Les auteurs remercient le flux de recherche cytométrie de base à l&#39;hôpital Fondation de la recherche pour enfants de Cincinnati et Richard Demarco, Sherree ami, et Scott Mardochée du Amnis Corporation (partie de EMD Millipore) pour le support technique expert. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde K08HL088126 et R01HL116352 (TAK) et P30 DK090971 (YZ).

1. Long terme in vitro érythropoïèse Culture (Ex vivo différenciation érythroïde Protocole Culture par Giarratana et al. 8, modifié et adapté pour les cellules de souris) Il s&#39;agit d&#39;un long terme en 3 étapes dans le protocole de l&#39;érythropoïèse vitro. Dans la première étape (0-4 jours) 2 x 10 5 cellules / ml sont placés dans un milieu de croissance supplémenté avec érythroblastes le facteur des cellules souches (SCF), l&#39;interleukine-3 (IL-3), et d&#39;érythropoïétine (Epo). Dans la seconde étape (5-6 jours), les cellules sont remises en suspension à 2 x 10 5 cellules / ml et en co-culture sur des cellules stromales adhérentes (MS5) dans du milieu de croissance frais additionné d&#39;érythroblastes seulement avec Epo. Dans la troisième étape (7-9 jours), les cellules sont cultivées sur une couche de MS-5 les cellules dans un milieu de croissance des érythroblastes frais sans cytokines jusqu&#39;à énucléation (Figure 1A). Tous les protocoles d&#39;animaux ont été approuvés par le soin et l&#39;utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) deMedical Center Hospital de Cincinnati Children. <ol><li> Récolte des os et l&#39;isolement de cellules de moelle osseuse faible densité <ol><li> Ajouter 2 ml de IMDM stérile contenant 2% de sérum bovin fœtal (FBS) dans un tube conique de 15 ml et conserver sur de la glace. </li><li> Euthanasier un vieux 2-6 mois C57/BL6 souris de type sauvage (avec ou sans souris génétiquement ciblée d&#39;intérêt) à la suite institution approuvée par le protocole (par exemple inhalation de CO 2, suivie par dislocation cervicale). </li><li> Isoler les os du bassin, fémurs, tibias et des deux jambes à la pince et scalpel, ajoutez-les dans le tube contenant IMDM 2% de FBS et garder sur la glace. </li><li> Ajouter 1 ml IMDM 2% de FBS dans un tube cytométrie de flux stérile et rincer os en utilisant une pince et une seringue à tuberculine avec un 25-G x 5/8 &quot;aiguille. IMDM Flush 2% de FBS à travers les os quelques fois doucement ( en aspirant ~ 500 ul de la suspension cellulaire et de rinçage à nouveau à travers l&#39;os), et de recueillir des cellules de la moelle osseuse dans le flux-cytometrtube de y. Flushing est complète lorsque les os apparaissent en blanc. </li><li> Filtrer suspension cellulaire par un 40-um tamis cellulaire appareil au-dessus d&#39;un tube conique de 50 ml. Laver avec tamis cellulaire IMDM 2% de FBS et en utilisant le même moyen d&#39;ajuster le volume final de la suspension cellulaire à 5 ml. </li><li> Préparer des cellules de moelle osseuse de faible densité (ldbm) par centrifugation en gradient de densité: superposer soigneusement les 5 ml de suspension cellulaire par 5 ml de séparation cellulaire à gradient de densité moyenne 1,083 g / ml dans un tube de 15 ml et on centrifuge à 750 g pendant 25 min à température ambiante (RT), sans accélération de freinage / bas. </li><li> Transférer le surnageant (de tout jusqu&#39;à environ la marque de 2 ml du tube de 15 ml afin d&#39;acquérir couche leuco-plaquettaire) dans un nouveau tube de 15 ml et effectuer un lavage plus avec IMDM 2% de FBS à 525 g pendant 5 min à RT. </li><li> Aspirer le surnageant et lyser des globules rouges (RBC) restant en mettant en suspension le culot dans 3 ml de tampon de lyse RBC pendant 5 min à température ambiante. Si une plus grande pureté des érythroblastes estnécessaire à l&#39;étape finale (par exemple pour les études biochimiques), purifier les cellules ldbm encore à cette étape de cellules neg Lin par séparation magnétique. </li></ol></li><li> Ex vivo la différenciation érythroïde protocole de culture à partir de cellules ou LDBM neg Lin (Figure 1A) <ol><li> Ajouter 7 ml IMDM 2% de FBS, rotation à 525 g pendant 5 min à température ambiante et remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 ml de milieu de croissance des érythroblastes (EGM), composé de: une. Moyen STEMPRO-34, contenant b. 2,6% STEMPRO-34 moyen supplément, c. 20% de BIT-9500, d. Sulfate ferreux 900 ng / ml, e. 90 ml de nitrate ng / ferrique, f. 