Los autores agradecen al flujo Citometría de Investigación de la Fundación de Niños de Cincinnati Research Hospital y Richard Demarco, Sherree amigo, y Scott Mordecai desde el Amnis Corporation (parte de EMD Milllipore) para el apoyo técnico de expertos. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones K08HL088126 y R01HL116352 (TAK) y DK090971 P30 (YZ).

1. A largo plazo in vitro eritropoyesis Cultura (Ex vivo Eritroides Protocolo Cultura Diferenciación Giarratana et al. 8, Modificado y Adaptado por células de ratón) Se trata de un largo plazo de 3 pasos en el protocolo de la eritropoyesis vitro. En el primer paso (días 0-4) 2 x 10 5 células / ml se colocan en medio de crecimiento suplementado con eritroblastos de factor de células madre (SCF), interleuquina-3 (IL-3), y la eritropoyetina (EPO). En el segundo paso (días 5-6), las células se resuspendieron a 2 x 10 5 células / ml y se co-cultivaron en células de estroma adherentes (MS5) en medio de crecimiento eritroblastos fresco suplementado sólo con EPO. En la tercera etapa (días 7-9), las células se cultivan en una capa de MS-5 células en medio de crecimiento fresco eritroblastos sin citoquinas hasta la enucleación (Figura 1A). Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) deCentro Médico del Hospital Infantil de Cincinnati. <ol><li> Cosecha de huesos y aislamiento de células de médula ósea de baja densidad <ol><li> Añadir 2 ml de IMDM estéril que contiene suero bovino fetal al 2% (FBS) en un tubo cónico de 15 ml y mantener en hielo. </li><li> La eutanasia a un 2-6 meses de edad de tipo salvaje del ratón C57/BL6 (junto con o sin ratón genéticamente orientada de interés) siguiendo el protocolo institución aprobada (por ejemplo, inhalación de CO2, seguido por dislocación cervical). </li><li> Aislar los huesos de la pelvis, fémures y tibias de ambas piernas con unas pinzas y bisturí, añadirlos al tubo que contenía IMDM 2% de SFB y mantener en hielo. </li><li> Añadir 1 ml de IMDM 2% de FBS en un tubo de citometría de flujo estéril y los huesos ras utilizando fórceps y una jeringa de tuberculina con una 25-G x 5/8 &quot;de la aguja. IMDM al ras 2% de FBS a través de los huesos de un par de veces suavemente ( mediante la aspiración de ~ 500 l de la suspensión celular y el lavado de nuevo a través del hueso), y recoger las células de médula ósea en el flujo-cytometrtubo en Y. Flushing es completa cuando los huesos aparecen blancos. </li><li> Filtrar suspensión de células a través de un 40-m conjunto de filtro de células en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Lavar filtro de células con IMDM 2% de FBS y utilizando el mismo medio Ajustar el volumen final de la suspensión celular a 5 ml. </li><li> Preparar las células de médula ósea de baja densidad (LDBM) por centrifugación en gradiente de densidad: la capa cuidadosamente los 5 ml de suspensión de células en 5 ml de separación de células en gradiente de densidad medio de 1.083 g / ml en un tubo de 15 ml y centrifugar a 750 xg durante 25 min a temperatura ambiente (TA) sin freno / aceleración baja. </li><li> Transferir el sobrenadante (todo en manos de la marca de 2 ml del tubo de 15 ml con el fin de adquirir la capa leucocitaria) a un nuevo tubo de 15 ml y llevar a cabo un lavado más con IMDM 2% FBS a 525 xg durante 5 minutos a RT. </li><li> Aspirar el sobrenadante y lisar las células rojas de la sangre (RBC) restantes suspendiendo el sedimento en 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos durante 5 min a TA. Si una mayor pureza de eritroblastos esrequerido en el paso final (por ejemplo, para estudios bioquímicos), purificar células LDBM más a fondo en este paso para neg células Lin por separación magnética. </li></ol></li><li> Ex vivo eritroide protocolo de cultivo de diferenciación a partir de LDBM o neg células Lin (Figura 1A) <ol><li> Añadir 7 ml de IMDM 2% de FBS, centrifugado a 525 xg durante 5 min a TA y resuspender las células sedimentadas en 2 ml de medio de crecimiento eritroblastos (EGM), que consiste en: una. Medio StemPro-34, que contiene b. 2,6% StemPro-34 suplemento medio, c. 20% BIT-9500, d. Sulfato ferroso 900 ng / ml, e. 90 nitrato férrico ng / ml, f. 