Os autores desejam agradecer a George Farr e aos membros do laboratório de Horwich por discussões úteis. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Médico Howard Hughes.

Os procedimentos descritos aqui para anestesia, eutanásia e perfusão cardíaca de camundongos foram realizados sob um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yale.
1. Preparação de Instrumentos e Soluções sem RNase
<ol><li>RNase é um contaminante comum de todas as superfícies de laboratório, incluindo bancadas, micropipettos e o pesquisador.<ol>
<li>Troque as luvas com frequência ou limpeza regular com uma solução de descontaminação RNAse.</li>
		<li>As ferramentas de dissecção de aço inoxidável e os vidros podem ser disponibilizados sem RNase, aquecendo a > 200 °C por 1 hora ou mais. Nota: A esterilização a vapor não destrói o RNase. Alternativamente, limpe com uma solução de descontaminação RNase, depois com 70% de etanol sem RNase e ar seco.</li>
		<li>Limpe os topos de banco, outras superfícies de laboratório e micropipettores com solução de descontaminação RNase, depois com 70% de etanol sem RNase. Designar um banco de laboratório específico ou área de trabalho para recuperação e análise de RNA. Nota: Remova os ejetores de ponta antes de limpar os eixos dos pipettors e deixe-os desligados, se possível.</li>
		<li>Use tubos, tubos de microcentrifuuge, pipetas e dicas de micropipette que são certificados pelo seu fabricante para serem livres de RNase. Recomenda-se o uso de dicas de ligação muito baixas e microtubos. Se possível, use caixas ou sacos recém-abertos desses componentes e mantenha-os separados do suprimento geral do laboratório.</li>
		<li>Obtenha soluções livres de RNase [PBS livre de cálcio e magnésio (PBS) de Dulbecco de fontes comerciais. Use garrafas recém-abertas para cada experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A fonte do corante Azure B é fundamental para a recuperação bem sucedida do RNA intacto. Teste cada lote de corante antes de comprometer amostras preciosas para coloração e coleta. Colete alguns milhares de neurônios de um animal nãoperimental, prepare o RNA e determine a integridade do RNA conforme descrito abaixo para encontrar um que produza consistentemente números de RIN acima de 8,5.<ol>
<li>Dissolver o corante Azure B (1%, wt/vol) em 70% de etanol sem RNase, tipicamente 0,3 g em etanol de 30 ml em um tubo de centrífuga de 50 ml. Misture bem em um roqueiro no RT durante a noite ou até que todas as partículas tenham dissolvido. Um tubo desta solução pode ser usado para manchar vários slides sem afetar a intensidade de coloração.</li>
		<li>Como precaução, use um tubo diferente de mancha para cada réplica biológica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use os criomolds e O.C.T. para incorporar seções de cordão sem tratamento adicional.</li>
	<li>Mantenha o criostat em -20 a -24 °C. Após a secção, coloque os slides em um congelador de -80 °C até que um número suficiente tenha sido preparado. Inicie a preparação do RNA o mais rápido possível após os slides terem sido feitos. Para armazenamento a longo prazo, mantenha blocos OCT não ressutados ou parcialmente seccionados, em vez de slides, a 80 °C.</li>
	<li>Faça o tampão de tiocianato guanidine para a preparação de RNA a partir dos neurônios motores dissecados usando as soluções fornecidas pelo fabricante do kit de preparação de RNA de acordo com suas instruções.</li>
</ol>2. Preparação de seções de medula espinhal de camundongos (Figura 1A)
<ol><li>Limpe todas as ferramentas de dissecção, lâminas de vidro, lâminas de barbear e plataforma de dissecção, assando ou limpando com solução de descontaminação RNase, seguida de 70% de etanol sem RNase. Deixe secar por 2 minutos. Mantenha tudo livre de poeira cobrindo com lenços de laboratório.</li>
	<li>Os procedimentos de manejo animal, incluindo anestesia, perfusão cardíaca e eutanásia, devem ser realizados de acordo com as exigências do Comitê Descuidado e Uso institucional de Animais (IACUC), com o objetivo de levar o animal rapidamente ao ponto de dissecção da medula espinhal.<ol>
<li>Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal (ip) de uma dose letal de Cetamina (450 mg/kg).</li>