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine, 2 mM de L-glutamine g. 10 -6 M d&#39;hydrocortisone h. et des cytokines fraîchement ajoutée: i) 100 ng / ml SCF, ii) de 5 ng / ml d&#39;IL-3, et iii) 3 UI / ml Epo. </li><li> Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatique ou manuellement à l&#39;aide d&#39;un microscope d&#39;un ourletocytometer. </li><li> Plaque dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits à une concentration de 5 x 10 5 cellules / puits à un volume final de 2,5 ml dans EGM (2 x 10 5 ldbm cellules / ml) et incuber à 37 ° C (ce qui est considéré comme le jour # 0 de la culture). </li><li> Changer le milieu par aspiration 1,5 ml du surnageant, tournant à 525 g pendant 5 min à température ambiante, la remise en suspension dans 1,5 ml de milieu frais contenant tous les trois cytokines et ajoutant au puits chaque jour les jours 2, 3, 4, afin d&#39;optimiser phase de prolifération. Au jour 3, enlever toutes les cellules, compter et divisé en un nombre approprié de puits afin de maintenir les concentrations de cellules et de ~ 2 x 10 5 cellules / ml. Maintenir la culture à 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Au jour 4, les cellules de la plaque MS5 (lignée cellulaire stromale murine) aux puits d&#39;une nouvelle culture cellulaire plaque à 6 puits. Le milieu de culture cellulaire est MS5 α-MEM contenant 20% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine. </li><li> Au jour 5, compter le nombre deles cellules (à présent nettement enrichi en érythroblastes) dans chaque puits de la plaque de culture d&#39;origine en utilisant un compteur de cellules automatique ou manuellement au microscope en utilisant un hémocytomètre. </li><li> Lever toutes les cellules de chaque puits et transférer dans des tubes coniques de 15 ml, centrifuger à 525 g pendant 5 min à température ambiante, aspirer le surnageant et dissoudre des pastilles avec EGM frais ne contenant que de l&#39;Epo (3 UI / ml) à une concentration de 2 x 10 5 cellules / ml. </li><li> Aspirer le surnageant des puits où MS-5 cellules ont été étalées la veille (cible à 70-80% de confluence au moment de la co-culture) et ajoutent les cellules érythroïdes dans ces puits dans EGM ne contenant que de l&#39;Epo (mais pas moyen de leur choix, MS-5 cellules survivent bien dans EGM pendant plusieurs jours). </li><li> Changer le milieu ajoutant frais OEB le jour # 6. </li><li> Changer le milieu du jour # 7, en utilisant EGM sans cytokines ajoutés. Les jours de 7 à 9, les échantillons d&#39;essai pour l&#39;énucléation de cytométrie de flux après coloration avec anti-Ter119 et Syto-16 tous les jours et procéder aux taches échantillons pour Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux (tel que décrit dans la section 3). Remarque:. Avant de placage et le jour 2, 4, 6, et 7 de la culture, de surveiller les cellules en culture pour l&#39;enrichissement des érythroblastes et la différenciation avec la cytométrie de flux par l&#39;évaluation des marqueurs de surface CD44 et Ter119 vs taille (FSC) 9 Sinon CD71, Ter119, et FSC peut également être utilisé 10, 11. </li></ol></li></ol> 2. Rapide énucléation dosage, selon le protocole décrit par Yoshida et al. 12 avec modifications (figure 1B) <ol><li> Stress érythropoïèse induction et le stroma préparation cellulaire pour la culture de l&#39;érythropoïèse in vitro <ol><li> Anesthésier un vieux 2-6 mois type sauvage C57/BL6 la souris selon les lignes directrices du IACUC (par exemple avec une solution de l&#39;isoflurane). Assurez-vous que la souris a été correctement anesthésié par la vérification de l&#39;absence de réponses réflexes à une douce biche patte pincement et pourrespirations régulières au cours de la procédure. Utilisez vétérinaire pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse tandis que sous anesthésie. </li><li> Induire un stress érythropoïèse par la queue saignement à un volume final de 500 pl. En utilisant une seringue à insuline, injecter un volume égal de solution saline normale par voie intrapéritonéale d&#39;assurer la réanimation liquidienne de l&#39;animal (tenir animal en position déclive avant l&#39;injection et injecter dans le bas de l&#39;abdomen afin de ne pas endommager les organes internes). </li><li> Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu&#39;à ce qu&#39;il ait repris le contrôle du moteur, comme indiqué par l&#39;animal commence à se déplacer autour de la cage et être capable de se tenir debout et marcher sans tomber. La souris