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina g. 10 -6 M hidrocortisona h. y citoquinas recién añadido: i) 100 ng / ml de SCF, ii) 5 ng / ml de IL-3, y iii) 3 UI / ml Epo. </li><li> Contar las células utilizando un contador de células automatizado o manual en el microscopio utilizando un dobladilloocytometer. </li><li> Placa en una placa de cultivo celular de 6 pocillos a una concentración de 5 x 10 5 células / pocillo a un volumen final de 2,5 ml en EGM (2 x 10 5 LDBM células / ml) y se incuba a 37 ° C (esto se considera como el día # 0 de la cultura). </li><li> Cambio de medio por aspiración de 1,5 ml del sobrenadante, que gira a 525 xg durante 5 min a TA, la resuspensión en 1,5 ml de medio fresco que contiene todas las 3 citoquinas y la adición de nuevo a los pocillos cada día en día # 2, 3, 4, para optimizar fase proliferativa. El día 3, eliminar todas las células, contar y dividir en un número apropiado de pozos a fin de mantener las concentraciones de células y de ~ 2 x 10 5 células / ml. Mantener cultivo a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> El día 4, las células de la placa MS5 (línea celular estromal murina) en los pocillos de una celda de cultivo en placa de 6 pocillos nueva. El medio de cultivo celular MS5 se α-MEM que contiene 20% de FBS, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, y 2 mM de L-glutamina. </li><li> El día 5, contar el número decélulas (ahora enriquecido significativamente en eritroblastos) en cada pocillo de la placa de cultivo original utilizando un contador de células automatizado o manualmente en un microscopio utilizando un hemocitómetro. </li><li> Levantar todas las células de cada pocillo y transferir a tubos cónicos de 15 ml, centrifugar a 525 xg durante 5 min a TA, se aspira el sobrenadante y disolver gránulos con EGM fresco que contiene sólo la Epo (3 UI / ml) a una concentración de 2 x 10 5 células / ml. </li><li> Aspirar el sobrenadante de los pocillos en los que MS-5 células se sembraron el día anterior (orientada al 70-80% de confluencia en el momento de co-cultivo) y se añaden a las células eritroides en estos pozos en EGM contiene sólo Epo (aunque no es su medio de elección, MS-5 células sobreviven bien en EGM durante varios días). </li><li> Cambie medio adición fresca EPO en el día # 6. </li><li> Cambie medio en el día n º 7, usando EGM sin citoquinas añadidas. En los días 7 al 9 de muestras para descartar la enucleación con citometría de flujo después de la tinción con anti-Ter119 y Syto-16 todos los días y proceed de la tinción de muestras para múltiples imágenes espectrales Citometría de Flujo (como se detalla en la sección 3). Nota:. Antes de chapado y en el día 2, 4, 6, y 7 de cultivo, las células cultivadas para controlar el enriquecimiento de los eritroblastos y la diferenciación con citometría de flujo mediante la evaluación de los marcadores de superficie CD44 y Ter119 vs tamaño (FSC) 9 Alternativamente CD71, Ter119, y FSC también se puede utilizar 10, 11. </li></ol></li></ol> 2. Ensayo Enucleación rápida, De acuerdo con el protocolo descrito por Yoshida et al. 12 con modificaciones (Figura 1B) <ol><li> El estrés de la inducción de la eritropoyesis y estroma preparación de células para el cultivo in vitro de la eritropoyesis <ol><li> Anestesiar a un 2-6 meses de edad de tipo salvaje C57/BL6 ratón por directrices IACUC (por ejemplo, con una solución de isoflurano). Asegúrese de que el ratón ha sido anestesiado adecuadamente mediante la comprobación de la ausencia de respuestas reflejas a un suave pellizco pata trasera y pararespiración regular durante el procedimiento. Utilice veterinario pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. </li><li> Inducir la eritropoyesis estrés a través de la cola sangrado hasta un volumen final de 500 l. Usando una jeringa de insulina, inyecte un volumen igual de solución salina normal por vía intraperitoneal para asegurar la reposición de líquidos del animal (mantenga animales en posición de Trendelenburg antes de inyectar e inyectar en la parte inferior del abdomen, para no dañar los órganos internos). </li><li> No