Yazarlar uzman teknik destek için Amnis Corporation&#39;ın (EMD Milllipore parçası) Cincinnati Çocuk Hastanesi Araştırma Vakfı ve Richard Demarco, Sherree Arkadaşlar, ve Scott Mordecai de Araştırma Sitometrisi Core teşekkür. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen K08HL088126 ve R01HL116352 (TAK) verir ve P30 DK090971 (YZ).

Vitro Eritropoez Kültür 1. Uzun vadeli (Ex vivo eritroid Farklılaşma Kültür Protokolü Giarratana ve ark. Tarafından 8 Modifiye ve Fare Hücreler için uyarlanmıştır) Bu vitro eritropoezi protokolünde bir 3 adım uzun bir terimdir. İlk aşamada (gün 0-4) 2 x 10 5 hücre / ml kök hücre faktörü (SCF), interlökin-3 (IL-3) ve eritropoietin (EPO) ile desteklenmiş büyüme ortamında erythroblast yerleştirilir. İkinci aşama (gün 5-6), hücreler 2 x 10 &#39;de yeniden süspanse edilir 5 hücre / sadece Epo ile desteklenmiş taze erythroblast büyüme ortamı içinde yapışkan stroma hücreleri (MS5) hakkında ml, co-kültürlenmiştir. Üçüncü aşamada (gün 7-9) &#39;de, hücrelerin kadar enükleasyonuna sitokinlerin (Şekil 1A) olmadan taze erythroblast büyüme ortamı içinde MS-5 hücreleri bir tabaka üzerinde kültürlenmiştir. Tüm hayvan protokoller Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmışCincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi. <ol><li> Kemik ve düşük yoğunluklu kemik iliği hücrelerinin izolasyonu hasat <ol><li> 2 ml, 15 ml konik bir tüp içinde% 2 fetal sığır serumu (FBS) ihtiva eden steril IMDM ekleyin ve buz üzerinde tutun. </li><li> (Servikal dislokasyon örneğin CO 2 inhalasyon) kurum onaylı protokol aşağıdaki (veya ilgi genetik hedefli fare olmadan birlikte) 2-6 aylık yabani tip C57/BL6 fare Euthanize. </li><li> , Forseps ve neşter kullanılarak leğen kemikleri, femur ve her iki bacak fibula izole IMDM 2% FBS içeren tüp ekleyin ve buz üzerinde tutmak. </li><li> (25-G x birkaç kez yavaşça kemikler yoluyla 5/8 &quot;iğne. Flush IMDM +% 2 FBS ile forseps ve bir tüberkülin şırıngası kullanılarak bir steril akış sitometri tüp ve gömme kemiklerde 1 ml IMDM +% 2 FBS ekleme Hücre süspansiyonundan 500 ul ~ ve aspire) kemiği tekrar yıkama ve akış cytometr içine, kemik iliği hücreleri toplamak iley tüpü. Kemikler, beyaz göründüğünde Flushing tamamlandı. </li><li> 50 ml konik tüp üstünde bir 40-um hücre filtresi grubu boyunca hücre süspansiyonu filtre. IMDM +% 2 FBS ve aynı ortam 5 ml hücre süspansiyonu son seviyesini ayarlamak kullanılarak hücre süzgeç yıkayın. </li><li> Yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile, düşük yoğunluklu kemik iliği hücrelerini (ldbm) hazırlayın: dikkatlice orta 1,083 g / ml 750 x g, 15 ml&#39;lik bir tüp ve spin 25 için yoğunluk gradyan hücre ayrımı, 5 ml on hücre süspansiyonu 5 ml katman dk hayır fren / düşük bir ivme ile oda sıcaklığında (RT). </li><li> Aktarım süpernatan (her kadar 15 ml tüp içinde 2 ml işareti ince beyaz tabakayı elde etmek için ilgili olarak), yeni bir 15 ml&#39;lik tüpe ve 5 dk boyunca 525 x g &#39;de IMDM +% 2 FBS ile bir kez daha yıkama yerine RT. </li><li> Aspire edilen süpernatan ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3 ml RBC liziz tamponu içinde süspanse pelet olarak kalan herhangi bir kırmızı kan hücrelerini (RBC) lize edildi. Erythroblasts daha büyük bir saflık ise(Biyokimyasal çalışmalar için) örneğin, son aşamada gerekmektedir, manyetik ayırma ile Lin negatif hücrelere bu aşamada daha fazla ldbm hücrelerin saflaştırılması. </li></ol></li><li> Ldbm ya da Lin negatif hücrelerin başlangıç ​​Ex vivo erythroid