phlébotomisé est placé dans une cage sans autres souris. </li><li> Après 2 jours, la plaque MS-5 cellules dans les puits d&#39;une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Incuber MS-5 les cellules à 37 ° C / 5% de CO2 dans un milieu de cellules MS5 (a-MEM contenant 20% de FBS, 100 unités / ml de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) dans le but d&#39;être de 70 à 80 i% de confluencepuits n de la plaque après 48 h. </li></ol></li><li> Récolte de la rate et du traitement des splénocytes <ol><li> Quatre jours (96 h) après un stress érythropoïèse induction, euthanasier déjà saigné la souris via le protocole IACUC approuvé (par exemple inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale). </li><li> rate de récolte et le mettre dans un tube conique de 15 ml contenant IMDM 2% de FBS et garder sur la glace. </li><li> De retour au laboratoire, dans le tissu de la culture capot dans des conditions stériles, inverser le tube contenant la rate sur un tamis cellulaire de 40 um situé sur le haut d&#39;un tube de 50 ml. Écraser la rate en utilisant le piston d&#39;une seringue en plastique de 5 ml. </li><li> Laver avec tamis cellulaire IMDM 2% de FBS et en utilisant le même moyen, d&#39;ajuster le volume final de la suspension cellulaire à 5 ml. </li><li> Couche délicatement la suspension de splénocytes 5 ml sur 5 ml gradient de densité de séparation de cellules moyenne 1.083 g / ml dans un tube de 15 ml et centrifuger à 750 g pendant 25 min à température ambiante, sans accélération de frein / bas. </li><li> Transfertsurnageant (solution à environ la marque de 2 ml du tube de 15 ml afin d&#39;acquérir couche leuco-plaquettaire) dans un nouveau tube de 15 ml et effectuer un lavage avec IMDM plus 2% de FBS à 525 g pendant 5 min à température ambiante . </li><li> Aspirer le surnageant et lysent les cellules rouges du sang par mise en suspension du culot dans 3 ml de tampon de lyse RBC pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Ajouter 7 ml IMDM 2% de FBS à laver les cellules et à diluer et neutraliser le tampon de lyse RBC et de spin à 525 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant et suspendre les cellules sous forme de granulés dans 2 ml de milieu de croissance des érythroblastes (EGM). </li></ol></li><li> Culture des splénocytes isolés de faible densité, enrichis en érythroblastes, sur le plastique (première étape de culture in vitro rapide de l&#39;érythropoïèse) <ol><li> Compter les cellules sur un compteur de cellules automatisé ou manuellement par un hématimètre. Nombre habituel de cellules isolées par la rate à ce stade est d&#39;environ 15 x 10 6. </li><li> Suspendre d&#39;autres cellules dans EGM contenant les cytokines (à fconcentrations Inal): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml, et Epo 2 U / ml. </li><li> Plate 1-5 x 10 6 cellules dans un volume final de 1 ml / puits (même nombre de cellules par puits en fonction du nombre total de cellules) d&#39;une plaque de culture cellulaire à 24 puits et incuber O / N à 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Culture des érythroblastes sur les cellules MS5 (deuxième étape de culture in vitro rapide de l&#39;érythropoïèse <ol><li> Aspirer le surnageant du plastique bien et lever les cellules (hautement enrichi dans les érythroblastes) en ajoutant 2 ml de froid EDTA 10 mM dans du PBS pendant 5 min, sur la glace à chaque puits. </li><li> Mettez cellules dans des tubes frais, laver une fois dans EGM (sans cytokines) et remettre en suspension dans le même. </li><li> Planche 5 5 x 10 -1 x 10 6 cellules dans un volume de 2.1 ml à chaque MS5 puits d&#39;une plaque à 24 puits revêtue de cellule. Si inhibiteurs pharmacologiques sont utilisés dans l&#39;expérience, les ajouter à des concentrations appropriées maintenant. </li><li> Incuber pendant 6 à 8 heures (heure guidée parl&#39;observation microscopique de l&#39;ordre de 30% à 40% dans l&#39;échantillon énucléation WT non traité). La liaison des érythroblastes de MS-5 cellules accélère leur énucléation. </li><li> Soulever les cellules de chaque puits en ajoutant 2 ml de PBS froid mM d&#39;EDTA + 10, pendant 5 min, sur de la glace. Avec les érythroblastes, MS-5 cellules seront également collectées mais ceux-ci peuvent ensuite être facilement exclus lors de l&#39;analyse par cytométrie de flux comme FSC salut Ter119 - cellules. </li><li> A ce stade, les cellules peuvent être fixées et colorées pour l&#39;analyse par Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux. </li></ol></li></ol> 3. Coloration des érythroblastes pour la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques Pendant énucléation par imagerie multispectrale cytométrie en flux <ol><li> Laver les cellules dans du PBS, tourner 525 g pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. </li><li> Fixer les cellules en remettant en suspension les culots cellulaires dans 500 ul de 3,7% de formaldehyde dans du PBS pendant 15 min (temps de fixation variable en fonction de la lutte contregen sondée) et un léger pipetage. </li><li> Transférer dans des tubes à centrifuger en plastique de 1,5 ml et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Spin 2000 xg sur un banc à centrifuger pendant 20 s, aspirer le surnageant et effectuer un lavage par addition de 500 ul de PBS à chaque tube et pipetage doucement. </li><li> Spin sur un 2000 xg banc à centrifuger pendant 20 sec, aspirer le surnageant et conserver les tubes sur de la glace pendant au moins 15 min. Permeablization étapes 3.6-3.9 devrait être fait rapidement et efficacement, et en suivant la filature / aspiration à la température ambiante, les culots cellulaires devrait immédiatement être remis sur la glace, pour les cellules à mieux conserver leur intégrité. </li><li> Prenez des solutions d&#39;acétone à partir de -20 ° C congélateur et de mettre sur la glace. Perméabiliser les cellules en remettant en suspension les culots cellulaires dans 500 ul d&#39;abord 50% d&#39;acétone refroidie à la glace (1:1 avec dH 2 O) et de pipetage doucement. </li><li> Spin sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et remettre en suspension cellulaires de pastilles dans 500 ul60; glacée 100% d&#39;acétone par pipetage. </li><li> Spin sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et remettre en suspension cellulaires de granulés une fois de plus dans 500 ul glacée 50% d&#39;acétone par pipetage. </li><li> Spin sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et laver les cellules une fois dans un tampon froid FACS (PBS + 0,5% de BSA) par un léger pipetage. </li><li> Préparer l&#39;étiquetage cocktail avec des anticorps ou des marqueurs pour les molécules d&#39;intérêt: 0,1 U/100 ul AF488-phalloidin pour la coloration F-actine et 1 μl/100 ul Ter119-PECy7 pour la coloration des cellules érythroïdes. Coloration de remplacement ou complémentaire peut également être effectuée en utilisant AF-488-anti-β-tubuline anticorps (1:50), AF-594 conjugué à la sous-unité B de la toxine cholérique à étiqueter les radeaux lipidiques (1:200), anti-pMRLC (SER19) l&#39;anticorps primaire de la chaîne de la myosine phosphorylée de la lumière de régulation (01:50), suivie d&#39;anti-lapin de AF-488 conjugué anticorps secondaire (1:400) et anti-γ-tubulin anticorps primaire de lapin (1:100) suivi par un anticorps anti-lapin secondaire AF-555-conjugué (1:300). </li><li> Suite à l&#39;aspiration le surnageant, remettre en suspension les culots de cellules dans 100 ul de cocktail le marqueur, une pipette doucement et incuber pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Préparer tampon FACS contenant 2,5 M de la tache DRAQ5 nucléaire. </li><li> Laver les cellules dans un tampon FACS, spin-down sur le banc microcentrifuge 2000 g pendant 20 sec, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 60 pl de tampon FACS contenant DRAQ5. </li><li> Échantillons s&#39;exécutent sur ​​le cytomètre de flux imagerie de recueillir au moins 10.000 événements par expérience, compenser les fichiers de données brutes comme précédemment publié le 13, et analyser les résultats comme le montre la figure 2, en utilisant le logiciel d&#39;analyse spécifique à l&#39;imagerie cytomètre de flux. </li></ol>

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Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Au cours des dernières années, l&#39;étude de l&#39;énucléation érythroblastes a gagné en dynamique, car il est l&#39;étape dans des cultures in vitro en l&#39;érythropoïèse qui est le plus difficile à reproduire de manière efficace afin de réaliser avec succès, la production à grande échelle de cellules rouges du sang ex vivo. Jusqu&#39;à récemment, l&#39;étude de l&#39;énucléation des érythroblastes utilisé la microscopie par fluorescence et principalement la cytométrie en fl...