deje el ratón sin atención hasta que se haya recuperado el control del motor, como se indica por el animal comienza a moverse alrededor de la jaula y ser capaz de ponerse de pie y caminar sin caerse. El ratón Phlebotomized se coloca en una jaula sin otros ratones. </li><li> Después de 2 días, placa MS-5 células en pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Incubar MS-5 células a 37 ° C / 5% de CO2 en medio celular MS5 (a-MEM que contiene 20% de SFB, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina) con el objetivo de ser 70-80 % confluentes ipozos n de la placa después de 48 hr. </li></ol></li><li> Cosecha del bazo y el procesamiento de los esplenocitos <ol><li> Cuatro días (96 horas) después de la inducción de la eritropoyesis estrés, practicar la eutanasia previamente purgado del ratón a través del protocolo aprobado por el IACUC (por ejemplo, inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical). </li><li> Bazo Harvest y lo puso en un tubo cónico de 15 ml que contenía IMDM FBS al 2% y mantener en hielo. </li><li> De vuelta en el laboratorio, en la campana de cultivo de tejidos en condiciones estériles, invierta el tubo que contiene el bazo-en un filtro de células de 40 m situada en la parte superior de un tubo de 50 ml. Crush bazo utilizando el émbolo de una jeringa de plástico de 5 ml. </li><li> Lavar filtro de células con IMDM 2% de FBS y utilizando el mismo medio, ajustar el volumen final de la suspensión celular a 5 ml. </li><li> Capa cuidadosamente la suspensión de esplenocitos 5 ml en 5 ml de densidad de separación celular gradiente medio de 1.083 g / ml en un tubo de 15 ml y centrifugar a 750 xg durante 25 min a temperatura ambiente sin freno / bajo aceleración. </li><li> Transferenciasobrenadante (solución hasta aproximadamente la marca de 2 ml del tubo de 15 ml con el fin de adquirir la capa leucocitaria) a un nuevo tubo de 15 ml y llevar a cabo un lavado más con IMDM 2% de SFB a 525 xg durante 5 min a TA . </li><li> Aspirar el sobrenadante y lisar las células rojas de la sangre mediante la suspensión el sedimento en 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos durante 5 min a TA. </li><li> Añadir 7 ml de IMDM 2% de FBS para lavar las células y para diluir y neutralizar el tampón de lisis de RBC y centrifugado a 525 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante y suspender las células peletizadas en 2 ml de medio de crecimiento eritroblastos (EGM). </li></ol></li><li> Cultura de los esplenocitos aislados de baja densidad, enriquecidas en eritroblastos, en plástico (primera etapa de la cultura de la eritropoyesis rápido in vitro) <ol><li> Contar las células en un contador de células automatizado o manualmente por un hemocitómetro. Número habitual de células aisladas por el bazo en esta etapa es de ~ 15 x 10 6. </li><li> Suspender las células más en EGM contienen las citocinas (a fconcentraciones de nal): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml, y la OEP 2 U / ml. </li><li> Plate 1-5 x 10 6 células en un volumen final de 1 ml / pocillo (mismo número de células por pozo, dependiendo del número total de células) de una placa de cultivo celular de 24 pocillos y se incuban O / N a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Cultura de eritroblastos en las células MS5 (segunda etapa de la cultura de la eritropoyesis rápido in vitro <ol><li> Aspirar el sobrenadante de la plástico bien y levantar las células (altamente enriquecidas en eritroblastos) mediante la adición de 2 ml de frío de EDTA 10 mM en PBS durante 5 min, en hielo a cada pocillo. </li><li> Poner las células en tubos frescos, lavar una vez en EGM (sin citoquinas) y volver a suspender en el mismo. </li><li> Plate 5 x 10 5 -1 x 10 6 células en un volumen de 1-2 ml a cada MS5 celular recubierto pocillo de una placa de 24 pocillos. Si inhibidores farmacológicos están siendo utilizados en el experimento, añadirlos a concentraciones apropiadas ahora. </li><li> Incubar durante 6 a 8 horas (tiempo guiado porobservación microscópica de aproximadamente 30% -40% enucleación en el peso de la muestra no tratada). La unión de los eritroblastos de