Los autores agradecen al flujo Citometría de Investigación de la Fundación de Niños de Cincinnati Research Hospital y Richard Demarco, Sherree amigo, y Scott Mordecai desde el Amnis Corporation (parte de EMD Milllipore) para el apoyo técnico de expertos. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones K08HL088126 y R01HL116352 (TAK) y DK090971 P30 (YZ).

1. A largo plazo in vitro eritropoyesis Cultura (Ex vivo Eritroides Protocolo Cultura Diferenciación Giarratana et al. 8, Modificado y Adaptado por células de ratón) Se trata de un largo plazo de 3 pasos en el protocolo de la eritropoyesis vitro. En el primer paso (días 0-4) 2 x 10 5 células / ml se colocan en medio de crecimiento suplementado con eritroblastos de factor de células madre (SCF), interleuquina-3 (IL-3), y la eritropoyetina (EPO). En el segundo paso (días 5-6), las células se resuspendieron a 2 x 10 5 células / ml y se co-cultivaron en células de estroma adherentes (MS5) en medio de crecimiento eritroblastos fresco suplementado sólo con EPO. En la tercera etapa (días 7-9), las células se cultivan en una capa de MS-5 células en medio de crecimiento fresco eritroblastos sin citoquinas hasta la enucleación (Figura 1A). Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) deCentro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati. <ol><li> Cosecha de huesos y aislamiento de células de médula ósea de baja densidad <ol><li> Añadir 2 ml de IMDM estéril que contiene suero bovino fetal al 2% (FBS) en un tubo cónico de 15 ml y mantener en hielo. </li><li> La eutanasia a un 2-6 meses de edad de tipo salvaje del ratón C57/BL6 (junto con o sin ratón genéticamente orientada de interés) siguiendo el protocolo institución aprobada (por ejemplo, inhalación de CO2, seguido por dislocación cervical). </li><li> Aislar los huesos de la pelvis, fémures y tibias de ambas piernas con unas pinzas y bisturí, añadirlos al tubo que contenía IMDM 2% de SFB y mantener en hielo. </li><li> Añadir 1 ml de IMDM 2% de FBS en un tubo de citometría de flujo estéril y los huesos ras utilizando fórceps y una jeringa de tuberculina con una 25-G x 5/8 &quot;de la aguja. IMDM al ras 2% de FBS a través de los huesos de un par de veces suavemente ( mediante la aspiración de ~ 500 l de la suspensión celular y el lavado de nuevo a través del hueso), y recoger las células de médula ósea en el flujo-cytometrtubo en Y. Flushing es completa cuando los huesos aparecen blancos. </li><li> Filtrar suspensión de células a través de un 40-m conjunto de filtro de células en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Lavar filtro de células con IMDM 2% de FBS y utilizando el mismo medio Ajustar el volumen final de la suspensión celular a 5 ml. </li><li> Preparar las células de médula ósea de baja densidad (LDBM) por centrifugación en gradiente de densidad: la capa cuidadosamente los 5 ml de suspensión de células en 5 ml de separación de células en gradiente de densidad medio de 1.083 g / ml en un tubo de 15 ml y centrifugar a 750 xg durante 25 min a temperatura ambiente (TA) sin freno / aceleración baja. </li><li> Transferir el sobrenadante (todo en manos de la marca de 2 ml del tubo de 15 ml con el fin de adquirir la capa leucocitaria) a un nuevo tubo de 15 ml y llevar a cabo un lavado más con IMDM 2% FBS a 525 xg durante 5 minutos a RT. </li><li> Aspirar el sobrenadante y lisar las células rojas de la sangre (RBC) restantes suspendiendo el sedimento en 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos durante 5 min a TA. Si una mayor pureza de eritroblastos esrequerido en el paso final (por ejemplo, para estudios bioquímicos), purificar células LDBM más a fondo en este paso para neg células Lin por separación magnética. </li></ol></li><li> Ex vivo eritroide protocolo de cultivo de diferenciación a partir de LDBM o neg células Lin (Figura 1A) <ol><li> Añadir 7 ml de IMDM 2% de FBS, centrifugado a 525 xg durante 5 min a TA y resuspender las células sedimentadas en 2 ml de medio de crecimiento eritroblastos (EGM), que consiste en: una. Medio StemPro-34, que contiene b. 2,6% StemPro-34 suplemento medio, c. 20% BIT-9500, d. Sulfato ferroso 900 ng / ml, e. 90 nitrato férrico ng / ml, f. 