Différenciation terminale à l&#39;intérieur de la lignée érythroïde chez les mammifères se termine par le procédé de l&#39;énucléation dramatique, à travers laquelle le érythroblastes orthochromatic expulse son noyau enveloppé d&#39;une membrane (pyrenocyte) 1, 2, générant une réticulocytes. Le mécanisme exact de ce procédé, qui est également l&#39;étape limitant le taux de succès, à grande échelle, la production de globules rouges du sang in vitro, n&#39;est pas encore complètement élucidé. La localisation des protéines et des structures clés au sein d&#39;énucléation d&#39;érythroblastes repose sur l&#39;utilisation de la fluorescence et microscopie électronique 5.3. Ce processus fastidieux se traduit généralement par l&#39;identification d&#39;un nombre limité d&#39;événements énucléation et ne permet pas toujours une analyse statistique significative. Étendre sur une méthode d&#39;identification des érythroblastes décrit précédemment par McGrath et al. 6, nous avons développé une nouvelle approche de l&#39;identification et l&#39;étude des événements énucléation par Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux (multiparamétrique imagerie cellulaire à haut débit de l&#39;écoulement, une méthode qui combine la microscopie à fluorescence avec la cytométrie de flux) 7, qui peut fournir un nombre suffisant d&#39;observations pour obtenir des mesures et effectuer des analyses statistiques. Ici, nous décrivons deux premières méthodes de culture in vitro de l&#39;érythropoïèse dans utilisés pour synchroniser les érythroblastes et augmenter la probabilité de capture d&#39;énucléation au moment de l&#39;évaluation. Ensuite, nous décrivons en détail la coloration des érythroblastes après fixation et perméabilisation afin d&#39;étudier la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques pendant énucléation par cytométrie de flux d&#39;imagerie multi-spectrale. Les échantillons sont analysés sur un flux d&#39;imagerie cytomètre et les cellules recueillies sont déclenchés de manière appropriée pour identifier les érythroblastes orthochromatiques 6. Érythroblastes orthochromatiques sont ensuite analysés en fonction de leur rapport d&#39;aspect, tel que mesuré en fond clair imaging, par rapport à leur valeur pour le paramètre delta centroïde XY Ter119-ADN, qui est définie comme la distance entre les centres des zones tachées pour Ter119 et l&#39;ADN, respectivement. La population de cellules ayant un faible ratio d&#39;aspect et delta haut centre de gravité XY Ter119/DNA est fortement enrichie en cellules énucléation. Utilisation de type sauvage (WT) érythroblastes contre érythroblastes avec suppression Mx-Cre médiation conditionnelle de Rac1 sur Rac2 - / - ou combiné Rac2 - / -; RAC3 - / - fond génétique et ce protocole d&#39;analyse de roman de flux d&#39;imagerie multi-spectrale cytométrie, nous avons récemment démontré que l&#39;énucléation ressemble cytokinèse asymétrique et que la formation d&#39;un anneau de actomyosin réglementé en partie par GTPases Rac est important pour la progression de l&#39;énucléation 7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="934">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">&#945;MEM medium</td>
			<td style="width:199px;">CellGro&#160;</td>
			<td style="width:207px;">15-012-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">IMDM medium</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30228.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stempro-34 SFM</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10640</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Stempro-34 nutrient supplement</td>
			<td style="width:199px;">GIBCO (Life Tech)</td>
			<td style="width:207px;">10641-025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:207px;">512450</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">BIT9500</td>
			<td style="width:199px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:207px;">09500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP-1600-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30028.02</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SV30010</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:199px;">Hyclone (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:207px;">SH30590.01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:363px;">Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td style="width:199px;">Butler-Schein</td>