MS-5 células acelera su enucleación. </li><li> Levante las células de cada pocillo mediante la adición de 2 ml de EDTA frío PBS + 10 mM, durante 5 minutos, en hielo. Junto con los eritroblastos, también se recogerán MS-5 células, pero estos más tarde se pueden excluir fácilmente durante el análisis de citometría de flujo como FSC hi Ter119 - células. </li><li> En esta etapa, las células se pueden fijaron y se tiñeron para el análisis en un Multi-espectral de imágenes citometría de flujo. </li></ol></li></ol> 3. La tinción de Eritroblastos para la localización intracelular de proteínas o lípidos balsas Durante enucleación por multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo <ol><li> Lavar las células en PBS, girar 525 xg durante 5 min a TA y se aspira el sobrenadante. </li><li> Fijar las células resuspendiendo los sedimentos celulares en 500 l de 3,7% de formaldehído en PBS durante 15 min (tiempo de fijación puede variar dependiendo de la lucha contrase sondeó generación) y pipeteando con suavidad. </li><li> Transferencia a tubos de centrífuga de plástico de 1,5 ml y se incuba durante 15 min a TA. </li><li> Centrifugado en un banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, se aspira el sobrenadante y llevar a cabo un lavado mediante la adición de 500 l de PBS a cada tubo y pipeteado suavemente. </li><li> Haga girar en un banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 segundos, se aspira el sobrenadante y mantener los tubos en hielo durante al menos 15 min. Permeabilización los pasos 3.6 a 3.9 se debe hacer de manera rápida y eficiente, y siguiendo spinning / aspiración a temperatura ambiente, los sedimentos celulares inmediatamente debe ser puesto de nuevo en hielo, para que las células conserven mejor su integridad. </li><li> Tomar soluciones de acetona a partir de -20 ° C congelador y poner en hielo. Permeabilizar las células mediante resuspensión sedimentos celulares por primera vez en 500 l helado 50% de acetona (1:1 con dH 2 O) y pipeta suavemente. </li><li> Giro en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, el sobrenadante aspirado y teléfonos resuspender pellets en 500 l60; helado acetona al 100% con la pipeta suavemente. </li><li> Giro en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 seg, el sobrenadante aspirado y teléfonos resuspender gránulos una vez más en 500 l helado acetona al 50% con la pipeta suavemente. </li><li> Giro en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 segundos, se aspira el sobrenadante y lavar las células una vez en tampón FACS frío (PBS + BSA al 0,5%) con la pipeta suavemente. </li><li> Preparar cóctel de marcaje con anticuerpos o marcadores para las moléculas de interés: 0,1 U/100 l AF488-faloidina para la tinción de actina F y 1 μl/100 l Ter119-PECy7 para la tinción de células eritroides. Tinción alternativa o adicional también se puede hacer uso de AF-488-anti-β-tubulina de anticuerpos (1:50), AF-594-conjugado toxina del cólera subunidad B para etiquetar las balsas de lípidos (1:200), anti-pMRLC (Ser19) anticuerpo primario durante la miosina fosforilada cadena ligera reguladora (01:50), seguido de conejo anti-AF-488-conjugado secundaria de anticuerpos (1:400) y anti-γ-tubulin anticuerpo primario de conejo (1:100) seguido por anti-conejo anticuerpo secundario AF-555-conjugado (1:300). </li><li> Después de la aspiración sobrenadante, resuspender los sedimentos celulares en 100 l de cóctel de marcador, pipeta suavemente y se incuba durante 30 min a TA. </li><li> Preparar tampón FACS que contiene 2,5 M de DRAQ5 la tinción nuclear. </li><li> Lavar las células en tampón FACS, girar hacia abajo en el banco de microcentrífuga 2000 xg durante 20 segundos, se aspira el sobrenadante y resuspender en 60 l de tampón FACS que contiene DRAQ5. </li><li> Corra las muestras en el citómetro de flujo de imágenes para recoger al menos 10.000 eventos por cada experimento, compensar a los archivos de datos brutos según lo publicado previamente 13, y analizar los resultados, como se muestra en la figura 2, utilizando el software de análisis específico de la proyección de imagen citómetro de flujo. </li></ol>