		<li>Uma vez que um nível profundo de anestesia é alcançado e confirmado pela falta de uma resposta de dedo do pé, posicione o lado ventral do mouse para cima em uma plataforma de dissecção (uma placa de isopor, por exemplo), abra a cavidade torácica para expor o coração, e insira a agulha borboleta de 27 G de uma infusão colocada no ventrículo esquerdo (que está à direita do investigador). Corte o átrio direito com um fórceps afiado, e perfunda com PBS a uma taxa de 5-7 ml/min por cerca de 2 min usando uma bomba peristáltica. O líquido que flui do átrio deve estar em grande parte livre de sangue neste momento.</li>
		<li>Remova a agulha de perfusão, decapite o rato e vire-o na placa de dissecção. Abra a pele para expor a coluna vertebral, use pequenas tesouras e fórceps para remover as vértebras, e levante a medula espinhal enquanto corta as raízes nervosas com um fórceps afiado. Velocidade e prática são essenciais na mudança do início da perfusão para a remoção do cabo; isso não deve levar mais de 7 minutos.</li>
		<li>Enxágüe o cabo por 10 segundos em água sem RNase para lavar qualquer sangue residual. Coloque a medula espinhal em um deslizamento de vidro sem RNase com um fórceps curvo muito suavemente, mas rapidamente. Divida a medula espinhal transversalmente usando uma lâmina de barbear limpa em 9-10 pedaços.</li>
		<li>Coloque as peças em uma criomolda cheia de O.C.T. usando os mesmos fórceps, e alinhe-as verticalmente usando uma agulha limpa. Coloque o molde em uma bandeja rasa contendo 2-metilbutano pré-cozido com nitrogênio líquido, e, em seguida, coloque a bandeja em um banho de nitrogênio líquido para congelar rapidamente as peças da medula espinhal para evitar a degradação do RNA.</li>
		<li>Armazene o bloco embutida em OCT a -80 °C por até 6 meses antes da secção. O processo de recuperação do cabo até o congelamento deve ser feito dentro de 5 minutos para manter a integridade do RNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cryosection o bloco embutido em O.C.T.a -20 °C com um criostat para produzir fatias de 20 μm, cada uma contendo seções transversais de 9-10 medular, em lâminas pen-membrana de 2 μm sem RNase mantidas inicialmente à temperatura ambiente para garantir que as seções aderam ao slide. Imediatamente recongele a seção em uma superfície de -20 °C dentro do criostat. Mantenha os slides a -80 °C até usar.</li>
</ol>3. Coloração de Seções da Medula Espinhal (Figura 1A)
<ol><li>Em um rack limpo, organize seis tubos cônicos de 50 ml. Encha todos eles com 25-30 ml de 70% de etanol 70% sem RNase, de modo que a profundidade seja suficiente para cobrir todas as seções em um slide quando o slide estiver imerso. Faça 30-35 ml de solução Azure B de 1% conforme descrito anteriormente e mantenha-o no mesmo rack para minimizar o tempo entre a mudança de soluções durante a lavagem ou a coloração. Mantenha três ou quatro lenços de laboratório na frente do rack para drenar a solução extra rapidamente.</li>
	<li>Leve os slides para fora do congelador -80 °C em gelo seco. Descongele um slide colocando-o em uma palma de luvas. Remova a maior parte da umidade e condensação no slide limpando-a com um lenço de laboratório, tomando cuidado para não tocar nas seções. Coloque o slide em gel de sílica fresco dessecante em uma placa de Petri por 30-40 seg para secar completamente. Se a umidade do laboratório for alta, um breve tratamento em um dessicator a vácuo pode ser usado para secar o slide mais rapidamente.</li>
	<li>Lavagem e coloração.<ol>
<li>Mergulhe o escorregador seco no primeiro tubo de 70% de etanol sem RNase. Mergulhe o slide por 30 segundos e, em seguida, lave o slide para remover o OCT mergulhando-o para cima e para baixo por 45-60 segundos . Tire o slide da solução e escorra o excesso de líquido nos lenços de laboratório. Repita o mesmo processo mergulhando o slide no segundo tubo de 70% de etanol. Se o OCT em torno das seções da medula espinhal não se foi completamente, repita a lavagem no terceiro tubo.</li>
		<li>Depois de drenar o excesso de líquido, submergir o slide em 1% solução Azure B em 70% de etanol livre de RNase por 30-45 segundos. Drenar o excesso de Azure B em um lenço de laboratório; neste ponto, todo o slide será azul.</li>