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina g. 10 -6 M hidrocortisona h. y citoquinas recién añadido: i) 100 ng / ml de SCF, ii) 5 ng / ml de IL-3, y iii) 3 UI / ml Epo. </li><li> Contar las células utilizando un contador de células automatizado o manual en el microscopio utilizando un dobladilloocytometer. </li><li> Placa en una placa de cultivo celular de 6 pocillos a una concentración de 5 x 10 5 células / pocillo a un volumen final de 2,5 ml en EGM (2 x 10 5 LDBM células / ml) y se incuba a 37 ° C (esto se considera como el día # 0 de la cultura). </li><li> Cambio de medio por aspiración de 1,5 ml del sobrenadante, que gira a 525 xg durante 5 min a TA, la resuspensión en 1,5 ml de medio fresco que contiene todas las 3 citoquinas y la adición de nuevo a los pocillos cada día en día # 2, 3, 4, para optimizar fase proliferativa. El día 3, eliminar todas las células, contar y dividir en un número apropiado de pozos a fin de mantener las concentraciones de células y de ~ 2 x 10 5 células / ml. Mantener cultivo a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> El día 4, las células de la placa MS5 (línea celular estromal murina) en los pocillos de una celda de cultivo en placa de 6 pocillos nueva. El medio de cultivo celular MS5 se α-MEM que contiene 20% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina. </li><li> El día 5, contar el número decélulas (ahora enriquecido significativamente en eritroblastos) en cada pocillo de la placa de cultivo original utilizando un contador de células automatizado o manualmente en un microscopio utilizando un hemocitómetro. </li><li> Levantar todas las células de cada pocillo y transferir a tubos cónicos de 15 ml, centrifugar a 525 xg durante 5 min a TA, se aspira el sobrenadante y disolver gránulos con EGM fresco que contiene sólo la Epo (3 UI / ml) a una concentración de 2 x 10 5 células / ml. </li><li> Aspirar el sobrenadante de los pocillos en los que MS-5 células se sembraron el día anterior (orientada al 70-80% de confluencia en el momento de co-cultivo) y se añaden a las células eritroides en estos pozos en EGM contiene sólo Epo (aunque no es su medio de elección, MS-5 células sobreviven bien en EGM durante varios días). </li><li> Cambie medio adición fresca EPO en el día # 6. </li><li> Cambie medio en el día n º 7, usando EGM sin citoquinas añadidas. En los días 7 al 9 de muestras para descartar la enucleación con citometría de flujo después de la tinción con anti-Ter119 y Syto-16 todos los días y proceed de la tinción de muestras para múltiples imágenes espectrales Citometría de Flujo (como se detalla en la sección 3). Nota:. Antes de chapado y en el día 2, 4, 6, y 7 de cultivo, las células cultivadas para controlar el enriquecimiento de los eritroblastos y la diferenciación con citometría de flujo mediante la evaluación de los marcadores de superficie CD44 y Ter119 vs tamaño (FSC) 9 Alternativamente CD71, Ter119, y FSC también se puede utilizar 10, 11. </li></ol></li></ol> 2. Ensayo Enucleación rápida, De acuerdo con el protocolo descrito por Yoshida et al. 12 con modificaciones (Figura 1B) <ol><li> El estrés de la inducción de la eritropoyesis y estroma preparación de células para el cultivo in vitro de la eritropoyesis <ol><li> Anestesiar a un 2-6 meses de edad de tipo salvaje C57/BL6 ratón por directrices IACUC (por ejemplo, con una solución de isoflurano). Asegúrese de que el ratón ha sido anestesiado adecuadamente mediante la comprobación de la ausencia de respuestas reflejas a un suave pellizco pata trasera y pararespiración regular durante el procedimiento. Utilice veterinario pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. </li><li> Inducir la eritropoyesis estrés a través de la cola sangrado hasta un volumen final de 500 l. Usando una jeringa de insulina, inyecte un volumen igual de solución salina normal por vía intraperitoneal para asegurar la reposición de líquidos del animal (mantenga animales en posición de Trendelenburg antes de inyectar e inyectar en la parte inferior del abdomen, para no dañar los órganos internos). </li><li> No deje el ratón sin atención hasta que se haya recuperado el control del motor, como se indica por el animal comienza a moverse alrededor de la jaula y ser capaz de ponerse de pie y caminar sin caerse. El ratón Phlebotomized se