<ol>
	<li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+&amp;#34;pyrenocytes&amp;#34;+in+the+mammalian+fetus.">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &amp;#34;pyrenocytes&amp;#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li><li>Chasis, J. A., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroblastic+islands:+niches+for+erythropoiesis.">Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis.</a> Blood. 112, 470-478 (2008).</li><li>Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging.">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

En los últimos años el estudio de la enucleación eritroblastos ha adquirido cada vez mayor impulso, ya que es el paso en cultivos in vitro de la eritropoyesis en que es más difícil de reproducir de manera eficiente con el fin de lograr éxito, la producción a gran escala de células rojas de la sangre ex vivo. Hasta hace poco, el estudio de la enucleación eritroblasto utilizó la microscopía de fluorescencia, principalmente y citometría de flujo métodos. Métodos de microscopía de f...

La diferenciación terminal dentro del linaje eritroide en mamíferos concluye con el dramático proceso de enucleación, a través del cual el eritroblasto ortocromática expulsa su núcleo membrana revestida (pyrenocyte) 1, lo que genera un reticulocitos 2. El mecanismo exacto de este proceso, que es también la etapa limitante de la velocidad de éxito, a gran escala, la producción de células rojas de la sangre in vitro, aún no se ha aclarado completamente. La localización de las proteínas y estructuras clave dentro de eritroblastos enucleación se basa en el uso de microscopía de fluorescencia y electrónica de 3-5. Este proceso tedioso típicamente resulta en la identificación de un número limitado de eventos enucleación y no siempre permite un análisis estadístico significativo. Ampliando un método de identificación eritroblasto descrito previamente por McGrath et al. 6, hemos desarrollado un nuevo método de identificación y estudio de eventos enucleación Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo (multiparamétrico de imágenes de células de alta velocidad en el flujo, un método que combina la microscopía fluorescente con citometría de flujo) 7, que puede proporcionar un número suficiente de observaciones para obtener mediciones y realizar análisis estadísticos. Aquí, se describe primero dos métodos de cultivo in vitro en la eritropoyesis utilizados con el fin de sincronizar los eritroblastos y aumentar la probabilidad de capturar la enucleación en el momento de la evaluación. A continuación se describe en detalle la tinción de eritroblastos después de la fijación y permeabilización con el fin de estudiar la localización de las proteínas intracelulares o balsas de lípidos durante la enucleación por citometría de flujo de imágenes multiespectrales. Las muestras se ejecutan en un flujo de imágenes citómetro y las células recogidas se gated apropiada para identificar eritroblastos ortocromáticas 6. Eritroblastos ortocromáticas Después se analizan en función de su relación de aspecto, según se mide en campo claro imaging, frente a su valor para el centroide parámetro Delta XY Ter119-ADN, que se define como la distancia entre los centros de las zonas manchadas de Ter119 y ADN, respectivamente. La población de células con una relación de aspecto de baja y alta centroide delta XY Ter119/DNA es altamente enriquecido en enucleación células. El uso de tipo salvaje (WT) eritroblastos frente eritroblastos con Mx-Cre mediada eliminación condicional de Rac1 en Rac2 - / - o combinado Rac2 - / -; Rac3 - / - de fondo genético y de este protocolo de análisis de la novela de flujo de imágenes multiespectrales citometría, hemos demostrado que la enucleación se asemeja a la citocinesis asimétrica y que la formación de un anillo de actomiosina regulada en parte por Rac GTPasas es importante para la progresión de la enucleación 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