		<li>Submergir o slide no próximo tubo de 70% de etanol, e mergulhar para cima e para baixo rapidamente 3-4x para remover o excesso de corante e para tornar visível a coloração específica do neurônio motor. Se as seções parecerem muito escuras, repita o passo desopareçam em um tubo fresco de 70% de etanol. Se a coloração parecer muito leve, devolva o slide para a solução Azure B por mais 30 segundos e repita o destaining. Limpe o excesso de etanol e o ar seque o slide por ~40 segundos até que todo o líquido se vá. A matéria cinzenta será azul claro, enquanto os neurônios motores serão manchados de azul profundo, que é facilmente visível. Inicie a dissecação imediatamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microdisseção de captura a laser (LMD) (Figura 1B)
<ol><li>Ligue o microscópio e descarregue o suporte do tubo para fixar a tampa de um tubo de microfuça de 0,6 ml para coleta de amostras. Coloque 30 μl de tampão de tiocianato de guanidina na tampa de um tubo de microfuça de 0,6 ml. Cubra a superfície da tampa com líquido espalhando a solução usando uma ponta de pipeta. Dessa forma, todos os neurônios coletados serão dissolvidos em solução solubilizadora à medida que são dissecados. Alinhe a tampa com o orifício e o objetivo com o software de microscópio. Mantenha a tampa na posição coberta até iniciar a captura a laser.</li>
	<li>Coloque o slide seco de ar no palco do microscópio LMD de cabeça para baixo, de modo que a membrana do slide PEN fique virada para baixo. A membrana com seções deve enfrentar o orifício, por baixo do qual está o tubo de coleta.</li>
	<li>Ligue o laser 10 min antes de iniciar a preparação do slide. Concentre-se em uma seção de medula espinhal com o objetivo 5X. Mova-se para o objetivo 20X para dissecção.<ol>
<li>Marque uma região "manequim" com a caneta de luz e permita que o laser a corte sem recolhê-la. Isso relaxa a membrana PEN e torna possível marcar e cortar várias regiões sucessivamente.</li>
		<li>Refoce e identifique neurônios motores na região do chifre ventral. Esses neurônios são reconhecíveis por sua localização, sua morfologia piramiológica, seu grande tamanho, e sua mancha azul escura com Azure B(Figura 2).</li>
		<li>Usando a caneta de luz, selecione a ferramenta de desenho e marque ao longo da borda dos neurônios motores, fazendo um contorno completo. Tente fazer o contorno o mais próximo possível do neurônio motor para evitar contaminação de outras células além do neurônio motor. (Teste algumas seções com antecedência para ver o quão larga é a linha de corte a laser e ajuste a folga conforme necessário.) Marque várias células antes de cortar; o software se lembrará das posições.</li>
		<li>Coloque a tampa por baixo da posição de corte clicando na posição da tampa. Clique no botão iniciar para iniciar a dissecção do neurônio motor com o laser. Colete todos os neurônios motores de todas as seções em uma lâmina na tampa de um tubo de microfuça.</li>
		<li>Após a coleta ser concluída, retire o tubo de microfuça do suporte descarregando a bandeja e desalojando suavemente o tubo. Dissolva completamente os neurônios motores no buffer, encanar a solução para cima e para baixo. Mova a solução para o corpo do tubo centrifugando a 14.000 x g por 2 min a 4 °C. Congele a amostra imediatamente em gelo seco e armazene-a a -80 °C. Este processo, desde a coloração do slide até a coleta de neurônios motores, deve ser feito dentro de 30 minutos para um slide para minimizar a degradação do RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparação de RNA a partir de neurônios motores
Descongele todos os neurônios coletados de um animal e os unindo para extrair RNA. As amostras podem parecer pálidas, dependendo do número de neurônios motores (manchados com Azure B) neles. Extrair RNA utilizando um kit adequado de acordo com o protocolo previsto para tecido LMD, eluindo no volume mínimo possível. Leve 1 μl para verificar a quantidade e integridade da amostra. Congele rapidamente o RNA restante em gelo seco e armazene a -80 °C.
6. Determinação da Qualidade e Quantidade do RNA
Determine a qualidade do RNA com a amostra de 1 μl em um chip de microfluido de eletroforese capilar de acordo com o protocolo do fabricante. As preparações totais de RNA com um número de integridade de RNA (RIN) acima de 8,5 podem ser usadas para RNA-seq e qRT-PCR. A saída de dados também inclui normalmente a concentração aproximada da amostra.