			<td style="width:207px;">029405</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Histopaque 1.083mg/ml</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">10831</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">BD Pharmlyse (RBC lysis buffer)</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:207px;">555899</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Acetone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;">534064</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:363px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP 531-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">H4001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:363px;">Stem Cell Factor (SCF)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">250-03</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Interleukin-3 (IL-3)</td>
			<td style="width:199px;">Peprotech</td>
			<td style="width:207px;">213-13</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:363px;">EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO)</td>
			<td style="width:199px;">AMGEN</td>
			<td style="width:207px;">available by pharmacy</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">CD44-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:363px;">CD71-FITC antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">553266</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">Ter119-PECy7 antibody</td>
			<td style="width:199px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:207px;">557853</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Phalloidin-AF488</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#946;-tubulin-AF488 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3623</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF488-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A11008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">anti-rabbit AF555-secondary antibody</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">A21428</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">AF594-cholera toxin B subunit</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">C34777</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">pMRLC (Ser19) antibody</td>
			<td style="width:199px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:207px;">#3671</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">&#947;-tubulin antibody</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">T-3559</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Syto16</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen (Life Technologies)</td>
			<td style="width:207px;">S7578</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Draq5</td>
			<td style="width:199px;">Biostatus</td>
			<td style="width:207px;">DR50200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferrous sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F7002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Ferric nitrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;">F3002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">EDTA</td>
			<td style="width:199px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;">BP120500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:363px;">15ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352099</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:363px;">50ml tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">6-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">353046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">24-well plates</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">351147</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:363px;">Flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">309602</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Insulin syringe</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">329461</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Syringe needle 25G5/8</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">305122</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Capped flow tubes</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;">352058</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:363px;">40&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:199px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:207px;">352340</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Scalpel (disposable)</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td style="width:207px;">2975#21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">FACS Canto Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:363px;">Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up.</td>