farklılaşması kültür protokolü (Şekil 1A) <ol><li> Ekle 7 ml IMDM +% 2 FBS, 5 dakika oda sıcaklığında ve aşağıdakilerden oluşan, 2 mi erythroblast büyüme ortamı (EGM) &#39;de pelet hücreleri tekrar süspansiyon için 525 x g&#39;de santrifüj: a. Ihtiva eden StemPro-34 ortamı, b. 2.6% StemPro-34 orta ek, c. % 20 BIT-9500, d. 900 ng / ml demir sülfat, e. 90 ng / ml demir nitrat, f. 100 ünite / ml penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamin g. 10 -6 M hidrokortizon h. ve taze eklenen sitokinleri: i) 100 ng / ml SCF, ii) 5 ng / ml IL-3, ve iii) 3 IU / ml EPO. </li><li> Bir kenar ile bir otomatik hücre sayacı kullanılarak ya da el ile mikroskop de hücre sayımıocytometer. </li><li> / Oyuk EGM içinde, 2.5 ml (2 x 10 5 ldbm hücre / ml) bir son hacim ve 37 ° C&#39;de inkübe 5 x 10 5 hücre konsantrasyonunda, 6-yuvalı hücre kültürü plakasının Levha (bu kabul edilir kültürün gün # 0 gibi). </li><li> , Süpernatan aspire 1.5 ml, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 525 x g, iplik 3 sitokinler ihtiva eden ve 2. gün geri çukurlara her gün taze ortam ilave 1.5 ml ortam içinde yeniden süspansiyona ile değiştirme, 3, 4, optimize çoğalma fazı. 3. günde, bütün hücrelerini kaldırmak saymak ve ~ 2 x 10 5 hücre / ml de hücre konsantrasyonları sürdürmek için kuyu uygun sayıya bölünür. 37 ° C /% 5 CO 2 kültürünü korumak. </li><li> 4. günde, yeni bir hücre kültür 6-çukurlu bir levhanın çukurlarına plaka MS5 hücrelerinin (murin hücre hattı). MS5 hücre kültür ortamı,% 20 FBS ihtiva eden, 100 birim / ml penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin, MEM-α edilir. </li><li> 5. günde, sayı saymak, otomatik bir hücre sayacı ya da el ile bir hemositometre kullanılarak bir mikroskop ile kullanarak, orijinal kültür plakasının her çukuruna hücreler (şimdi önemli ölçüde eritroblastta zenginleştirilmiş). </li><li> Her kuyudan tüm hücreleri kaldırın ve 15 ml konik tüplere aktarın, oda sıcaklığına, aspirat yüzer, 5 dakika boyunca 525 x g hızında aşağı spin ve 2 x 10 bir konsantrasyona kadar sadece Epo (3 IU / ml) ihtiva eden taze EGM ile granül çözülür 5 hücre / ml. </li><li> MS-5 hücreleri bir önceki gün, (ko-kültür esnasında 70-80% konfluansa kadar hedefli) kaplama ve tek EPO içeren EGM bu kuyularda eritroit hücreleri eklemek takımından kuyulardan aspire süpernatan (değil orta bölgesinin her ne seçim, MS-5 hücreleri) birkaç gün EGM iyi hayatta. </li><li> Gün içerisinde 6. taze EPO ekleyerek orta değiştirin. </li><li> Hiçbir ekledi sitokinler ile EGM kullanarak, günlük # 7 orta değiştirin. Günlerde 7 ile 9, sitometri günlük anti-Ter119 ve Syto-16 ile boyanarak ve p sonra akışı ile enükleasyon için test örnekleriMulti-Spektral Görüntüleme Sitometrisi (3. bölümde ayrıntılı olarak) için numune boyama için roceed. Not:. Günde 2, 4, 6, ve kültür on 7 kaplama ve önce sitometri boyutu (FSC) vs yüzey belirteçleri CD44 ve Ter119 değerlendirerek akışı ile erythroblast zenginleştirme ve farklılaşması için kültür hücreleri izlemek 9 Alternatif CD71, Ter119 ve FSC Ayrıca, 10, 11 kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 2.. Hızlı Enükleasyon Assay, Yoshida ve arkadaşları tarafından tanımlanan Protokolüne göre. Değişiklikler 12 (Şekil 1B) <ol><li> In vitro eritropoezi kültürü Stres erythropoiesis indüksiyon ve stroma hücre hazırlama <ol><li> IACUC kurallarına başına 2-6 aylık bir vahşi tip C57/BL6 fareyi (örn. izofluran çözeltisi ile) anestezisi. Fare yeterince nazik bir arka-pençe tutam refleksif tepkilerin olmaması için ve kontrol ile anestezi edilmiş olduğundan emin olunİşlem sırasında normal solunum. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner oftalmik merhem kullanın. </li><li> 500 ul son hacim olması için kuyruk kanatması yoluyla eritrosit stres neden. Bir insülin şırınga kullanarak, periton hayvanın sıvı resüsitasyon (enjekte önce Trendelenburg pozisyonda hayvan tutun ve iç organlara zarar vermemek için alt karın enjekte) sağlamak için normal tuz eşit miktarda enjekte. </li><li> Kafesin etrafında hareket etmeye başlayan ve düşmeden durmak ve yürümek mümkün olan hayvan tarafından belirtildiği gibi motor kontrol kavuşana kadar sahipsiz fareyi bırakmayın. Phlebotomized fare, diğer fareler olmayan bir kafese yerleştirilir. </li><li> 2 gün sonra, 24-gözlü hücre kültür tablası çukurundaki MS-5 hücreleri plaka. MS5 hücre ortamı içinde 37 ° C /% 5 CO2 ile MS-5 hücreleri inkübe (a-MEM% 20 FBS ihtiva eden, 100 birim / ml penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin) amacı ile 70-80 olduğu % confluent i48 saat sonra n plaka kuyuları. </li></ol></li><li> Dalak ve splenositlerin işlenme hasat <ol><li> Dört gün (96 saat) stres eritropoez indüksiyon sonrası, önceden IACUC onaylı protokol (servikal dislokasyon örneğin CO 2 inhalasyon) yoluyla fare kanadı Euthanize. </li><li> Hasat dalak ve IMDM% 2 FBS içeren 15 ml konik tüp içine koyun ve buz üzerinde tutmak. </li><li> Geri laboratuarda, steril koşullar altında, doku kültürü kaputu, 50 ml tüp üzerine oturtulmuş bir 40-mikron hücre süzgecinden dalak içeren tüp ters. 5 ml&#39;lik plastik şırınga pistonu kullanarak dalak ez. </li><li> IMDM +% 2 FBS ile hücre süzgeç yıkayın ve aynı ortam kullanılarak, 5 ml hücre süspansiyonu son hacim ayarlayın. </li><li> Dikkatle 5 ml yoğunluk gradyan hücre ayrılmasına 5 ml süspansiyon splenosit orta tabaka, fren / düşük bir ivme ile oda sıcaklığında 25 dakika boyunca 750 x g&#39;de 15 ml tüp ve spin 1.083 g / ml. </li><li> Transferyeni bir 15 ml&#39;lik tüpe ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 525 x g &#39;de IMDM +% 2 FBS ile bir kez daha yıkama yerine supernatant (buffy coat elde etmek amacıyla, 15 ml tüp içinde 2 ml işaretine kadar yaklaşık çözelti) . </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3 ml RBC liziz tamponu içinde süspanse edilmesi suretiyle pelet süpernatan aspire ve kırmızı kan hücrelerinin lize. </li><li> Hücreleri yıkamak için ve seyreltilmesi ve, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 525 xg&#39;de RBC liziz tamponu ve spin nötralize 7 ml IMDM +% 2 FBS ekleme </li><li> Aspire edilen süpernatan ve erythroblast büyüme ortamında (EGM) 2 ml pelet hücrelerin süspansiyonu. </li></ol></li><li> Plastik eritroblastta zenginleştirilmiş izole düşük yoğunluklu splenositlerinin, (hızlı, in vitro erythropoiesis kültürünün ilk aşaması) Kültür <ol><li> Otomatik hücre sayıcı veya elle bir hemositometreyle hücreleri saymak. Bu aşamada, dalak başına izole edilen hücre sayısı olağan ~ 15 x 10 6&#39;dır. </li><li> F (sitokinler ihtiva eden daha başka EGM hücreleri Askıyainal konsantrasyonlar): SCF 50 ng / ml, IL-3, 5 ng / ml, ve EPO 2 U / ml. </li><li> / A 24-iyi hücre kültür plakasının 1 ml / oyuk (de, toplam hücre sayısına bağlı olarak ortalama hücre aynı sayıda) bir nihai hacim içinde ve 37 ° C &#39;de O / N inkübe Plate 1-5 x 10 6 hücre % 5 CO 2. </li></ol></li><li> MS5 hücreleri üzerinde erythroblasts (hızlı in vitro erythropoiesis kültürünün ikinci aşama Kültür <ol><li> Aspire de plastikten süpernatan ve