<ol>
	<li>Zhu, J., Nie, S., Wu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+proteomic+profiling+of+frozen+pancreatic+CD24++adenocarcinoma+tissues+by+immuno-laser+capture+microdissection+and+nano-LC-MS/MS.">Target proteomic profiling of frozen pancreatic CD24+ adenocarcinoma tissues by immuno-laser capture microdissection and nano-LC-MS/MS.</a> J. Proteome. Res. , (2013).</li><li>Bandyopadhyay, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+profiling+of+spinal+cord+motor+neurons+from+a+presymptomatic+SOD1+ALS+mouse..">RNA-Seq profiling of spinal cord motor neurons from a presymptomatic SOD1 ALS mouse..</a> PLoS ONE. 8 (1), 10-1371 (2013).</li><li>Shea, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+in+situ+cytophotometric+estimation+of+absolute+amount+of+ribonucleic+acid+using+azure+B1.">A method for in situ cytophotometric estimation of absolute amount of ribonucleic acid using azure B1.</a> J. Histochem. Cytochem. 18 (2), 143-152 (1970).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clin. Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Schroeder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol. Biol. 7, (2006).</li><li>Doebler, J. A., Rhoads, R. E., Anthony, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+RNA+in+Pick's+and+Alzheimer's+diseases.+Comparison+of+disease-susceptible+and+disease-resistant+cortical+areas.">Neuronal RNA in Pick's and Alzheimer's diseases. Comparison of disease-susceptible and disease-resistant cortical areas.</a> Arch. Neurol. 46 (2), 134-137 (1989).</li><li>Lobsiger, C. S., Boill&#233;e, S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+from+different+SOD1+mutants+dysregulates+the+complement+system+and+the+neuronal+regenerative+response+in+ALS+motor+neurons.">Toxicity from different SOD1 mutants dysregulates the complement system and the neuronal regenerative response in ALS motor neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (18), (2007).</li><li>Ferraiuolo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+the+cellular+pathways+involved+in+the+adaptation+to+and+progression+of+motor+neuron+injury+in+the+SOD1+G93A+mouse+model+of+familial+ALS.">Microarray analysis of the cellular pathways involved in the adaptation to and progression of motor neuron injury in the SOD1 G93A mouse model of familial ALS.</a> J. Neurosci. 27 (34), 9201-9219 (2007).</li><li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+laser+microdissection+of+human+pancreatic+islets+from+surgical+specimens.">Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens.</a> J. Vis. Exp. 6 (71), (2013).</li><li>Burbach, G. J., Dehn, D., Nagel, B., Del Turco, D., Deller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microdissection+of+immunolabeled+astrocytes+allows+quantification+of+astrocytic+gene+expression.">Laser microdissection of immunolabeled astrocytes allows quantification of astrocytic gene expression.</a> J. Neurosci. Methods. 138 (1-2), 141-148 (2004).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+aggregation+despite+chaperone+associations+of+a+mutant+SOD1-YFP+in+transgenic+mice+that+develop+ALS.">Progressive aggregation despite chaperone associations of a mutant SOD1-YFP in transgenic mice that develop ALS.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (5), 1392-1397 (2009).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A medida mais significativa de sucesso deste protocolo para a produção de RNA total por microdisseção a laser de fatias de medula espinhal é o valor RIN5. Para amostras de RNA de eucariotes mais altos, valores acima de 8,5 regularmente produzem sequenciamento de alta qualidade e dados qRT-PCR. Se o rendimento for baixo, mas a qualidade for alta, repita a preparação. Se a integridade for menor (mesmo 7,5-8), no entanto, é melhor encontrar a fonte do problema e tentar novamente. Existem muitos passos onde algo pode dar errado, mas na verdade apenas duas fontes do problema - contaminação endógena rnase ou contaminação exógena RNase. O primeiro pode ser abordado pela prática, de modo que o tempo desde o sacrifício do mouse até o congelamento de seu cordão O.C.T-embedded seja minimizado. O outro ponto no protocolo onde o RNase endógeno pode contribuir para um resultado ruim é durante a preparação das fatias. Cada fatia deve aderir a um slide pen de temperatura ambiente rapidamente, mas ele vai derreter (o O.C.T fica claro). Quanto mais rápido a fatia puder ser refrozen, melhor. O criostat que usamos tem superfícies planas dentro da câmara que estão a -20 °C, que usamos para recongelar rapidamente a fatia. Encontre um ponto semelhante no criostat usado e certifique-se de que a fatia se torne opaca novamente rapidamente.
