			<td style="width:124px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Electron microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td>EM 109S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:111px;">Zeiss</td>
			<td style="width:124px;">Axioplan 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Hyaluronidase from bovine testis</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Inverted light microscope</td>
			<td style="width:111px;">Olympus</td>
			<td style="width:124px;">CKX41</td>
			<td>Routine cell culture microscope</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal 
			secondary Antibody&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Life technologies</td>
			<td style="width:124px;">A-10684</td>
			<td>Alexa Fluor&#174; 488 conjugate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">O0625</td>
			<td style="width:289px;">Has replaced Sudan III and Sudan IV 
			because of brighter color.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">P6148</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:289px;">Penicillin (5,000&#160;U/ml)/ 
			Streptomycin (5,000 &#181;g/ml)</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15070-063</td>
			<td>100x solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">21875-034</td>
			<td>Contains 300 mg/L L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">T5266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:124px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:289px;">Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">T6522</td>
			<td style="width:289px;">The Sigma product is considerably cheaper than the previously used 
			BPTI (Aprotinin) from Roche.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:289px;">Vimentin antibody (V9)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:124px;">V6630</td>
			<td style="width:289px;">Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody.&#160; Use 1:100 dilution for immunofluorescence.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:289px;">Wistar WU rats</td>
			<td style="width:111px;">Charles River</td>
			<td style="width:124px;">N/A</td>
			<td>Should be 19 days old on day of experiment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of sertoli cells and peritubular cells from rat testes

O testículo, e em particular o gameta masculino, desafia o sistema imunológico de uma forma única, porque o esperma diferenciado aparecem em primeiro lugar no momento da puberdade - mais de dez anos após o estabelecimento da tolerância imunológica sistêmica. células espermatogénicas expressar um certo número de proteínas que podem ser consideradas como não-auto pelo sistema imunológico. O testículo deve, então, ser capaz de estabelecer a tolerância a estes neo-antígenos, por um lado, mas ainda ser capaz de proteger-se de infecções e desenvolvimento do tumor, por outro lado. Portanto, o testículo é um dos poucos lugares privilegiados do sistema imunológico do corpo que toleram os antígenos estranhos sem evocar uma resposta imune inflamatória prejudicial. células de Sertoli desempenham um papel chave para a manutenção deste ambiente privilegiado imune dos testículos e também prolongar a sobrevivência de células cotransplanted em um ambiente externo. Portanto, células de Sertoli primárias são uma importante ferramenta para estudar o privilégio imunitário do testículo que não pode ser easily substituídos por linhas celulares estabelecidas ou outros modelos de celulares. Aqui apresentamos um protocolo detalhado e abrangente para o isolamento de células de Sertoli - e células peritubulares se desejado - a partir de testículos de ratos em um único dia.

O procedimento descrito permite o isolamento de aproximadamente 12 x 10 7 células de Sertoli de testículos de ratos 10. 3 X 10 6 células são plaqueadas por cavidade em uma placa de 6 poços de modo a que seis a sete placas de 6 poços estão disponíveis para as experiências no dia 7. A tripsina-digestão com DNase I é o passo mais importante durante o isolamento de células de Sertoli. Se a digestão, neste ponto está avançando muito longe, a proporção de...

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Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

células de Sertoli primária são necessários para o estudo de testículo-imune privilégio, transdução de sinal durante a inflamação ou infecção, e a utilização das suas propriedades imunoprotectoras. Aqui, descrevemos um protocolo com base em enzima para o isolamento de células de Sertoli primário altamente purificadas e células peritubulares a partir de testículos de rato.

Isolamento de células de Sertoli e as células de rato peritubular Testículos

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

isolation-of-sertoli-cells-and-peritubular-cells-from-rat-testes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

22.3K visualizações.  Justus-Liebig-Universität Gießen.  células de Sertoli primária são necessários para o estudo de testículo-imune privilégio, transdução de sinal durante a inflamação ou infecção, e a utilização das suas propriedades imunoprotectoras. Aqui, descrevemos um protocolo com base em enzima para o isolamento de células de Sertoli primário altamente purificadas e células peritubulares a partir de testículos de rato. 

Vídeo: Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Isolamento de células de camundongo Peritoneal Cavity

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Seguindo o destino celular, em<em&gt; E. coli</em&gt; Após a infecção por um fago Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Isolamento de tecido adiposo de células imunes

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolamento de Murino Linfonodo células estromais

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...