her bir kuyucuğa, buz üzerinde 5 dakika boyunca PBS içinde soğuk 10 mM EDTA, 2 ml eklenerek (son derece eritroblastta zenginleştirilmiş) hücreleri kaldırın. </li><li> (Sitokinler) olmadan EGM kez yıkama ve aynı tekrar süspansiyon, yeni tüplere hücreleri koyun. </li><li> Bir 1-2 ml hacim içinde Plaka 5 x 10 5 -1 x 10 6 hücre her MS5 hücre kaplı 24 yuvalı plakanın. Farmakolojik inhibitörleri deneyde kullanılan, şimdi uygun konsantrasyonlarda ekleyebilirsiniz. </li><li> Tarafından yönlendirilen 6 ila 8 saat (zaman inkübemuamele edilmemiş WT örneğinde yaklaşık 30% -40% enükleasyonunu) mikroskopik gözlem. MS-5 hücreleri için eritroblast bağlanma kendi enükleasyonunu hızlandırır. </li><li> Buz üzerinde 5 dakika boyunca, soğuk PBS + 10 mM EDTA, 2 ml ilave etmek suretiyle, her kuyudan alınan hücreler, kaldırın. Erythroblasts ile birlikte, MS-5 hücreleri de tahsil edilecektir ancak bu daha sonra kolayca FSC hi Ter119 gibi akış sitometri analizi sırasında dışlanan olabilir - hücreler. </li><li> Bu aşamada hücreler, multi-spektral Görüntüleme Akım Sitometrisi ile analiz için sabit ve boyanmış olabilir. </li></ol></li></ol> 3. Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enükleasyon sırasında hücre içi proteinlerin veya lipid sallar Lokalizasyonlarının için eritroblastlarda boyanması <ol><li> PBS&#39;de hücreleri yıkayın 5 dakika oda sıcaklığında ve süpernatan aspire 525 xg dönerler. </li><li> (Tespit zaman anti-bağlı olarak değişebilir, 15 dakika boyunca PBS içinde% 3.7 formaldehit 500 ul hücre pelletleri yeniden süspanse hücreleri saptamakgen problanmış) ve yavaşça pipetleme ediliyor. </li><li> 1.5 ml&#39;lik plastik santrifüj tüplerine aktarılır ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 20 saniye, aspire süpernatant ve yavaşça her tüp ve pipet 500 ul PBS ekleyerek bir yıkama gerçekleştirmek için bir tezgah mikrosantrifuj 2.000 xg Spin. </li><li> 20 sn, aspire süpernatant için bir tezgah mikrosantrifuj 2.000 xg üzerinde Spin ve en az 15 dakika boyunca buz üzerinde tüpler tutmak. Permeablization 3.6-3.9 hızlı ve verimli yapılması gerektiğini, ve oda sıcaklığında iplik / aspirasyonu takiben hücre topakları hemen hücrelerin daha iyi kendi bütünlüğünü korumak için sırayla, buz üzerinde geri koymak gerekir adımları. </li><li> -20 ° C dondurucu aseton çözümler alın ve buz koymak. Yavaşça 500 ul buz soğukluğunda% 50 aseton (2 O dH ile 1:1) pipetle ilk hücre pelletleri yeniden süspanse hücreleri geçirgenliği. </li><li> Tezgah mikrosantrifiijde Spin 500 ul 20 sn, aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelet 2.000 xg60; hafifçe pipetleme buz soğukluğunda% 100 aseton. </li><li> Tezgah mikrosantrfuj on Spin hafifçe pipetleme 500 ul buz soğukluğunda% 50 aseton içerisinde bir kez daha 20 saniye, aspirat supernatant ve tekrar süspansiyon hücre topakları için 2000 x g. </li><li> Tezgah mikrosantrfuj Spin 2000 20 saniye boyunca xg, süpernatan aspire ve yavaşça pipetleme soğuk FACS tampon maddesi (PBS +% 0.5 BSA) içinde bir kere hücreleri yıkayın. </li><li> Ilgi molekülleri için antikorlar veya işaretleri ile etiketleme kokteyli hazırlayın: eritroid hücre boyama F-aktin boyama ve 1 μl/100 ul Ter119-PECy7 için 0.1 U/100 ul AF488-Phalloidin. Alternatif ya da ek boyama da (01:50), AF-594-konjüge edilmiş kolera toksin alt-B lipid sallar etiketlemek için (1:200), anti-pMRLC (Ser19) AF-488-anti-β-tubulin antikoru kullanılarak yapılabilir fosforile miyosin hafif düzenleyici anti-tavşan AF-488-konjuge ikincil antikoru (1:400) ve