Rastrear fontes de RNase exógeno pode ser difícil, porque há tantas possibilidades. Os únicos reagentes usados que não são expressamente livres de RNase são O.C.T. e o Azure B. Se o Azure B já teve um desempenho satisfatório antes, experimente uma garrafa fresca de O.C.T., embora este reagente nunca tenha sido um problema. Reagentes sem RNase também podem ser substituídos, mesmo de um fornecedor diferente. Uma fonte muito mais provável é o investigador. Além de uma limpeza minuciosa da área de trabalho, muitas vezes é útil ter outro membro do laboratório acompanhando e observando todas as etapas do procedimento. Mesmo que seja alguém que não realiza rotineiramente esse procedimento, um novo conjunto de olhos pode pegar uma fonte de contaminação de outra forma despercebida.
Estender este protocolo para recuperar o RNA de outras células medulares, de células medulares de outras espécies, ou de tipos de células específicas em outros órgãos exigirá modificações em várias áreas destinadas a alcançar a identificação clara das células de interesse enquanto evitam, ou pelo menos minimizam, o impacto do RNase endógeno. No protocolo aqui, a rápida remoção e congelamento do cabo, juntamente com a coloração do Azure B em 70% de etanol, permitiu tanto a minimização da degradação do RNA quanto a fácil identificação dos corpos celulares do neurônio motor. O Azure B é uma mancha histoquímica bem estabelecida para neurônios que parece se ligar ao RNA3 e tem sido usada para avaliar o teor de RNA de neurônios em amostras de autópsia de tecido cerebral de pacientes com doença neurodegenerativa6. Notavelmente, a coloração do Azure B não afetou nem a integridade do RNA purificado nem sua capacidade de ser transcrita e analisada reversa. Outros corantes, como cresylvioleta 7 e azul toluidina8 têm sido usados em protocolos LMD semelhantes. A coleta dos corpos celulares diretamente na solução de tiocianato guanidine à medida que foram dissecadas proporcionou o passo final que resultou na recuperação rotineira do RNA intacto.
Abordagens semelhantes podem ser imaginadas para outras células e órgãos, reconhecendo que identificar as células de interesse ao mesmo tempo em que minimiza ou, preferencialmente, prevenir a degradação do RNA por RNases endógenas é o requisito crítico para uma análise bem sucedida. Em tecidos com altos níveis de RNase, como pâncreas, manuseio rápido e baixa temperatura foram combinados para permitir a recuperação do RNA de células β, aproveitando sua autofluorescência natural para visualização9. Procedimentos com a coloração de anticorpos para identificação também foram relatados10,mas não foram totalmente bem sucedidos em nossas mãos. Finalmente, muitos modelos de camundongos estão disponíveis que expressam proteínas de fusão fluorescente (ou seja, GFP, YFP, RFP) em células de interesse, que poderiam ser usadas para identificá-las em seções de tecido no microscópio LMD. De fato, as cepas de camundongos que analisamos com este protocolo expressam uma proteína de fusão entre SOD1 e YFP11, e seus neurônios motores da medula espinhal são altamente fluorescentes. Não conseguimos, no entanto, encontrar um conjunto de lavagens de etanol e/ou condições de desidratação que removeriam simultaneamente o O.C.T., inibiriam a atividade RNase e consistentemente manteriam fluorescência YFP suficiente para permitir a visualização dos neurônios motores e sua recuperação por LMD. Talvez uma nova proteína fluorescente ou uma variante das disponíveis que mantenha fluorescência em solventes orgânicos possam ser encontradas para superar essa limitação.