coloca en una jaula sin otros ratones. </li><li> Después de 2 días, placa MS-5 células en pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Incubar MS-5 células a 37 ° C / 5% de CO2 en medio celular MS5 (a-MEM que contiene 20% de SFB, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina) con el objetivo de ser 70-80 % confluentes ipozos n de la placa después de 48 hr. </li></ol></li><li> Cosecha del bazo y el procesamiento de los esplenocitos <ol><li> Cuatro días (96 horas) después de la inducción de la eritropoyesis estrés, practicar la eutanasia previamente purgado del ratón a través del protocolo aprobado por el IACUC (por ejemplo, inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical). </li><li> Bazo Harvest y lo puso en un tubo cónico de 15 ml que contenía IMDM FBS al 2% y mantener en hielo. </li><li> De vuelta en el laboratorio, en la campana de cultivo de tejidos en condiciones estériles, invierta el tubo que contiene el bazo-en un filtro de células de 40 m situada en la parte superior de un tubo de 50 ml. Crush bazo utilizando el émbolo de una jeringa de plástico de 5 ml. </li><li> Lavar filtro de células con IMDM 2% de FBS y utilizando el mismo medio, ajustar el volumen final de la suspensión celular a 5 ml. </li><li> Capa cuidadosamente la suspensión de esplenocitos 5 ml en 5 ml de densidad de separación celular gradiente medio de 1.083 g / ml en un tubo de 15 ml y centrifugar a 750 xg durante 25 min a temperatura ambiente sin freno / bajo aceleración. </li><li> Transferenciasobrenadante (solución hasta aproximadamente la marca de 2 ml del tubo de 15 ml con el fin de adquirir la capa leucocitaria) a un nuevo tubo de 15 ml y llevar a cabo un lavado más con IMDM 2% de SFB a 525 xg durante 5 min a TA . </li><li> Aspirar el sobrenadante y lisar las células rojas de la sangre mediante la suspensión el sedimento en 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos durante 5 min a TA. </li><li> Añadir 7 ml de IMDM 2% de FBS para lavar las células y para diluir y neutralizar el tampón de lisis de RBC y centrifugado a 525 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante y suspender las células peletizadas en 2 ml de medio de crecimiento eritroblastos (EGM). </li></ol></li><li> Cultura de los esplenocitos aislados de baja densidad, enriquecidas en eritroblastos, en plástico (primera etapa de la cultura de la eritropoyesis rápido in vitro) <ol><li> Contar las células en un contador de células automatizado o manualmente por un hemocitómetro. Número habitual de células aisladas por el bazo en esta etapa es de ~ 15 x 10 6. </li><li> Suspender las células más en EGM contienen las citocinas (a fconcentraciones de nal): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml, y la OEP 2 U / ml. </li><li> Plate 1-5 x 10 6 células en un volumen final de 1 ml / pocillo (mismo número de células por pozo, dependiendo del número total de células) de una placa de cultivo celular de 24 pocillos y se incuban O / N a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Cultura de eritroblastos en las células MS5 (segunda etapa de la cultura de la eritropoyesis rápido in vitro <ol><li> Aspirar el sobrenadante de la plástico bien y levantar las células (altamente enriquecidas en eritroblastos) mediante la adición de 2 ml de frío de EDTA 10 mM en PBS durante 5 min, en hielo a cada pocillo. </li><li> Poner las células en tubos frescos, lavar una vez en EGM (sin citoquinas) y volver a suspender en el mismo. </li><li> Plate 5 x 10 5 -1 x 10 6 células en un volumen de 1-2 ml a cada MS5 celular recubierto pocillo de una placa de 24 pocillos. Si inhibidores farmacológicos están siendo utilizados en el experimento, añadirlos a concentraciones apropiadas ahora. </li><li> Incubar durante 6 a 8 horas (tiempo guiado porobservación microscópica de aproximadamente 30% -40% enucleación en el peso de la muestra no tratada). La unión de los eritroblastos de MS-5 células acelera su enucleación. </li><li> Levante las células de cada pocillo mediante la adición de 2 ml de EDTA frío PBS + 10 mM, durante 5 minutos, en hielo. Junto con los eritroblastos, también se recogerán MS-5 células, pero estos más tarde se pueden excluir fácilmente durante el análisis de citometría de flujo como FSC hi