ardından zincir (1:50), ve anti-γ-Tomar yay için birincil antikorlin primer tavşan antikoru (1:100) anti-tavşan AF-555-konjuge ikincil antikoru (1:300) eklenmiştir. </li><li> Süpernatan aspirasyon sonra, yavaşça işaretleyici kokteyl, pipet, 100 ul hücre topakları tekrar süspansiyon ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Nükleer leke Draq5 2.5 mcM içeren FACS tampon hazırlayın. </li><li> Tezgah mikrosantrifiijde üzerinde Draq5 içeren 60 ul FACS tamponunda 20 saniye, aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon için 2.000 xg aşağı spin, FACS tampon hücreleri yıkayın. </li><li> Görüntüleme çalıştırın örnekleri görüntüleme özgü analiz yazılımı akış sitometresi kullanılarak, deney başına en az 10.000 olay toplamak, daha önce yayınlanmış 13 gibi ham veri dosyalarını telafi etmek, ve Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi sonuçlarını analiz etmek akış sitometresi. </li></ol>

<ol>
	<li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+&amp;#34;pyrenocytes&amp;#34;+in+the+mammalian+fetus.">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &amp;#34;pyrenocytes&amp;#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li><li>Chasis, J. A., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroblastic+islands:+niches+for+erythropoiesis.">Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis.</a> Blood. 112, 470-478 (2008).</li><li>Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+distribution+and+function+during+the+maturation+and+enucleation+of+mammalian+erythroblasts.">Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts.</a> J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).</li><li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2.">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).</li><li>Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+trafficking+plays+a+novel+role+in+erythroblast+enucleation.">Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation.</a> Blood. 116, 3331-3340 (2010).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Konstantinidis, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+cytoskeletal+requirements+in+erythroblast+enucleation.">Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation.</a> Blood. 119, 6118-6127 (2012).</li><li>Giarratana, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells.">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li><li>Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).</li><li>Kalfa, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+and+Rac2+GTPases+are+necessary+for+early+erythropoietic+expansion+in+the+bone+marrow+but+not+in+the+spleen.">Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen.</a> Haematologica. 95, 27-35 (2010).</li><li>Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine-dependent+engulfment+by+macrophages+of+nuclei+from+erythroid+precursor+cells.">Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells.</a> Nature. 437, 754-758 (2005).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Kırmızı kan hücrelerinin ex vivo başarılı bir şekilde, büyük ölçekli üretim elde etmek için etkili bir şekilde yeniden üretmek için çok zordur erythropoiesis in vitro kültürlerinde adım olduğu Son yıllarda erythroblast enükleasyonu çalışma artan ivme kazanmıştır. Son zamanlara kadar, erythroblast enükleasyonu çalışma esas floresan mikroskobu kullanılmaktadır ve sitometri yöntemleri akar. Floresan mikroskopi yöntemleri, katılımcı moleküllerinin belirlenmesi yard...