Em tecidos mamíferos compostos por vários tipos de células diferentes, o advento da instrumentação de microdissecção de captura a laser (LMD) proporcionou a possibilidade de selecionar um tipo celular específico para análise no nível de RNA ou proteína. Atualmente, as técnicas de amplificação e sequenciamento de próxima geração permitem o uso de um pool de RNA total de alguns milhares de células para obter um inventário relativamente minucioso do transcriptome, incluindo avaliação dos níveis relativos de RNAs e identificação de várias formas emendadas. Até o momento, as análises proteômicas de alguns milhares de células chegarão apenas a espécies mais abundantes. Por exemplo, identificamos <1.000 das proteínas mais abundantes de 3.000-4.000 corpos de células de neurônios motores (não mostrados), e Zhu e colegas de trabalho relataram recentemente identificar 2.665 proteínas de ~15.000 células tumorais1. Com mais desenvolvimentos da espectrometria de massa, no entanto, é provável que tais análises se estendam a uma profundidade muito maior.
Aqui, apresentamos um protocolo específico utilizado para LMD de corpos celulares neurônios motores da medula espinhal de camundongos, seguido pela preparação do RNA. Este protocolo foi utilizado no contexto da comparação de RNAs de neurônios motores de camundongos transgênicos pré-síndicos superóxido transgênicos (SOD)1 camundongos de esclerose lateral amiotrófica (ELA) com RNAs preparados a partir de uma cepa transgênica sod1 tipo selvagem tanto pela validação RNA-seq e qRT-PCR2. Notavelmente, os neurônios motores, no chifre anterior da matéria cinzenta na medula espinhal, compreendem <10% da população celular total, cercado por um mar de astrócitos, e como tal, seu perfil transcricional não pode ser facilmente desconvolucido de estudos de toda a cordão. Uma abordagem de captura a laser é, portanto, ideal para analisar a expressão de RNA nessas células, com a fisiologia preservada por excisão rápida e congelamento do cabo após breve perfusão salina intracardiac. O neurônio motor somata é grande e, portanto, é facilmente detectável, aqui usando um corante que tem forte afinidade pelos neurônios3. Além disso, com esse tamanho, essas células fornecem uma quantidade relativamente grande de RNA por célula capturada. O procedimento utilizado, conforme detalhado abaixo, poderia ser prontamente ajustado para obter outros tipos de células neuronais, bem como potencialmente outros tipos celulares, especificamente identificados por técnicas de coloração de corantes ou por coloração de anticorpos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Ketamine</td>
			<td style="width:195px;">Webster Veterinary</td>
			<td style="width:155px;">26637041101</td>
			<td style="width:339px;">Any source approved by the institutional veterinary service</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Dissection tools (scissors, forceps,&#160;etc.)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Any convenient source of high-quality dissection instruments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryostat&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>CM3050S</td>
			<td style="width:339px;">Other cryostats should be suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">LMD6000 B</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td></td>
			<td style="width:339px;">Other LMD systems have not been tested</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase-free PEN-membrane 2 &#956;m slides&#160;</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>11505189</td>
			<td style="width:339px;">Other slide types have been tested and do not perform well</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:268px;">RNeasy Micro kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74004</td>
			<td style="width:339px;">Any kit that uses guanidine thiocyanate lysis buffer and has been tested for recovering small quantities of RNA can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Agilent 2100 BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Azure B Certified&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190520</td>
			<td style="width:339px;">Critical! Product from any source has to be tested before use for its ability to maintain RNA integrity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">PBS</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>D8537</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source of RNase-free PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNA Ethanol 70% (made with DEPC treated water)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB04010-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Water, RNase-free, Endotoxin tested (treated with DEPC to eliminate RNase)</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB02128-00500</td>
			<td style="width:339px;">Any reliable source, can be lab-made</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">RNase AWAY</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>10328-011</td>
			<td style="width:339px;">Other similar RNase removal reagents, such as RNaseZAP (also from Invitrogen) can be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">2-Methylbutane&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78-78-4</td>
			<td style="width:339px;">Any source</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:268px;">Maxymum Recovery microfuge tubes (0.6 and 1.5 ml) and pipette tips&#160;</td>
			<td>Axygen&#160;</td>
			<td>311-03-051 &#38; 311-09-051</td>
			<td style="width:339px;">Ultra-low retention, RNase free tubes and tips; test other manufacturer&#39;s products before using</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">O.C.T. Compound</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4583</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Cryomold Intermediate Size</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:268px;">Lab wipes (Kimwipes)</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>34155</td>
			<td style="width:339px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of rna for transcriptomic analysis from mouse spinal cord motor neuron cell bodies by laser capture microdissection