Ter119 - células. </li><li> En esta etapa, las células se pueden fijaron y se tiñeron para el análisis en un Multi-espectral de imágenes citometría de flujo. </li></ol></li></ol> 3. La tinción de Eritroblastos para la localización intracelular de proteínas o lípidos balsas Durante enucleación por multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo <ol><li> Lavar las células en PBS, girar 525 xg durante 5 min a TA y se aspira el sobrenadante. </li><li> Fijar las células resuspendiendo los sedimentos celulares en 500 l de 3,7% de formaldehído en PBS durante 15 min (tiempo de fijación puede variar dependiendo de la lucha contrase sondeó generación) y pipeteando con suavidad. </li><li> Transferencia a tubos de centrífuga de plástico de 1,5 ml y se incuba durante 15 min a TA. </li><li> Centrifugado en un banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, se aspira el sobrenadante y llevar a cabo un lavado mediante la adición de 500 l de PBS a cada tubo y pipeteado suavemente. </li><li> Haga girar en un banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 segundos, se aspira el sobrenadante y mantener los tubos en hielo durante al menos 15 min. Permeabilización los pasos 3.6 a 3.9 se debe hacer de manera rápida y eficiente, y siguiendo spinning / aspiración a temperatura ambiente, los sedimentos celulares inmediatamente debe ser puesto de nuevo en hielo, para que las células conserven mejor su integridad. </li><li> Tomar soluciones de acetona a partir de -20 ° C congelador y poner en hielo. Permeabilizar las células mediante resuspensión sedimentos celulares por primera vez en 500 l helado 50% de acetona (1:1 con dH 2 O) y pipeta suavemente. </li><li> Giro en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, el sobrenadante aspirado y teléfonos resuspender pellets en 500 l60; helado acetona al 100% con la pipeta suavemente. </li><li> Giro en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, el sobrenadante aspirado y teléfonos resuspender gránulos una vez más en 500 l helado acetona al 50% con la pipeta suavemente. </li><li> Giro en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 segundos, se aspira el sobrenadante y lavar las células una vez en tampón FACS frío (PBS + BSA al 0,5%) con la pipeta suavemente. </li><li> Preparar cóctel de marcaje con anticuerpos o marcadores para las moléculas de interés: 0,1 U/100 l AF488-faloidina para la tinción de actina F y 1 μl/100 l Ter119-PECy7 para la tinción de células eritroides. Tinción alternativa o adicional también se puede hacer uso de AF-488-anti-β-tubulina de anticuerpos (1:50), AF-594-conjugado toxina del cólera subunidad B para etiquetar las balsas de lípidos (1:200), anti-pMRLC (Ser19) anticuerpo primario durante la miosina fosforilada cadena ligera reguladora (01:50), seguido de conejo anti-AF-488-conjugado secundaria de anticuerpos (1:400) y anti-γ-tubulin anticuerpo primario de conejo (1:100) seguido por anti-conejo anticuerpo secundario AF-555-conjugado (1:300). </li><li> Después de la aspiración sobrenadante, resuspender los sedimentos celulares en 100 l de cóctel de marcador, pipeta suavemente y se incuba durante 30 min a TA. </li><li> Preparar tampón FACS que contiene 2,5 M de DRAQ5 la tinción nuclear. </li><li> Lavar las células en tampón FACS, girar hacia abajo en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 segundos, se aspira el sobrenadante y resuspender en 60 l de tampón FACS que contiene DRAQ5. </li><li> Corra las muestras en el citómetro de flujo de imágenes para recoger al menos 10.000 eventos por cada experimento, compensar a los archivos de datos brutos según lo publicado previamente 13, y analizar los resultados, como se muestra en la figura 2, utilizando el software de análisis específico de la proyección de imagen citómetro de flujo. </li></ol>

<ol>