Memelilerde eritroid soy içinde terminal farklılaşma ortokromatik erythroblast bir retikülosit 2 üreten, kendi membran kaplı çekirdeği (pyrenocyte) 1 kovar hangi aracılığıyla enükleasyonu dramatik süreci ile sona eriyor. De başarılı oran-sınırlayıcı bir adımdır, bu prosesin mekanizması tam olarak, büyük ölçekli, in vitro olarak kırmızı kan hücrelerinin üretimi, henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Enucleating erythroblasts içinde önemli protein ve yapıların lokalizasyonu floresan ve elektron mikroskobu 3-5 kullanımına dayanır. Bu işlem, tipik olarak sıkıcı enükleasyonu etkinlikleri sınırlı sayıda tanımlanması ile sonuçlanır ve her zaman anlamlı istatistiksel olarak analiz edilmesine izin vermez. McGrath ve ark. 6 tarafından tarif erythroblast kimlik bir yöntem üzerinde genişletilmesi, biz Multi-Spektral Ima tarafından enükleasyonun olayları tanımlama ve okuyan yeni bir yaklaşım geliştirdilerölçümler elde ve istatistiksel analizi gerçekleştirmek için gözlemler yeterli sayıda sağlayabilir retlendirici Sitometrisi (akımında multiparameter yüksek hızlı hücre görüntüleme, akış sitometrisine floresan mikroskopi birleştiren bir yöntem) 7. Burada, biz eritroblastlarda senkronize ve değerlendirilmesi sırasında enükleasyonunu yakalama olasılığını arttırmak amacıyla kullanılan ilk iki in vitro erythropoiesis kültür yöntemleri açıklanmaktadır. Sonra, multi-spektral görüntüleme akış sitometresi ile enükleasyonu sırasında hücre içi protein veya lipid sallar lokalizasyonunu incelemek için ayrıntılı olarak tespit ve geçirgenleştirmeden sonra eritroblast boyama açıklar. Numuneler sitometresiyle bir görüntüleme akış üzerinde çalışan ve toplanan hücreler ortokromatik eritroblastlarda 6 tanımlamak için uygun Geçitli. Aydınlık İMA olarak ölçülen ortokromatik eritroblastlar sonra, onların boy oranına göre dağılımı incelendiğindeging sırasıyla Ter119 ve DNA için lekeli alanların merkezleri arasındaki mesafe olarak tanımlanan parametre delta ağırlık merkezi XY Ter119-DNA, için kendi değerine karşılık. Düşük en-boy oranına ve yüksek delta sentroid XY Ter119/DNA ile hücre nüfusu oldukça hücreleri enucleating zenginleşmektedir. - / - Veya kombine RAC2 - / - wild-tip (WT) kullanarak RAC2 üzerine Rac1 Mx-Cre aracılı koşullu silme ile erythroblasts karşı eritroblastlarda; RAC3 - / -, genetik geçmişi ve multi-spektral görüntüleme akışının bu yeni protokol sitometrisi analizi, son zamanlarda enükleasyonu asimetrik sitokinez ve benzer Rac GTPases kısmen düzenlenmiş bir aktomizin halkasının oluşumu enükleasyonu ilerlemesi 7 için önemli olduğunu ortaya koymuştur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