A preparação do RNA de alta qualidade a partir de células de interesse é fundamental para análise precisa e significativa das diferenças transcricionais entre os tipos celulares ou entre o mesmo tipo celular em saúde e doença ou seguindo tratamentos farmacológicos. Na medula espinhal, tal preparação a partir de neurônios motores, alvo de interesse em muitas doenças neurológicas e neurodegenerativas, é complicada pelo fato de que os neurônios motores representam <10% da população celular total. A microdisseção de captura a laser (LMD) foi desenvolvida para resolver esse problema. Aqui, descrevemos um protocolo para recuperar rapidamente, congelar e seção da medula espinhal do rato para evitar danos ao RNA por RNases endógenos e exógenos, seguido de coloração com Azure B em 70% de etanol para identificar os neurônios motores, mantendo a RNase endógena inibida. LMD é então usado para capturar os neurônios manchados diretamente no tampão de lise de tiocianato guanidine, mantendo a integridade do RNA. Técnicas padrão são usadas para recuperar o RNA total e medir sua integridade. Este material pode então ser usado para análise a jusante das transcrições por RNA-seq e qRT-PCR.

O protocolo descrito acima e na Figura 1 deve produzir 50 ng ou mais de RNA total com um RIN de >8,5 de 3.000-4.000 corpos celulares de neurônio motor medular dissecados a partir das fatias de 9-10 20 μm em cerca de 20 slides PEN. Como este número de slides representa menos de 10% de um bloco embutido em O.C.T.de uma medula espinhal do rato, é possível retornar ao bloco, que foi armazenado a -80 °C, e cortar mais fatias para passar por outra rodada de preparação de RNA. Se forem necessárias quantidades maiores de RNA para uma análise, é melhor fazer apenas o número de slides (por exemplo, 20) de uma só vez que podem ser processados através de dissecção e preparação de RNA em poucos dias, em seguida, fazer mais slides para uma segunda rodada e combinar os produtos. Certifique-se de verificar o RIN de cada preparação primeiro para evitar combinar um bom com um ruim. Os métodos RNA-seq estão se tornando mais sensíveis e novas tecnologias pcr estão prometendo maior sensibilidade do que as atuais. Assim, menos RNA de menos corpos celulares neurônios será necessário, permitindo maior profundidade de sequenciamento e validação mais abrangente de hits interessantes. Por outro lado, a adesão total às recomendações do MIQE para análise evalidação de qRT-PCR pode exigir quantidades maiores para permitir as reações de controle necessárias para RNAs de baixa abundância.
A Figura 2 mostra uma série típica de imagens de uma porção de uma seção de chifre ventral da medula espinhal após a coloração e dissecção do Azure B. No painel A, os corpos celulares grandes e manchados são neurônios motores, confirmados pela mancha de anticorpos anti-Chat2, e são facilmente diferenciados das células vizinhas menores. O painel B mostra a mesma região com corpos celulares individuais delineados com a caneta leve e numerados pelo software de microscópio. Os contornos seguem de perto as margens dos corpos celulares, com uma pequena subsídio para a largura de corte do laser. Este espaçamento deve ser determinado para cada configuração de energia laser para minimizar a inclusão de material ínteo, evitando a perda de citosol do neurônio motor. Os painéis C e D mostram a seção após o corte do laser e os corpos celulares individuais caíram na tampa da coleção. Observe que a margem de corte não segue exatamente o contorno da caneta de luz no painel C, mas fica em grande parte fora dela. Essa irregularidade é aparente no painel D, assim como a área escurecida ao redor de cada corte, o que reflete os danos térmicos ao tecido causados pelo laser. Por causa disso, se dois corpos de células estão muito próximos um do outro, é melhor delineá-los para um único corte, em vez de tentar cortá-los separadamente e perder algum RNA para danificar o calor em sua região de quase contato.
A Figura 3 mostra resultados típicos de uma análise eletroforética da integridade do RNA de uma amostra de RNA preparada a partir de ~4.000 corpos celulares de neurônio motor do rato coletados por LMD. O painel superior é o eletroferograma produzido por 1 μl do RNA total; o inset à direita é uma imagem do gel. Em ambos, note os proeminentes picos de RNA ribossômicos. O painel inferior é o eletroferograma da pista contendo padrões de tamanho de RNA. O software de análise calculou um RIN de 9,8 para esta amostra, com concentração de 4,9 ng/μl. Um total de 13 μl desta solução estava disponível após a análise, fornecendo 64 ng de RNA para validação de qRT-PCR a jusante dos valores da transcrição. Para uma análise típica de qRT-PCR de transcrições moderadamente abundantes, 0,15-0,20 ng de RNA total é suficiente para produzir quantitação precisa2, de modo que a quantidade de RNA disponível a partir desta preparação é suficiente para validar uma série de transcrições com múltiplos conjuntos de primer, conforme recomendado4. É claro que quantidades maiores de RNA de entrada podem ser usadas para permitir a validação de transcrições raras. Esse valor também é mais do que suficiente para permitir a preparação da biblioteca e o RNA-seq de próxima geração.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig1.jpg"> Figura 1. Visão geral da produção de fatias da medula espinhal e microdisseção de captura a laser de corpos celulares de neurônios motores da medula espinhal. A) Principais etapas na produção e coloração de fatias. B) Visão de desenho animado da seção da medula espinhal e dissecção a laser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig2.jpg"> Figura 2. Imagens antes e depois de uma dissecção a laser de corpos celulares de neurônios motores manchados Azure B. A) Uma parte do chifre ventral de uma seção manchada. Note as quatro grandes células manchadas escuras. Há também algumas células levemente manchadas e um pouco menores, que não são neurônios motores (confirmados por manchas de anticorpos anti-Chat; não mostrados, mas ver Bandyopadhyay2) e que não serão selecionados para dissecção. As muitas pequenas manchas escuras são provavelmente processos neuronais (dendritos e axônios), mas isso não foi confirmado. B) Os quatro corpos celulares delineados com a caneta de luz. Observe que os contornos seguem de perto as margens das células, com uma distância mínima entre elas. Este espaçamento deve ser estabelecido empiricamente para cada microscópio e laser. O software números os neurônios individuais, o que simplifica manter o controle de quantos foram coletados. C e D) Após o corte do laser e as peças contendo os corpos celulares caíram na tampa da coleção. Note que o buraco deixado para trás é um pouco maior do que o contorno e é irregular. Isso reflete a largura do raio laser e sua eficiência de corte ligeiramente variável, dependendo da composição local do tecido. Também é aparente a borda do tecido escurecido ao redor de cada orifício devido aos danos de aquecimento locais causados pelo laser. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51168/51168fig3.jpg"> Figura 3. Análise eletroforética da integridade do RNA preparado a partir de amostras de LMD. A) Uma alíquota de 1 μl do RNA preparada a partir de ~4.000 corpos celulares de neurônios motores pelo protocolo acima foi analisada por eletroforese microcapilar em um chip de microfluidos. O eletroferograma é mostrado, com picos de RNA ribossômicos proeminentes. À direita está uma imagem do gel em si. B) Mostra-se o eletroferograma dos padrões de tamanho, com a faixa de gel correspondente à direita. O software de instrumento calculou um RIN de 9,8 para esta amostra e uma concentração de 4,9 ng/μl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51168/51168fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver imagem maior.</a>