La eritropoyesis en los mamíferos concluye con el dramático proceso de enucleación que resulta en la formación de reticulocitos. El mecanismo de la enucleación aún no ha sido aclarada completamente. Un problema común encontrado al estudiar la localización de las proteínas y estructuras clave dentro de eritroblastos enucleación por microscopía es la dificultad de observar un número suficiente de células sometidas a enucleación. Hemos desarrollado un protocolo de análisis novela utilizando imágenes de multiparamétrico de alta velocidad en la célula de flujo (multi-espectral de imágenes Citometría de Flujo), un método que combina la microscopía de inmunofluorescencia con citometría de flujo, con el fin de identificar de manera eficiente un número significativo de eventos enucleación, que permite obtener mediciones y realizar el análisis estadístico. En primer lugar, describimos aquí dos métodos de cultivo in vitro en la eritropoyesis utilizados con el fin de sincronizar los eritroblastos murinos y aumentar la probabilidad de capturar la enucleación en el thtiempo e de evaluación. A continuación, se describe en detalle la tinción de eritroblastos después de la fijación y permeabilización con el fin de estudiar la localización de las proteínas intracelulares o balsas de lípidos durante la enucleación por citometría de flujo de imágenes multiespectrales. Junto con el tamaño y la tinción DNA/Ter119 que se utilizan para identificar los eritroblastos ortocromáticas, utilizamos los parámetros &quot;relación de aspecto&quot; de una célula en el canal de campo brillante que ayuda en el reconocimiento de las células alargadas y &quot;centroide Delta XY Ter119/Draq5 &quot;que permite la identificación de los procesos celulares en los que el centro de la tinción Ter119 (reticulocitos naciente) está lejos del centro de la tinción DRAQ5 (núcleo de someterse a extrusión), lo que indica una celda sobre enuclear. El subconjunto de la población de eritroblastos ortocromática con alta centroide delta y baja relación de aspecto es altamente enriquecido en células enucleación.

En primer lugar, las células se analizaron sobre la base de su relación de aspecto de campo claro (la relación de la longitud de su menor en comparación con su eje mayor) y su área de campo claro (indicativo de su tamaño). Los eventos con un valor de campo claro de la zona inferior a 20 y superior a 200 son en su mayoría de los desechos celulares y agregados, respectivamente, y se excluyeron del análisis (Figura 2A). Las células individuales (gate &quot;R1&quot;) son luego analizadas en funció...

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Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

El presente protocolo describe un nuevo método de identificación de una población de enucleación eritroblastos ortocromáticas por el flujo de imágenes multiespectrales citometría, proporcionando una visualización del proceso de enucleación eritroblastos.

Identificación de un murino eritroblasto subpoblación Enriquecido en enucleación Eventos Multi-espectral Imaging Citometría de Flujo

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K vistas.  University of Cincinnati College of Medicine.  El presente protocolo describe un nuevo método de identificación de una población de enucleación eritroblastos ortocromáticas por el flujo de imágenes multiespectrales citometría, proporcionando una visualización del proceso de enucleación eritroblastos. 

Video: Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP-FCM: inmunoprecipitación detectada por citometría de flujo

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Investigación

Biología

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

Imágenes de células vivas de las primeras autofagia Eventos: Omegasomes y más allá

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

Las mediciones del calcio citosólico en las células epiteliales renales mediante citometría de flujo

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Identificación de eventos de señalización intracelular inducida en células viables por la interacción con las células vecinas sometidos a la célula apoptótica de la muerte

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endorreduplicación medición por citometría de flujo de protoplastos aislados de tubérculos

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between defective mitophagy and various human diseases, including neurodegenerative diseases, cancer, and metabolic diseases. In addition, recent studies have shown that mitophagy is involved in normal cellular processes, such as differentiation and development. However, the precise role of and molecular mechanisms underlying mitophagy require further study. Therefore, it is critical to develop a robust and convenient method for measuring changes in mitophagy activity. Here, we describe a detailed protocol for quantitatively assessing mitophagy activity through flow cytometry using the mitochondria-targeted fluorescent protein Keima (mt-Keima). This flow cytometry assay can analyze mitophagy activity more rapidly and sensitively than conventional microscopy- or immunoblotting-based methods. This protocol can be applied to analyze mitophagy activity in various cell types.

Mitophagy, the selective degradation of mitochondria, has been implicated in mitochondrial homeostasis and is deregulated in various human diseases. However, convenient experimental methods for measuring mitophagy activity are very limited. Here, we provide a sensitive assay for measuring mitophagy activity using flow cytometry.