Memelilerde Eritropoez retikülosit oluşumuyla sonuçlanan enükleasyonu dramatik süreci ile sona eriyor. Enükleasyonu mekanizması henüz tam olarak açıklığa kavuşturulamamıştır. Mikroskopla enucleating erythroblasts içinde önemli protein ve yapıların lokalizasyonu okuyan karşılaşılan genel bir sorun enükleasyonunu geçiren hücrelerin yeterli sayıda gözlemlemek güçlüğüdür. Bu akışta çok parametreli yüksek hızlı hücre görüntüleme (Fazla Spektral Görüntüleme Flow Cytometry), verimli bir şekilde enucleating etkinlikleri önemli sayıda belirlemek amacıyla, akış sitometrisi ile immünofloresan mikroskopi bir araya getiren bir yöntemi kullanarak yeni bir analiz protokolü geliştirdik, bu sağlar: ölçümler elde ve istatistiksel analiz. Biz buraya ilk kemirgen eritroblastlarda senkronize ve inci de enükleasyonunu yakalama olasılığını arttırmak için kullanılan iki in vitro erythropoiesis kültür yöntemleri tarifdeğerlendirme e saati. Daha sonra, multi-spektral görüntüleme akış sitometresi ile enükleasyonu sırasında hücre içi protein veya lipid sallar lokalizasyonunu incelemek için ayrıntılı olarak tespit ve geçirgenleştirmeden sonra eritroblast boyama açıklar. Büyüklüğü ve ortokromatik eritroblastlarda tanımlamak için kullanılır DNA/Ter119 boyama ile birlikte, ince uzun hücreleri ve &quot;delta ağırlık merkezi XY Ter119/Draq5 tanınmasına yardımcı olan, parlak-alan kanal bir hücrenin parametreleri&quot; boy oranı &quot;kullanmaktadır &quot;Bu Ter119 boyama (olgunlaşmamış retikülosit) merkez uzak Draq5 lekeleme (çekirdek yapılan ekstrüzyon) merkezinden olduğu hücresel olaylar, bu nedenle tanımlama aydınlatmak üzere bir hücre gösteren sağlar. Yüksek delta sentroidinden ve düşük boy oranı ile ortokromatik erythroblast nüfusun alt kümesi derece hücreleri enucleating zenginleşmektedir.

İlk olarak, hücreler aydınlık Boy Oranı (bunların büyük ekseni ile kendi küçük uzunluğunun oranı) ve aydınlık Alan (büyüklüklerine göstergesidir) göre analiz edilir. Bir aydınlık Alan Değeri 20 daha düşük ve 200 &#39;den daha yüksek olan olaylar sırası ile enkaz ve hücre agrega, ve analizi (Şekil 2A) için hariç tutulur. Tek hücreler (gate &quot;R1&quot;) daha sonra görüntünün keskinliğini gösterir Gradient RMS parametresi için, kendi değerine göre analiz vardı...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Bu protokol, sitometri multi-spektral görüntüleme akışı ile ortokromatik eritroblastlarda enucleating erythroblast enükleasyonu işleminin bir görselleştirme temin edilmesi için bir popülasyonu belirlenmesi için yeni bir yöntem tarif eder.

Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI&#39;nin Zenginleştir tanımlanması

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Görüntüleme.  University of Cincinnati College of Medicine.  Bu protokol, sitometri multi-spektral görüntüleme akışı ile ortokromatik eritroblastlarda enucleating erythroblast enükleasyonu işleminin bir görselleştirme temin edilmesi için bir popülasyonu belirlenmesi için yeni bir yöntem tarif eder. 