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Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

O RNA total de alta qualidade foi preparado a partir de corpos celulares de neurônios motores da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser após a coloração de seções da medula espinhal com Azure B em 70% de etanol. RNA suficiente (~40-60 ng) é recuperado de 3.000-4.000 neurônios motores para permitir a análise de RNA a jusante por RNA-seq e qRT-PCR.

Produção de RNA para análise transcriômica de corpos celulares de neurônio motor da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser

Preparation of high-quality RNA from cells of interest is critical to precise and meaningful analysis of transcriptional differences among cell types or ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K visualizações.  Yale School of Medicine. O RNA total de alta qualidade foi preparado a partir de corpos celulares de neurônios motores da medula espinhal do rato por microdisseção de captura a laser após a coloração de seções da medula espinhal com Azure B em 70% de etanol. RNA suficiente (~40-60 ng) é recuperado de 3.000-4.000 neurônios motores para permitir a análise de RNA a jusante por RNA-seq e qRT-PCR.

Vídeo: Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissecção Captura de Drosophila Neurônios periféricos

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Neurociência

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Microdissecção Captura de Populações enriquecida de neurônios ou neurônios individuais para análise de expressão gênica após a lesão cerebral traumática

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor (EGF) and fibroblast growth factor (FGF) to provide an abundant supply of cells. NPCs were differentiated in the presence of a new combination of nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) and retinoic acid on dishes coated with poly-L-lysine and mouse laminin to obtain neuron-rich cultures. NPCs were also differentiated in the absence of neurotrophins, DBC and retinoic acid and in the presence of ciliary neurotrophic factor (CNTF) to yield astrocyte-rich cultures. Differentiated NPCs were characterized by immunofluorescence staining for a panel of neuronal markers including NeuN, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin and GAP43. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) and STAT3, astrocyte markers, were detected in 10-15% of differentiated NPCs. To facilitate cell-type specific molecular characterization, laser capture microdissection was performed to isolate neurons cultured on polyethylene naphthalate (PEN) membrane slides. The methods described in this study provide valuable tools to advance our understanding of the molecular mechanism of neurodegeneration.

Human neuroprogenitor cells (NPCs) were expanded under proliferating conditions. NPCs were differentiated into neuron-rich cultures in the presence of a combination of neurotrophins. Neuronal markers were detected by immunofluorescence staining. To isolate a pure population of neurons, NPCs were differentiated on PEN membrane slides and laser capture microdissection was performed.

Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura

Neuroprogenitor cells (NPCs) isolated from the human fetal brain were expanded under proliferative conditions in the presence of epidermal growth factor ...

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Estereotáxica guiada por Atlas Laser Microdissection de captura de regiões do cérebro afetadas por lesão traumática

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). We have identified five steps in the workflow that are crucial for obtaining RNA isolates from enteric ganglia with sufficiently high quality and quantity for RNA-seq. First, when preparing intestinal tissue, each sample must have all excess liquid removed by blotting prior to flattening the serosa as much as possible across the bottom of large base molds. Samples are then quickly frozen atop a slurry of dry ice and 2-methylbutane. Second, when sectioning the tissue, it is important to position cryomolds so that intestinal sections parallel the full plane of the myenteric plexus, thereby yielding the greatest surface area of enteric ganglia per slide. Third, during LCM, polyethylene napthalate (PEN)-membrane slides offer the greatest speed and flexibility in outlining the non-uniform shapes of enteric ganglia when collecting enteric ganglia. Fourth, for distinct visualization of enteric ganglia within sections, ethanol-compatible dyes, like Cresyl Violet, offer excellent preservation of RNA integrity relative to aqueous dyes. Finally, for the extraction of RNA from captured ganglia, we observed differences between commercial RNA extraction kits that yielded superior RNA quantity and quality, while eliminating DNA contamination. Optimization of these factors in the current protocol greatly accelerates the workflow and yields enteric ganglia samples with exceptional RNA quality and quantity.

The goal of this protocol is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia isolated from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue using laser capture microdissection (LCM). This protocol involves preparing flash-frozen samples of human intestinal tissue, cryosectioning, ethanolic staining and dehydration, LCM, and RNA extraction.

Otimização de captura Laser Microdissection para o isolamento dos gânglios entéricos de tecido humano fresco congelado

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Compreendendo as respostas do neurônio motor à estimulação da medula espinhal

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

Autor em destaque: Avançando a estimulação da medula espinhal - explorando as respostas celulares dos neurônios motores por meio da eletrofisiologia do patch-clamp 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

A Preparação Ex Vivo do Corte da Medula Espinhal para o Registro de Patch-Clamp de Células Inteiras em Neurônios Motores Durante a Estimulação da Medula Espinhal

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...