	<li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+&amp;#34;pyrenocytes&amp;#34;+in+the+mammalian+fetus.">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &amp;#34;pyrenocytes&amp;#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li><li>Chasis, J. A., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroblastic+islands:+niches+for+erythropoiesis.">Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis.</a> Blood. 112, 470-478 (2008).</li><li>Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+distribution+and+function+during+the+maturation+and+enucleation+of+mammalian+erythroblasts.">Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts.</a> J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).</li><li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2.">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).</li><li>Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+trafficking+plays+a+novel+role+in+erythroblast+enucleation.">Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation.</a> Blood. 116, 3331-3340 (2010).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Konstantinidis, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+and+cytoskeletal+requirements+in+erythroblast+enucleation.">Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation.</a> Blood. 119, 6118-6127 (2012).</li><li>Giarratana, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells.">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li><li>Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).</li><li>Kalfa, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+and+Rac2+GTPases+are+necessary+for+early+erythropoietic+expansion+in+the+bone+marrow+but+not+in+the+spleen.">Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen.</a> Haematologica. 95, 27-35 (2010).</li><li>Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71/TER119+flow-cytometric+assay.">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylserine-dependent+engulfment+by+macrophages+of+nuclei+from+erythroid+precursor+cells.">Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells.</a> Nature. 437, 754-758 (2005).</li><li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

En los últimos años el estudio de la enucleación eritroblastos ha adquirido cada vez mayor impulso, ya que es el paso en cultivos in vitro de la eritropoyesis en que es más difícil de reproducir de manera eficiente con el fin de lograr éxito, la producción a gran escala de células rojas de la sangre ex vivo. Hasta hace poco, el estudio de la enucleación eritroblasto utilizó la microscopía de fluorescencia, principalmente y citometría de flujo métodos. Métodos de microscopía de f...

La diferenciación terminal dentro del linaje eritroide en mamíferos concluye con el dramático proceso de enucleación, a través del cual el eritroblasto ortocromática expulsa su núcleo membrana revestida (pyrenocyte) 1, lo que genera un reticulocitos 2. El mecanismo exacto de este proceso, que es también la etapa limitante de la velocidad de éxito, a gran escala, la producción de células rojas de la sangre in vitro, aún no se ha aclarado completamente. La localización de las proteínas y estructuras clave dentro de eritroblastos enucleación se basa en el uso de microscopía de fluorescencia y electrónica de 3-5. Este proceso tedioso típicamente resulta en la identificación de un número limitado de eventos enucleación y no siempre permite un análisis estadístico significativo. Ampliando un método de identificación eritroblasto descrito previamente por McGrath et al. 6, hemos desarrollado un nuevo método de identificación y estudio de eventos enucleación Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo (multiparamétrico de imágenes de células de alta velocidad en el flujo, un método que combina la microscopía fluorescente con citometría de flujo) 7, que puede proporcionar un número suficiente de observaciones para obtener mediciones y realizar análisis estadísticos. Aquí, se describe primero dos métodos de cultivo in vitro en la eritropoyesis utilizados con el fin de sincronizar los eritroblastos y aumentar la probabilidad de capturar la enucleación en el momento de la evaluación. A continuación se describe en detalle la tinción de eritroblastos después de la fijación y permeabilización con el fin de estudiar la localización de las proteínas intracelulares o balsas de lípidos durante la enucleación por citometría de flujo de imágenes multiespectrales. Las muestras se ejecutan en un flujo de imágenes citómetro y las células recogidas se gated apropiada para identificar eritroblastos ortocromáticas 6. Eritroblastos ortocromáticas Después se analizan en función de su relación de