			<td style="width:199px;">AMNIS (EMD Millipore)</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:363px;">Hemavet 950 Cell Counter</td>
			<td style="width:199px;">Drew Scientific</td>
			<td>CDC-9950-002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">NAPCO series 8000WJ Incubator</td>
			<td style="width:199px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Allegra X-15R Centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman Coulter</td>
			<td>392932</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Mini Mouse Bench centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Denville</td>
			<td style="width:207px;">C0801</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of a murine erythroblast subpopulation  enriched in enucleating events by multi-spectral imaging flow cytometry

Érythropoïèse chez les mammifères conclut avec le processus dramatique de l&#39;énucléation qui aboutit à la formation de réticulocytes. Le mécanisme d&#39;énucléation n&#39;a pas encore été complètement élucidé. Un problème fréquemment rencontré lors de l&#39;étude de la localisation des protéines et des structures clés au sein énucléation des érythroblastes par microscopie est la difficulté d&#39;observer un nombre suffisant de cellules subissant une énucléation. Nous avons développé un nouveau protocole d&#39;analyse par imagerie multiparamétrique haut débit cellulaire en flux (Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux), une méthode qui combine la microscopie par immunofluorescence avec la cytométrie de flux, afin d&#39;identifier efficacement un nombre important d&#39;événements énucléation, qui permet de obtenir des mesures et effectuer des analyses statistiques. Nous décrivons d&#39;abord ici deux méthodes de culture in vitro de l&#39;érythropoïèse dans utilisés pour synchroniser les érythroblastes murins et augmenter la probabilité de capture d&#39;énucléation à etemps e de l&#39;évaluation. Ensuite, nous décrivons en détail la coloration des érythroblastes après fixation et perméabilisation afin d&#39;étudier la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques pendant énucléation par cytométrie de flux d&#39;imagerie multi-spectrale. Avec la taille et DNA/Ter119 coloration qui sont utilisés pour identifier les érythroblastes orthochromatiques, nous utilisons les paramètres &quot;aspect ratio&quot; d&#39;une cellule dans le canal champ lumineux qui aide à la reconnaissance des cellules allongées et &quot;delta barycentre XY Ter119/Draq5 &quot;qui permet l&#39;identification d&#39;événements cellulaires dans lequel le centre de Ter119 coloration (de réticulocytes naissante) est loin en dehors du centre de DRAQ5 coloration (noyau subissant extrusion), indiquant ainsi une cellule sur le enucleate. Le sous-ensemble de la population des érythroblastes orthochromatique avec centre de gravité du delta élevé et un faible rapport d&#39;aspect est fortement enrichie en cellules énucléation.

Tout d&#39;abord, les cellules sont analysées en fonction de leur Aspect Ratio Brightfield (le rapport de la longueur de leur mineure par rapport à leur axe principal) et son Espace Brightfield (indicatif de leur taille). Les événements avec une valeur Brightfield Région inférieur à 20 et supérieur à 200 sont pour la plupart des débris cellulaires et des agrégats, respectivement, et sont exclus de l&#39;analyse (figure 2A). Les cellules individuelles (porte &quot;R1&quot;) sont ensuite analys...

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Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Le présent protocole décrit un nouveau procédé d&#39;identification d&#39;une population d&#39;énucléation d&#39;érythroblastes orthochromatiques par écoulement d&#39;imagerie multi-spectrale cytométrie, fournissant une visualisation du processus d&#39;énucléation des érythroblastes.

Identification d&#39;une sous-population murine érythroblastes enrichi en énucléation événements par imagerie multispectrale cytométrie en flux

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K vues.  University of Cincinnati College of Medicine.  Le présent protocole décrit un nouveau procédé d'identification d'une population d'énucléation d'érythroblastes orthochromatiques par écoulement d'imagerie multi-spectrale cytométrie, fournissant une visualisation du processus d'énucléation des érythroblastes. 