aspecto, según se mide en campo claro imaging, frente a su valor para el centroide parámetro Delta XY Ter119-ADN, que se define como la distancia entre los centros de las zonas manchadas de Ter119 y ADN, respectivamente. La población de células con una relación de aspecto de baja y alta centroide delta XY Ter119/DNA es altamente enriquecido en enucleación células. El uso de tipo salvaje (WT) eritroblastos frente eritroblastos con Mx-Cre mediada eliminación condicional de Rac1 en Rac2 - / - o combinado Rac2 - / -; Rac3 - / - de fondo genético y de este protocolo de análisis de la novela de flujo de imágenes multiespectrales citometría, hemos demostrado que la enucleación se asemeja a la citocinesis asimétrica y que la formación de un anillo de actomiosina regulada en parte por Rac GTPasas es importante para la progresión de la enucleación 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

La eritropoyesis en los mamíferos concluye con el dramático proceso de enucleación que resulta en la formación de reticulocitos. El mecanismo de la enucleación aún no ha sido aclarada completamente. Un problema común encontrado al estudiar la localización de las proteínas y estructuras clave dentro de eritroblastos enucleación por microscopía es la dificultad de observar un número suficiente de células sometidas a enucleación. Hemos desarrollado un protocolo de análisis novela utilizando imágenes de multiparamétrico de alta velocidad en la célula de flujo (multi-espectral de imágenes Citometría de Flujo), un método que combina la microscopía de inmunofluorescencia con citometría de flujo, con el fin de identificar de manera eficiente un número significativo de eventos enucleación, que permite obtener mediciones y realizar el análisis estadístico. En primer lugar, describimos aquí dos métodos de cultivo in vitro en la eritropoyesis utilizados con el fin de sincronizar los eritroblastos murinos y aumentar la probabilidad de capturar la enucleación en el thtiempo e de evaluación. A continuación, se describe en detalle la tinción de eritroblastos después de la fijación y permeabilización con el fin de estudiar la localización de las proteínas intracelulares o balsas de lípidos durante la enucleación por citometría de flujo de imágenes multiespectrales. Junto con el tamaño y la tinción DNA/Ter119 que se utilizan para identificar los eritroblastos ortocromáticas, utilizamos los parámetros &quot;relación de aspecto&quot; de una célula en el canal de campo brillante que ayuda en el reconocimiento de las células alargadas y &quot;centroide Delta XY Ter119/Draq5 &quot;que permite la identificación de los procesos celulares en los que el centro de la tinción Ter119 (reticulocitos naciente) está lejos del centro de la tinción DRAQ5 (núcleo de someterse a extrusión), lo que indica una celda sobre enuclear. El subconjunto de la población de eritroblastos ortocromática con alta centroide delta y baja relación de aspecto es altamente enriquecido en células enucleación.

En primer lugar, las células se analizaron sobre la base de su relación de aspecto de campo claro (la relación de la longitud de su menor en comparación con su eje mayor) y su área de campo claro (indicativo de su tamaño). Los eventos con un valor de campo claro de la zona inferior a 20 y superior a 200 son en su mayoría de los desechos celulares y agregados, respectivamente, y se excluyeron del análisis (Figura 2A). Las células individuales (gate &quot;R1&quot;) son luego analizadas en funció...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

El presente protocolo describe un nuevo método de identificación de una población de enucleación eritroblastos ortocromáticas por el flujo de imágenes multiespectrales citometría, proporcionando una visualización del proceso de enucleación eritroblastos.

Identificación de un murino eritroblasto subpoblación Enriquecido en enucleación Eventos Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K vistas.  University of Cincinnati College of Medicine.  El presente protocolo describe un nuevo método de identificación de una población de enucleación eritroblastos ortocromáticas por el flujo de imágenes multiespectrales citometría, proporcionando una visualización del proceso de enucleación eritroblastos. 